FCRL5蛋白對肝癌細胞增殖與侵襲遷移能力的作用及機制

孫建海 馬燕凌 魏武杰 晏菲 方紅艷 瞿姣

(江漢大學(xué)附屬湖北省第三人民醫(yī)院腫瘤科，湖北 武漢 430033)

肝癌是源于肝細胞和肝內(nèi)膽管上皮細胞的惡性腫瘤〔1〕，是全球最常見的惡性腫瘤，在我國排名惡性腫瘤第二，僅次于肺癌〔2,3〕。我國每年新增約40萬肝癌患者，略高于發(fā)達國家(1%～2%)，其中女性年發(fā)病率為6.5%，男性年發(fā)病率為7.9%〔4,5〕。Fc受體樣5(FCRL5)基因含有長的高度酸性C末端尾，以非序列特異性方式介導(dǎo)DNA結(jié)合，調(diào)控結(jié)腸癌、胃癌、肺癌和肝癌等多種人類癌癥的進展，與癌細胞存活、自噬、侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)〔6,7〕。FCRL5可通過激活蛋白激酶 B信號通路誘導(dǎo)腫瘤內(nèi)皮細胞增殖和集落形成〔8〕。基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-9、cyclinD1、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)是參與腫瘤增殖的重要細胞因子，MMP-9、VEGF與腫瘤的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，G1/S-特異性周期蛋白(cyclin)D1是調(diào)節(jié)腫瘤細胞周期的重要因子〔9〕。目前尚無關(guān)于FCRL5與肝癌細胞增殖與侵襲遷移機制的相關(guān)研究。因此本研究擬探討FCRL5蛋白對肝癌細胞增殖與侵襲遷移能力的作用及機制，為肝癌的臨床治療提供理論和實踐依據(jù)。

1 資料與方法

1.1臨床資料 選取江漢大學(xué)附屬湖北省第三人民醫(yī)院肝膽外科2010～2013年確診的年齡≥60歲的肝細胞癌患者104例作為研究對象，患者均符合原發(fā)性肝癌診療規(guī)范(2011年版)中診斷標準〔10〕，患者自愿提供肝癌及癌旁組織標本用作分析。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理協(xié)會批準，并獲取患者及家屬知情同意書。收集每例患者的癌組織及癌旁組織(距離癌灶5 m以上)標本。

1.2肝癌組織及癌旁正常組織FCRL5表達水平測定 肝癌組織取腫瘤病灶邊緣約2 cm處，癌旁正常組織為距離癌灶5 m以上。取0.2 g肝癌組織及癌旁正常組織，制成肝癌組織及癌旁組織勻漿后，酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測FCRL5表達量。

Western印跡檢測FCRL5表達量：用含有PMSF的裂解緩沖液(Beyotime)裂解肝癌組織及癌旁正常組織。將裂解物在15 000 r/min，4℃下離心10 min，收集上清液并保存在-80℃下以備后用。使用二喹啉甲酸(BCA)蛋白質(zhì)測定試劑盒(Beyotime)測定蛋白質(zhì)濃度。對蛋白質(zhì)進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，并根據(jù)制造商的方案(Bio-Rad，Richmond，CA，USA)使用轉(zhuǎn)移裝置轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜(Millipore)。用含有0.1%Tween-20的TBST緩沖液(10 mmol/L Tris-HCl，pH8.0和150 mmol/L NaCl)中的脫脂奶粉封閉膜，在相同緩沖液中洗滌并用以下抗體探測：抗-FCRL5(Abcam)和抗β-肌動蛋白抗體(Cell Signaling Technology)在4℃過夜。然后將膜在TBST緩沖液中洗滌并與各自的第二抗體一起溫育。使用Odyssey紅外成像系統(tǒng)(Li-Cor Bioscience)獲得紅外熒光圖像，進行半定量比較分析。

免疫組化方法測定FCRL5的表達水平，進行標準抗生物素蛋白-生物素復(fù)合物過氧化物酶免疫組織化學(xué)染色。在二甲苯和梯度醇脫蠟后，通過水浴釜加熱30 min，在檸檬酸鹽緩沖液(10 mmol/L pH6.0)中進行加熱的抗原修復(fù)。內(nèi)源性過氧化物酶在0.3%過氧化氫中封閉10 min。通過在10%正常動物血清中孵育10 min來阻斷非特異性結(jié)合。將切片在4℃下與一抗孵育24 h，所述一抗為抗FCRL5的多克隆抗體(HPA021030，Sigma-Aldrich)。將生物素化的第二抗體(IgG)和辣根過氧化物酶標記的抗生物素蛋白與樣品一起溫育。使用二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色。

1.3細胞來源、儀器與試劑 SMMC-7721肝癌細胞株(中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏中心昆明細胞庫)、FCRL5-模擬物(mimics)、FCRL5抑制劑(inhibitor)(上海伯豪生物技術(shù)有限公司)、Trizol試劑(美國Invitrogen公司)、FCRL5轉(zhuǎn)錄子第一鏈cDNA合成試劑盒(美國Thermo公司)、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及實時熒光定量PCR試劑盒(碧云天生物技術(shù)公司產(chǎn)品)、實時熒光定量PCR儀(美國熱電公司)、NanoDrop2000c 型蛋白核酸檢測儀(美國Thermo公司)、BD BiocoatTMMatrigelTM基質(zhì)(上海偉進生物科技有限公司)、聚碳酸脂微孔濾膜(上海正晃商貿(mào)有限公司)、FCRL5、MMP-9、cyclinD1、VEGF蛋白ELISA試劑盒(上海伯豪生物技術(shù)有限公司)、MK3酶標儀(美國 Thermo公司)。

1.4分組設(shè)計及轉(zhuǎn)染 分組設(shè)計：對照組：取10 ml人肝癌SMMC-7721細胞液(細胞濃度為5×106/ml)于10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，置于CO2培養(yǎng)箱(37℃、5% CO2、20% O2)；FCRL5轉(zhuǎn)染組、FCRL15 inhibitor組：分別取10 ml轉(zhuǎn)染FCRL5-mimics、FCRL5 inhibitor的人肝癌HCCLM3細胞液(細胞濃度為5×106/ml)于10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，置于CO2培養(yǎng)箱(37℃、5% CO2、2% O2、93%N2)。以上各組每孔設(shè)6個平行樣，培養(yǎng)120 h。

人肝癌SMMC-7721細胞株FCRL5-mimicss、FCRL5 inhibitor:轉(zhuǎn)染：取11 ml人肝癌SMMC-7721細胞液(細胞濃度為5×106/ml)接種于6孔板，取 100 pmol的FCRL5-mimics、FCRL5 inhibitor于200 μl DMEM培養(yǎng)基中，取4 μl lipofectamine2000于200 μl DMEM培養(yǎng)基中，混勻lipofectamine2000和miRNA液，室溫培育30 min,無菌磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細胞，將混合液加入細胞孔內(nèi)，6 h 后棄混合液，加入胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，流式細胞儀檢測在轉(zhuǎn)染后48 h，測試了不同組中熒光素酶的相對活性，監(jiān)測其轉(zhuǎn)染效情況。

1.5人肝癌SMMC-7721細胞株細胞活力、癌細胞單克隆形成數(shù)目、細胞凋亡檢測 分別于24 h、72 h、120 h，每孔加入MTT溶液(5 mg/ml)10 μl，37℃恒溫箱孵育4 h，加入150 μl的二甲基亞砜(DMSO)，采用酶標儀于490 nm處波長測定吸光度(A)值。轉(zhuǎn)染24 h后，將細胞用胰蛋白酶處理，計數(shù)，并在密度為1 000個細胞/孔的6孔板中用完全培養(yǎng)基重新接種8 d。每3 d更換培養(yǎng)基以維持細胞生長。將菌落固定并用0.5%結(jié)晶紫(Sigma，St Louis，MO，USA)在室溫下染色30 min。培養(yǎng)8 d后，在倒置顯微鏡下計數(shù)菌落數(shù)。流式細胞術(shù)Annexin V-異硫氰酸熒光素(FITC)結(jié)合測定(R&D，Minneapolis，MN，USA，Cat No TA4638)用于測定轉(zhuǎn)染后SMMC-7721細胞中的細胞凋亡。

1.6人肝癌SMMC-7721細胞株FCRL5 mRNA水平測定 人肝癌SMMC-7721細胞培養(yǎng)結(jié)束后。取5 ml細胞液，測定FCRL5 mRNA 濃度，用miRNeasy Mini Kit(Qiagen，Hilden，Germany)從培養(yǎng)的SMCC-7721細胞中提取和分離總RNA。用iScripTMcDNA合成試劑盒(Bio-Rad)合成DNA。為了評估FCRL5水平，在CFX96TM實時PCR檢測系統(tǒng)(Bio-Rad Laboratories，Inc)中用SYBR Premix Ex TaqTM(Takara Bio，Inc.，Otsu，Japan)擴增cDNA。條件如下：在95℃(5 min)變性，然后在95℃(10 s)變性40個循環(huán)，在60℃(30 s)退火/延伸。通過2-ΔΔCt方法計算FCRL5的相對含量。U6用作內(nèi)部對照。引物如下：FCRL5：正向：GTGCAAGTG TAGATGCCGACAA，反向：GTGCAAGTGTAGATGCCGACAA;U6：正向：CTCGCTTCGGCAGCACA，反向：AACGCTTCACGAA-TTTGCGT。

1.7細胞侵襲遷移實驗 轉(zhuǎn)染24 h后，將無血清培養(yǎng)基中的細胞接種到Transwell裝置(BD Biosciences)的上室中。用于Matrigel(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，USA)的侵襲測定。下室充滿含有10%FBS的培養(yǎng)基。在37℃，5%CO2中培養(yǎng)24 h后，通過膜侵入的細胞用4%多聚甲醛固定，并用0.1%結(jié)晶紫染色(Sigma-Aldrich公司)。拍攝下表面上的細胞(Olympus；IX73)，并使用共聚焦激光掃描顯微鏡(Olympus FV1000)計數(shù)3個隨機視野。進行了6次獨立實驗。

傷口愈合測定用于檢測細胞遷移能力。在轉(zhuǎn)染FCRL5-mimics、FCRL5 inhibitor后24 h，將HepG2細胞以每孔8×105個細胞接種到6孔板中。達到90%匯合后，用20 μl移液管刮擦每個孔的表面。用PBS洗滌孔3次后，在37℃下進一步培養(yǎng)24 h，然后捕獲圖像。

1.8人肝癌SMMC-7721細胞株FCRL5、MMP-9、cyclinD1、VEGF蛋白水平測定 染毒結(jié)束后，5 000 r/min 離心收集各組細胞，制成細胞懸液后，ELISA法測定培養(yǎng)液中FCRL5、MMP-9、cyclinD1、VEGF蛋白水平。

1.9統(tǒng)計分析 采用SPSS19.0軟件進行單因素方差分析、t檢驗、LSD-t檢驗、χ2檢驗。

2 結(jié) 果

2.1癌旁組織、肝癌組織中FCRL5蛋白水平及半定量水平的表達 肝癌組織FCRL5蛋白表達水平高于癌旁組織(P<0.001)。肝癌組織FCRL5蛋白半定量水平高于癌旁組織(P<0.001)。見表1，圖1。

表1 肝癌組織與癌旁組織中FCRL5 蛋白的表達

1、3、5、7分別為4例癌旁組織2、4、6、8分別為4例肝癌組織圖1 FCRL5蛋白Western印跡結(jié)果

2.2癌旁組織、肝癌組織中FCRL5蛋白表達 肝癌組織中FCRL5蛋白位于胞質(zhì)，呈黃褐色；肝癌組織FCRL5蛋白陽性率高于癌旁組織〔82例(78.85%)vs 9例(8.65%)；χ2=104.107，P=0.000〕。見圖2。

圖2 FCRL5蛋白在癌旁組織、肝癌組中的表達(DAB，×200)

2.3各組SMMC-7721肝癌細胞存活率比較 FCRL5轉(zhuǎn)染組24 h、72 h、96 h、120 h存活率高于對照組(P<0.001)。FCRL5 inhibitor 組24 h、72 h、96 h、120 h存活率低于對照組和FCRL5轉(zhuǎn)染組(P<0.001)。見表2。

表2 各組培養(yǎng)不同時間SMMC-7721肝癌細胞存活率比較

2.4各組SMMC-7721肝癌細胞單克隆形成數(shù)目比較 FCRL5轉(zhuǎn)染組的單克隆形成數(shù)目顯著高于對照組(P<0.001);FCRL5 inhibitor組單克隆形成數(shù)目顯著低于對照組和FCRL5轉(zhuǎn)染組(P<0.001)。見表3、圖3。

表3 各組SMMC-7721肝癌細胞單克隆形成數(shù)目、 凋亡率比較

圖3 各組 SMMC-7721 細胞單克隆形成數(shù)目(結(jié)晶紫染色，×200)

2.5各組SMMC-7721肝癌細胞凋亡率的比較 FCRL5轉(zhuǎn)染組凋亡率顯著低于對照組(t=14.036，P<0.001)；FCRL5 inhibitor 組凋亡率顯著高于對照組和FCRL5轉(zhuǎn)染組(P<0.001)。見表3、圖4。

圖4 各組 SMMC-7721 細胞凋亡率的表達

2.6各組SMMC-7721肝癌細胞FCRL mRNA、FCRL蛋白表達情況比較 FCRL5轉(zhuǎn)染組FCRL mRNA、FCRL蛋白表達顯著高于對照組(P<0.001)。FCRL5 inhibitor組FCRL5 mRNA、FCRL5蛋白表達水平顯著低于對照組和FCRL5轉(zhuǎn)染組(P<0.001)。見表4。

表4 各組SMMC-7721肝癌細胞增FCRL5 mRNA、 FCRL5 蛋白表達情況比較

2.7各組SMMC-7721肝癌細胞侵襲能力比較 FCRL5轉(zhuǎn)染組侵襲距離顯著長于對照組(P<0.001)。FCRL5 inhibitor 組侵襲距離顯著短于對照組和FCRL5轉(zhuǎn)染組(P<0.001)。見表5和圖5。

表5 各組SMMC-7721肝癌細胞侵襲遷移能力、穿膜數(shù)及MMP-9、cyclinD1、VEGF表達比較

圖5 各組 SMMC-7721 細胞傷口愈合分析實驗(結(jié)晶紫染色，×200)

2.8各組SMMC-7721肝癌細胞穿膜數(shù)比較 FCRL5轉(zhuǎn)染組的穿膜數(shù)顯著高于對照組(P<0.001)。FCRL5 inhibitor 組穿膜數(shù)顯著低于對照組和FCRL5轉(zhuǎn)染組(P<0.001)。見表5、圖6。

圖6 各組 SMMC-7721 細胞Transwell 遷移實驗(結(jié)晶紫染色，×200)

2.9各組SMMC-7721肝癌細胞MMP-9、cyclinD1、VEGF表達比較 FCRL5轉(zhuǎn)染組MMP-9、cyclinD1、VEGF表達顯著高于對照組(P<0.001)。FCRL5 inhibitor組MMP-9、cyclinD1、VEGF表達顯著低于對照組和FCRL5轉(zhuǎn)染組(P<0.001)。見表5。

3 討 論

FCRL5在進化中高度保守，由215個氨基酸組成，重約30 kDa，是一種多功能因子，涉及多種生物多樣性過程，包括轉(zhuǎn)錄、DNA修復(fù)、分化、發(fā)育和細胞外信號〔11〕。FCRL5與DNA的小溝結(jié)合并促進在染色質(zhì)內(nèi)的同源結(jié)合位點裝配位點特異性DNA結(jié)合蛋白(p53)。FCRL5可促成細胞遷移和腫瘤侵襲。FCRL5過表達已在許多類型的癌癥中被描述，包括乳腺癌、結(jié)腸癌、前列腺癌、肝癌、肺癌、胃癌。與正常胃組織相比，觀察到FCRL5在胃癌組織中大量表達和血清FCRL5水平與浸潤深度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)，這表明FCRL51在胃癌中具有重要作用〔12〕。此外Hedgehog信號通路也能激活FCRL5 基因，配體(Shh)未與跨膜蛋白受體(Ptch)結(jié)合時，解除了 Ptch 對 Smo 的抑制作用，進而活化下游轉(zhuǎn)錄因子FCRL5，激活下游原癌基因〔13,14〕。本研究結(jié)果顯示，肝癌組FCRL5蛋白水平表達水平高于癌旁組，肝癌組FCRL5蛋白陽性率高于癌旁組，這與上述討論相符合。

體外細胞試驗顯示FCRL沉默顯著抑制肝癌MGC-803細胞增殖，對細胞周期進展的分析表明，F(xiàn)CRL沉默減少了S期細胞的數(shù)量，同時增加了G0/G1期細胞的數(shù)量，表明G0/G1停滯〔15〕。進一步分析其中一種細胞周期調(diào)節(jié)因子cyclinD1，表明FCRL5可通過控制周期調(diào)節(jié)蛋白的表達來啟動增殖。研究表明，F(xiàn)CRL5可通過與其受體的相互作用調(diào)節(jié)核因子(NF)-κB，磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)或絲裂原活化蛋白激酶信號通路激活癌細胞增殖〔16〕。腫瘤生物學(xué)的重要組成部分是細胞的轉(zhuǎn)移能力。FCRL5沉默可顯著降低癌細胞的轉(zhuǎn)移能力，F(xiàn)CRL5沉默減少了MMP-9的細胞表達，MMP-9是參與細胞外基質(zhì)(ECM)降解的關(guān)鍵酶。由于ECM對細胞運動產(chǎn)生生化和機械障礙，降解是癌細胞轉(zhuǎn)移的重要過程；在胰腺癌細胞中FCRL5、MMP-9表達與癌轉(zhuǎn)移能力一致；FCRL5通過特異性抑制PI3K/Akt信號通路誘導(dǎo)MMP-9表達〔17〕。而本試驗結(jié)果提示FCRL5具有促進肝癌細胞增殖與侵襲遷移能力的作用。

研究〔18,19〕表明，cyclinD1是明確的原癌基因，能促進細胞增殖，其機制與cyclinD1結(jié)合周期蛋白依賴性激酶(CDK)蛋白磷酸化E2Fs-pRb二聚體，E2F脫離pRb蛋白后促使細胞越過G1/S限制點進入S期有關(guān)。FCRL5通過作用于細胞周期G1期，促進G1向S期正向轉(zhuǎn)換，并以細胞周期素核編碼區(qū)與CDK4/6結(jié)合，形成cyclinD1-CDK4或cyclinD1-CDK6復(fù)合物，此復(fù)合物是調(diào)節(jié)細胞增殖周期的關(guān)鍵蛋白。MMP-9其主要作用底物是Ⅳ、Ⅴ型膠原和明膠。體外侵襲實驗證實腫瘤細胞的高侵襲能力與MMP-9高表達密切相關(guān)，本研究中FCRL通過誘導(dǎo)MMP-9的分泌，水解細胞外基質(zhì)，從而有利于肝癌細胞的侵襲〔20〕。根據(jù)上述結(jié)果推測，F(xiàn)CRL5具有促進肝癌細胞增殖與侵襲遷移能力的作用，其機制可能與FCRL5誘導(dǎo)肝癌細胞高表達MMP-9、cyclinD1、VEGF有關(guān)。

綜上所述，F(xiàn)CRL5在肝癌組織中高度表達；FCRL5具有促進肝癌細胞增殖與侵襲遷移能力的作用，其機制可能與FCRL5誘導(dǎo)肝癌細胞高表達MMP-9、cyclinD1、VEGF有關(guān)。