基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討玫蘆消痤膏治療痤瘡的作用機(jī)制*

楊宗發(fā)，談利紅，唐 倩

(重慶醫(yī)藥高等專(zhuān)科學(xué)校藥學(xué)院 401331)

痤瘡(Acne)是一種毛囊皮脂腺的慢性炎癥性皮膚病，其發(fā)病與性激素水平、皮脂分泌過(guò)多、丙酸痤瘡桿菌感染等密切相關(guān)，臨床表現(xiàn)為粉刺、膿包、丘疹、瘢痕、囊腫等，好發(fā)于青春發(fā)育期人群[1]。目前臨床上常用的治療藥物有抗雄激素、維A酸類(lèi)、抗生素類(lèi)等，雖然這些治療方案是有效的，但存在易耐藥、不良反應(yīng)多等缺點(diǎn)[2]。在古代醫(yī)學(xué)典籍中，痤瘡稱(chēng)為肺風(fēng)粉刺、面瘡等，主要有肺經(jīng)風(fēng)熱、血瘀痰凝、濕熱內(nèi)蘊(yùn)3種類(lèi)型[3]。中醫(yī)藥在緩解痤瘡臨床癥狀、控制病程等方面具有療效可靠，復(fù)發(fā)率低、不良反應(yīng)少等獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。

玫蘆消痤膏(MXO)來(lái)源于苗族民間驗(yàn)方，全方由庫(kù)拉索蘆薈、苦參、杠板歸和大馬士革玫瑰組成，具有清熱燥濕、活血消斑和殺蟲(chóng)止癢的功效，目前臨床上玫蘆消痤膏可用于治療痤瘡、濕疹等多種皮膚疾病，且療效明顯[4-5]。大量的循證醫(yī)學(xué)證據(jù)已經(jīng)表明，MXO治療痤瘡具有較好的療效和安全性，現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明其具有明顯抗炎、抗過(guò)敏、抑菌、鎮(zhèn)痛及止癢等藥理作用，但是對(duì)于其藥理作用機(jī)制缺乏全面、系統(tǒng)的闡述[6]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)區(qū)別于傳統(tǒng)的“單靶點(diǎn)-單藥物-單疾病”研究模式，它可以從系統(tǒng)水平層面研究藥物與機(jī)體的相互作用，為中藥復(fù)方的研究提供了一種具有可預(yù)測(cè)性的新方法[7-8]。因此，本文運(yùn)用中藥網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，挖掘MXO的有效成分、中藥靶標(biāo)、疾病靶標(biāo)，構(gòu)建藥物-成分-疾病-靶標(biāo)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，預(yù)測(cè)MXO治療痤瘡的作用靶標(biāo)與主要的活性成分，揭示其可能的分子作用靶點(diǎn)和通路。該研究為深入探討其作用機(jī)制和藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 成分篩選及其靶標(biāo)的獲取

本研究是利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)(TCMSP,http://tcmspw.com/tcmsp.php)檢索玫蘆消痤膏中蘆薈、苦參、玫瑰的所有活性成分，杠板歸活性成分來(lái)源于相關(guān)參考文獻(xiàn)。藥物篩選標(biāo)準(zhǔn)：Lipinski類(lèi)藥5規(guī)則，通過(guò)上述過(guò)程得到玫蘆消痤膏的生物活性成分。隨后運(yùn)行Perl軟件，獲得相關(guān)成分的靶點(diǎn)基因，將所得數(shù)據(jù)去重后錄入U(xiǎn)niProt數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.uniprot.org/)，轉(zhuǎn)化為獲取靶點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)基因名稱(chēng)。

1.2 痤瘡疾病相關(guān)靶標(biāo)分析

基于國(guó)際疾病靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)OMIM(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/omim)和GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.genecards.org/)，以“Acne”作為檢索詞，檢索痤瘡疾病相關(guān)靶點(diǎn)，分值越高，相關(guān)證據(jù)越多，刪減重復(fù)后進(jìn)行歸一整合，獲得痤瘡疾病靶點(diǎn)集。

1.3 活性成分與疾病共同靶點(diǎn)篩選

為了獲得痤瘡與MXO的共同靶點(diǎn)，運(yùn)用Rversion3.6.2軟件及Perl語(yǔ)言程序?qū)⑺幬锇袠?biāo)基因和疾病基因取交集，結(jié)果使用韋恩圖(Venn diagram)表示。

1.4 活性成分-疾病-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

利用Cytoscape3.7.1(http://www.cytoscape.org/)軟件繪制“活性成分-疾病-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖，將整合過(guò)后的活性成分和疾病靶點(diǎn)信息導(dǎo)入軟件，利用“network analyzer”功能進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)分析。

1.5 蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

利用STRING數(shù)據(jù)庫(kù)(https://string-db.org/)，構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(PPI)，蛋白種類(lèi)選擇“Homo Sapiens”，最低相互作用閾值設(shè)置為“medium confidence=0.4”，其他參數(shù)保持默認(rèn)設(shè)置，獲得PPI網(wǎng)絡(luò)。

1.6 GO分析和KEGG通路富集分析

利用R語(yǔ)言(https://www.r-project.org/)中的BiocManager包對(duì)MXO活性成分和痤瘡共同靶點(diǎn)進(jìn)行GO(gene ontology)分析和KEGG(KEGG pathway analysis)通路富集分析，提取P<0.05的通路以及生物過(guò)程，并繪制氣泡圖。

2 結(jié) 果

2.1 活性成分的篩選及相應(yīng)靶標(biāo)預(yù)測(cè)結(jié)果

通過(guò)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)MXO組成藥物已報(bào)到的活性成分進(jìn)行檢索，并以設(shè)定的ADME參數(shù)為條件篩選，去除重復(fù)成分后，得到35個(gè)核心活性成分，主要包括苦參酚、苦參素、山柰酚、花青素、花生四烯酸、金絲桃苷、蘆薈大黃素、槲皮素、木犀草素等。

2.2 MXO-痤瘡疾病共同靶標(biāo)結(jié)果

痤瘡靶標(biāo)基因1 312個(gè)，MXO藥物靶標(biāo)基因218個(gè)，利用Rversion3.6.2軟件取交集，得到MXO治療痤瘡的潛在靶點(diǎn)92個(gè)，其韋恩圖表達(dá)見(jiàn)圖1。

圖1 MXO-痤瘡靶標(biāo)韋恩圖

2.3 MXO“活性成分-作用靶標(biāo)”網(wǎng)絡(luò)圖結(jié)果

利用Cytoscape3.7.1軟件，構(gòu)建了MXO“活性成分-作用靶標(biāo)”網(wǎng)絡(luò)圖，見(jiàn)圖2。網(wǎng)絡(luò)圖中紫色圓形節(jié)點(diǎn)為作用靶標(biāo)，綠色橢圓形節(jié)點(diǎn)為活性成分，點(diǎn)與點(diǎn)之間的線條代表活性成分與靶標(biāo)的對(duì)應(yīng)關(guān)系。網(wǎng)絡(luò)中共獲得129個(gè)節(jié)點(diǎn)，其中活性成分35個(gè)，作用靶標(biāo)92個(gè)，藥物和疾病各1個(gè)，還有一些化合物未查詢到對(duì)應(yīng)的作用靶標(biāo)，故未納入網(wǎng)絡(luò)圖中。

圖2 MXO“活性成分-作用靶標(biāo)”網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 MXO蛋白質(zhì)-PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建結(jié)果

利用STRING數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建了MXO蛋白質(zhì)-PPI網(wǎng)絡(luò)圖，得到了92種蛋白之間的相互作用關(guān)系，見(jiàn)圖3。其中節(jié)點(diǎn)表示蛋白，每條邊表示蛋白與蛋白之間的相互作用關(guān)系。運(yùn)用R語(yǔ)言插件統(tǒng)計(jì)了節(jié)點(diǎn)數(shù)目排名前30位的蛋白靶點(diǎn)(圖4)，相互作用較為密切的蛋白有Rac-α絲氨酸/蘇氨酸-蛋白激酶(AKT1)、白細(xì)胞介素(IL)-6、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A(VEGFA)、前列腺素內(nèi)過(guò)氧化物合成酶2(PTGS2)和粒細(xì)胞趨化蛋白-1(CXCL8)等，預(yù)測(cè)可以作為MXO治療痤瘡的潛在靶點(diǎn)。

圖3 靶標(biāo)蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖

圖4 核心靶標(biāo)條圖(前30位)

2.5 GO功能富集以及KEGG通路富集結(jié)果

靶點(diǎn)GO分析柱狀圖和氣泡圖見(jiàn)圖5、6?？v坐標(biāo)為生物過(guò)程，橫坐標(biāo)和氣泡面積大小代表基因數(shù)量，氣泡顏色代表富集顯著性，顏色越紅，P值越小，富集的程度越高。從圖可知MXO治療痤瘡的生物過(guò)程主要涉及核受體活性、轉(zhuǎn)錄因子活性、類(lèi)固醇激素受體活性、細(xì)胞因子活性等。KEGG通路富集分析，共得到134條通路，排除廣泛通路后，富集靶點(diǎn)數(shù)大于10的信號(hào)通路見(jiàn)表1。核心靶點(diǎn)主要分布在TNF、磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)、IL-17、AGE-RAGE等信號(hào)通路中。以TNF信號(hào)通路為例，MXO治療痤瘡的潛在靶點(diǎn)和作用機(jī)制見(jiàn)圖7。

圖5 GO功能富集分析柱狀圖

圖6 GO功能富集分析氣泡圖

圖中標(biāo)紅的基因是MXO治療痤瘡的潛在靶點(diǎn)。

表1 KEGG信號(hào)通路信息

3 討 論

本研究從中藥網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)入手，初步分析和探討了MXO治療痤瘡的作用機(jī)制，為MXO活性成分篩選以及多靶點(diǎn)、多通路的治療機(jī)制提供了參考。通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)篩選得到MXO的35個(gè)活性化合物，根據(jù)圖2可知，槲皮素、山柰酚、木犀草素、花生四烯酸、β-胡蘿卜素、芒柄花黃素、沒(méi)食子酸和異鼠李素是關(guān)鍵活性成分。研究顯示，槲皮素是一種植物源殺菌劑，對(duì)多種細(xì)菌都有抑制作用，具有較強(qiáng)的體內(nèi)外抑菌作用與廣譜抗菌[9]。此外槲皮素可通過(guò)降低炎癥因子IL-1、IL-6、IL-10的表達(dá)量而達(dá)到抗炎癥的效果[10]；通過(guò)AMPK/Sirt1途徑調(diào)節(jié)炎癥因子IL-12和一氧化氮合酶(iNOS)的基因表達(dá)量進(jìn)行抗炎的作用[11]；也可以通過(guò)降低特定炎癥因子的基因表達(dá)來(lái)治療炎癥性皮膚病[12]。木犀草素可以通過(guò)減少活性氧和活性氮的生成，影響花生四烯酸的代謝和多種炎性信號(hào)通路，抑制炎性細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)的表達(dá)[13]?；ㄉ南┧崮軌蛘T導(dǎo)和抵抗致炎作用、調(diào)節(jié)神經(jīng)內(nèi)分泌和促進(jìn)細(xì)胞分裂[14]。總之，MXO的主要活性成分可通過(guò)相關(guān)信號(hào)通路治療炎癥性皮膚病。

通過(guò)對(duì)PPI映射網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)，AKT1、IL-6、VEGFA、PTGS2和CXCL8等蛋白具有較大degree值，暗示這些靶點(diǎn)在MXO治療痤瘡的過(guò)程中發(fā)揮了關(guān)鍵的作用。AKT1在調(diào)節(jié)NF-κB依賴(lài)性基因轉(zhuǎn)錄中起重要作用；IL-6涉及多種與炎癥相關(guān)的疾病狀態(tài)，它是急性期反應(yīng)的有效誘導(dǎo)劑；VEGFA基因誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞遷移，抑制細(xì)胞凋亡并誘導(dǎo)血管通透性；PTGS2負(fù)責(zé)與炎癥和有絲分裂有關(guān)的類(lèi)前列腺素的生物合成；CXCL8是炎性反應(yīng)的主要介質(zhì)。

GO富集分析明確了共同靶點(diǎn)在治療中的生物學(xué)作用，其過(guò)程主要涉及核受體活性、轉(zhuǎn)錄因子活性、類(lèi)固醇激素受體活性、細(xì)胞因子活性等。以上生物學(xué)過(guò)程與痤瘡的發(fā)病原因機(jī)體免疫失衡、炎性因子作用、雄激素作用等都有聯(lián)系[15]。預(yù)測(cè)MXO可能是通過(guò)調(diào)控炎性反應(yīng)、雌激素水平等生物過(guò)程來(lái)治療痤瘡，但需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn)，MXO治療痤瘡主要涉及流體剪切力與動(dòng)脈粥樣硬化通路、TNF信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路、IL-17信號(hào)通路、AGE-RAGE信號(hào)通路等。流體剪切力是血液在血管中流動(dòng)時(shí)對(duì)血管壁產(chǎn)生的一種應(yīng)力，通過(guò)影響血管內(nèi)皮細(xì)胞的氧化還原狀態(tài)等途徑，對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)展起著重要作用[16]。雖然流體剪切力與動(dòng)脈粥樣硬化通路中涉及到MXO治療痤瘡的潛在靶點(diǎn)最多，但是目前沒(méi)有研究表明該通路與痤瘡的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)。TNF信號(hào)通路和IL-17信號(hào)通路都是炎癥的經(jīng)典通路，痤瘡的本質(zhì)是一種炎性反應(yīng)。痤瘡與多種炎癥因子有關(guān)，TNF-α、IL-6、IL-8、IL-12和IL-1α?xí)龠M(jìn)毛囊口的過(guò)度角化及痤瘡的特征性炎性損傷[17]。而AGE-RAGE信號(hào)通路的激活會(huì)增強(qiáng)炎性反應(yīng)。據(jù)報(bào)道，激活PI3K/Akt通路，將會(huì)導(dǎo)致Fox01轉(zhuǎn)移至胞質(zhì)內(nèi)磷酸化失活，并且與雄激素受體解離，從而減少對(duì)雄激素受體抑制，進(jìn)一步增強(qiáng)雄激素受體的作用，誘發(fā)痤瘡[18]。痤瘡的一線治療藥物異維A酸能通過(guò)調(diào)節(jié)PI3K-Akt信號(hào)通路，作用于FoxO1，起到治療痤瘡的作用[19]。根據(jù)結(jié)果推斷，MXO的生物活性成分可能通過(guò)作用于與炎癥、雄激素相關(guān)的通路，從而對(duì)痤瘡起到治療作用。

綜上所述，本研究利用中藥網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，在理論上初步探究了MXO治療痤瘡的作用機(jī)制，為后續(xù)的MXO藥理機(jī)制分析和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證提供了理論支持。