miR-4458靶向STAT3對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、凋亡及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響*

顏 超，趙 強(qiáng)

(四川省德陽(yáng)市第二人民醫(yī)院普外科 618000)

結(jié)直腸癌(CRC)是全球癌癥相關(guān)發(fā)病率和病死率高的主要原因[1-2]。此外，大部分CRC患者初次診斷時(shí)即為晚期，且具有高轉(zhuǎn)移性和復(fù)發(fā)性，嚴(yán)重威脅人類的生命健康，因此探索新的生物標(biāo)記物用于改善臨床CRC診斷和治療效果至關(guān)重要[3]。細(xì)胞侵襲和遷移行為是影響腫瘤轉(zhuǎn)移的重要因素，而靶向驅(qū)動(dòng)調(diào)控基因可能是治療惡性腫瘤疾病并提高生存率的理想策略[4]。微小RNA(miRNA)是內(nèi)源性非編碼小RNA，可以在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)節(jié)靶mRNA表達(dá)，參與疾病發(fā)展進(jìn)程[5]。QIN等[6]研究發(fā)現(xiàn)，miR-4458在結(jié)腸癌細(xì)胞被下調(diào)，過(guò)表達(dá)miR-4458可以抑制細(xì)胞增殖、糖酵解和乳酸形成，但miR-4458對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡、侵襲和遷移影響及其作用機(jī)制尚未闡明。本研究旨在探索miR-4458過(guò)表達(dá)對(duì)CRC細(xì)胞系人結(jié)腸癌細(xì)胞(HT-29)凋亡、侵襲、遷移及上皮間質(zhì)化(EMT)影響，并初步探索其作用機(jī)制，以期為開(kāi)發(fā)CRC臨床診斷和治療新方法提供思路。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器

1.1.1主要材料

人結(jié)腸癌細(xì)胞(HT-29，TCHu103)和人正常結(jié)腸上皮細(xì)胞(HCoEpiC，C1388)購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)；miR-4458 mimics、miR-4458 NC由廣州市銳博生物科技有限公司設(shè)計(jì)合成；miR-4458、STAT3、U6、GADPH引物序列由上海生工生物工程有限公司設(shè)計(jì)合成；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(Cell Counting Kit 8，CCK-8，CA1210)、RPMI 1640培養(yǎng)基(10491)、Matrigel膠(356234)、Trizol試劑盒(15596-018)、RIPA裂解液(R0010)、ECL發(fā)光液(PE0010)購(gòu)于北京Solarbio公司；胎牛血清(C0227)、上皮型鈣粘蛋白(E-cadherin，AF0138)和波形蛋白(Vimentin)鼠抗人單克隆抗體(AF0318)、神經(jīng)性鈣黏附蛋白(N-cadherin)兔抗人多克隆抗體(AF0243)購(gòu)于上海碧云天公司；PureLinkTMRNA Mini試劑盒(12183025)、山羊抗兔lgG(H+L，A32731)和山羊抗小鼠lgG(H+L)二級(jí)抗體(A32723)購(gòu)于美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司。

1.1.2主要儀器

MA100N型倒置顯微鏡由日本Nikon公司生產(chǎn)；ELX-8081U型酶標(biāo)儀和Gel DocTMXR+型凝膠成像儀由美國(guó)Bio-Rad公司生產(chǎn)；5333型PCR儀由德國(guó)Eppendorf公司生產(chǎn)；SG160型二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱由江蘇博賽斯儀器制造有限公司生產(chǎn)。

1.1.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

18只8周齡SPF級(jí)雌性BALB/c小鼠，體重(20.0±1.8)g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(滬)2017-0011。經(jīng)本院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并遵守3R保護(hù)原則進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 方法

1.2.1CRC腫瘤組織

采集2019年1月1日至12月31日本院40例結(jié)腸癌患者腫瘤組織和癌旁正常組織，均儲(chǔ)存于液氮中。患者手術(shù)前未接受過(guò)放射療法或化學(xué)療法。該研究得到本院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng)

HT-29細(xì)胞和HCoEpiC細(xì)胞均接種于補(bǔ)充10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中，于37 ℃、5%CO2環(huán)境培養(yǎng)，培養(yǎng)至3～5代，消化收集細(xì)胞，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3細(xì)胞分組及轉(zhuǎn)染

將HT-29細(xì)胞分為對(duì)照組、miR-4458陰性對(duì)照組(NC)組和miR-4458模擬物(mimics)組，按照Lipofectamine 2000說(shuō)明書將miR-4458 mimics和miR-4458 NC轉(zhuǎn)染細(xì)胞6 h，對(duì)照組不做轉(zhuǎn)染處理，然后更換新鮮培養(yǎng)液孵育24 h，收集后用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。另取1.2.2 HCoEpiC細(xì)胞設(shè)置為正常組。

1.2.4HE染色

將1.2.1收集的CRC癌組織和癌旁組織制成厚度為3 mm的組織切片，根據(jù)HE染色試劑盒說(shuō)明書步驟對(duì)上述組織進(jìn)行染色，顯微鏡下觀察組織病理狀態(tài)。

1.2.5逆轉(zhuǎn)錄定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR)實(shí)驗(yàn)

根據(jù)PureLinkTMRNA Mini試劑盒說(shuō)明書，從冷凍組織(每個(gè)組織最多30 mg)和1.2.3各組細(xì)胞提取總RNA，分別逆轉(zhuǎn)錄后，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。以U6、GADPH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法分別計(jì)算miR-4458和STAT3 mRNA相對(duì)表達(dá)量。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性20 s，58 ℃退火30 s，62 ℃延伸30 s，共40次循環(huán)。其中每組細(xì)胞RNA檢測(cè)實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)6次。miR-4458、STAT3、U6、GADPH引物序列見(jiàn)表1。

表1 miR-4458、STAT3、U6和GADPH引物序列

1.2.6移植瘤模型的建立

將對(duì)照組、miR-4458 NC組和miR-4458 mimics組HT-29細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，調(diào)整濃度為1.8×107個(gè)/mL，分別取125 μL接種于小鼠右前肢腋下，每組6個(gè)平行，每周檢測(cè)裸鼠移植瘤瘤體大小，6周后頸椎脫臼法處死小鼠，分離皮下移植瘤，計(jì)算各組各小鼠腫瘤體積，計(jì)算平均值。各組小鼠腫瘤體積均值=長(zhǎng)×寬×0.5/6。

1.2.7雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)實(shí)驗(yàn)

經(jīng)Targetscan Human數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)顯示，miR-4458與STAT3 mRNA 3′UTR區(qū)有結(jié)合位點(diǎn)，見(jiàn)圖1。將含有預(yù)測(cè)的miR-4458結(jié)合位點(diǎn)的STAT3 3′UTR序列和突變型STAT3 3′UTR序列克隆至pGL3報(bào)告載體，得到野生型STAT3-3′UTR-WT和突變型STAT3-3′UTR-MUT質(zhì)粒。取上述質(zhì)粒0.5 μg，均與miR-4458 mimics、miR-4458 NC共轉(zhuǎn)染HT-29細(xì)胞24 h，分為STAT3-3′UTR-WT+miR-4458 NC組、STAT3-3′UTR-WT+miR-4458 mimics組、STAT3-3′UTR-MUT+miR-4458 mimics組和STAT3-3′UTR-MUT+miR-4458 NC組，根據(jù)說(shuō)明書制備細(xì)胞提取物，測(cè)量各組熒光素酶活性，以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)6次。

圖1 miR-4458與STAT3 mRNA結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè)

1.2.8CCK-8實(shí)驗(yàn)

參照文獻(xiàn)[7]方法，檢測(cè)1.2.3各組HT-29細(xì)胞在轉(zhuǎn)染6、12、24和48 h時(shí)的增殖變化情況，每組6個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)6次。

1.2.9Annexin V-FITC/PI實(shí)驗(yàn)

嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書，對(duì)1.2.3各組HT-29細(xì)胞進(jìn)行Annexin V-FITC和PI染色處理，于流式細(xì)胞儀上檢測(cè)凋亡情況，每組3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)6次。

1.2.10劃痕實(shí)驗(yàn)

待1.2.3各組HT-29細(xì)胞長(zhǎng)滿后，用200 μL槍頭垂直劃痕，記錄劃痕情況，加入含有胎牛血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，拍照記錄各組遷移情況，分析計(jì)算遷移率。遷移率=(0 h劃痕距離-24 h劃痕距離)/0 h劃痕距離×100%，每組3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)6次。

1.2.11Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)

用無(wú)血清的培養(yǎng)基調(diào)整1.2.3各組HT-29細(xì)胞密度為1×106個(gè)/mL，取200 μL添加至含有Matrigel凝膠的上室，下室添加500 μL完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h。取出小室，固定，結(jié)晶紫染色，隨機(jī)抽取6個(gè)視野拍照并計(jì)數(shù)，每組3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)6次。

1.2.12Western blot實(shí)驗(yàn)

低溫裂解各組HT-29細(xì)胞分別獲得總蛋白，并檢測(cè)蛋白濃度。經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離裂解蛋白、轉(zhuǎn)膜、封閉后，加入一抗E-cadherin、N-cadherin、Vimentin和GADPH(1∶1 000)，孵化過(guò)夜，添加二抗(1∶5 000)，共孵育2 h，加入ECL，暗室曝光顯影，分析條帶密度進(jìn)行定量分析，每組3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)6次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 miR-4458和STAT3在CRC患者癌組織和癌旁組織的表達(dá)情況

CRC患者癌旁組織與癌組織病理檢查顯示，與癌旁組織相比，癌組織中miR-4458表達(dá)顯著降低(P<0.05)，STAT3 mRNA顯著升高(P<0.05)，見(jiàn)圖2。

A：癌旁組織，HE×40；B：癌組織，HE×40；C：CRC患者癌組織和癌旁組織miR-4458和STAT3表達(dá)情況與癌旁組織相比，P<0.05。

2.2 各組細(xì)胞miR-4458表達(dá)水平情況

與正常組相比，對(duì)照組miR-4458表達(dá)顯著降低(P<0.05)，STAT3 mRNA表達(dá)顯著升高(P<0.05)；與對(duì)照組和miR-4458 NC組相比，miR-4458 mimics組HT-29細(xì)胞miR-4458表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，STAT3 mRNA表達(dá)顯著降低，見(jiàn)表2。

表2 各組細(xì)胞miR-4458表達(dá)情況

2.3 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)驗(yàn)證miR-4458與STAT3靶向關(guān)系

雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)結(jié)果顯示，與STAT3-3′UTR-WT+miR-4458 NC組(0.82±0.09)比較，STAT3-3′UTR-WT+miR-4458 mimics組(0.17±0.02)熒光素酶活性降低(P<0.05)；STAT3-3′UTR-MUT+miR-4458 mimics組(0.75±0.04)和STAT3-3′UTR-MUT+miR-4458 NC組(0.71±0.05)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.4 過(guò)表達(dá)miR-4458對(duì)HT-29瘤體生長(zhǎng)的抑制作用

與對(duì)照組[(221.14±40.25)mm3]和miR-4458 NC組[(242.46±45.08)mm3]相比，miR-4458 mimics組[(29.92±5.47)mm3]小鼠HT-29移植瘤體積顯著縮小(P<0.05)，見(jiàn)圖3。

圖3 各組小鼠HT-29移植瘤大小(標(biāo)尺：1 cm)

2.5 miR-4458 mimics轉(zhuǎn)染對(duì)HT-29細(xì)胞增殖影響

隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，各組細(xì)胞的增殖活性呈時(shí)間依賴性增加趨勢(shì)；相同時(shí)間下，與對(duì)照組和miR-4458 NC組相比，miR-4458 mimics組HT-29細(xì)胞增殖活性顯著降低(P<0.05)，見(jiàn)圖4。

a：P<0.05，與對(duì)照組相比；b：P<0.05，與miR-4458 NC組相比。

2.6 miR-4458 mimics轉(zhuǎn)染對(duì)HT-29細(xì)胞凋亡的影響

與對(duì)照組和miR-4458 NC組相比，miR-4458 mimics組HT-29細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05)，見(jiàn)圖5。

A：各組細(xì)胞凋亡檢測(cè)圖片；B：各組細(xì)胞凋亡率變化與對(duì)照組相比；b：P<0.05，與miR-4458 NC組相比。

2.7 miR-4458 mimics轉(zhuǎn)染對(duì)HT-29細(xì)胞遷移能力的影響

相同遷移時(shí)間下，與對(duì)照組和miR-4458 NC組相比，miR-4458 mimics組HT-29細(xì)胞遷移率顯著降低(P<0.05)，見(jiàn)圖6、表3。

圖6 各組HT-29細(xì)胞遷移圖片(白光明場(chǎng)，×100)

表3 miR-4458 mimics轉(zhuǎn)染HT-29細(xì)胞的遷移率

2.8 miR-4458 mimics轉(zhuǎn)染對(duì)HT-29細(xì)胞侵襲能力的影響

與對(duì)照組(308.96±21.07)個(gè)和miR-4458 NC組(296.82±27.35)個(gè)相比，miR-4458 mimics組HT-29細(xì)胞侵襲數(shù)量(95.86±22.52)個(gè)顯著降低(P<0.05)，見(jiàn)圖7。

圖7 miR-4458 mimics轉(zhuǎn)染對(duì)HT-29細(xì)胞侵襲能力的影響(結(jié)晶紫，×100)

2.9 miR-4458 mimics轉(zhuǎn)染對(duì)HT-29細(xì)胞EMT相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

與對(duì)照組和miR-4458 NC組相比，miR-4458 mimics組HT-29細(xì)胞中E-cadherin蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，N-cadherin及Vimentin蛋白表達(dá)量顯著降低(P<0.05)，見(jiàn)圖8、表4。

A：對(duì)照組；B：miR-4458 NC組；C：miR-4458 mimics組。

表4 各組細(xì)胞E-cadherin、N-cadherin及Vimentin蛋白表達(dá)情況

3 討 論

目前，用于診斷和檢測(cè)從腺瘤到CRC進(jìn)展的常規(guī)方法為結(jié)腸鏡檢查和糞便潛血測(cè)試(FOBT)，但結(jié)腸鏡檢查價(jià)格昂貴且具有侵入性，F(xiàn)OBT靈敏度低，而miRNA可能是一種新的檢測(cè)方式[8]。此外，miRNA是介導(dǎo)腸內(nèi)動(dòng)態(tài)平衡的關(guān)鍵分子調(diào)節(jié)劑，與CRC進(jìn)展密切相關(guān)[9]。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-4458在結(jié)腸癌細(xì)胞和腫瘤組織中均低表達(dá)，轉(zhuǎn)染miR-4458 mimics后，HT-29細(xì)胞miR-4458表達(dá)水平顯著增高，提示轉(zhuǎn)染成功，同時(shí)過(guò)表達(dá)miR-4458能夠顯著抑制HT-29移植瘤體生長(zhǎng)，miR-4458可能與結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。

STAT3是惡性腫瘤中公認(rèn)的促癌蛋白，在癌癥侵襲性方面起重要調(diào)節(jié)作用，并影響腫瘤細(xì)胞的EMT過(guò)程[10-12]。本研究結(jié)果顯示，STAT3在結(jié)腸癌細(xì)胞和腫瘤組織中均高表達(dá)，轉(zhuǎn)染miR-4458 mimics后，結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞中STAT3 mRNA表達(dá)顯著降低，提示miR-4458與STAT3可能存在靶向關(guān)系。經(jīng)Targetscan Human數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)，miR-4458與STAT3 mRNA 3′UTR區(qū)存在結(jié)合位點(diǎn)，且雙熒光素酶基因檢測(cè)報(bào)告顯示，與STAT3-3′UTR-WT+miR-4458 NC組比較，STAT3-3′UTR-WT+miR-4458 mimics組熒光素酶活性降低，表明miR-4458與STAT3存在靶向關(guān)系。在三陰性乳腺癌和乳腺癌細(xì)胞中，激活STAT3有助于促進(jìn)癌細(xì)胞的遷移、侵襲和EMT進(jìn)程[10-11]。另有研究顯示，STAT3是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞EMT和肝癌轉(zhuǎn)移的正調(diào)節(jié)劑，因此推測(cè)miR-4458可能通過(guò)靶向抑制STAT3表達(dá)，抑制HT-29細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為，但需進(jìn)一步驗(yàn)證[12]。

WU等[13]研究發(fā)現(xiàn)，miR-4458在乳腺癌腫瘤組織和細(xì)胞中低表達(dá)，模擬miR-4458能夠顯著抑制細(xì)胞遷移和侵襲；此外，過(guò)表達(dá)miR-4458能夠抑制肝癌細(xì)胞的侵襲、遷移和EMT，且肝癌組織中較低的miR-4458水平與不良預(yù)后相關(guān)[14-15]。本研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組和miR-4458 NC組相比，上調(diào)miR-4458水平可顯著降低HT-29細(xì)胞增殖、遷移和侵襲行為，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，提示miR-4458可能是治療CRC腫瘤的目標(biāo)miRNA，也可能與CRC預(yù)后相關(guān)。結(jié)腸癌具有很高的腫瘤侵襲性，這被認(rèn)為是其最致命屬性[16]。其中，EMT參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞和微環(huán)境間的相互作用，在腫瘤轉(zhuǎn)移中至關(guān)重要[17-18]。細(xì)胞黏附分子E-cadherin表達(dá)下降和間充質(zhì)標(biāo)記物Vimentin、N-cadherin表達(dá)增加是細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力提高，EMT發(fā)生的標(biāo)志[19]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，miR-4458 mimics組HT-29細(xì)胞E-cadherin蛋白表達(dá)顯著增加，而N-cadherin和Vimentin蛋白表達(dá)明顯減少，提示上調(diào)miR-4458，可明顯降低HT-29細(xì)胞運(yùn)動(dòng)相關(guān)的蛋白質(zhì)表達(dá)，阻抑EMT進(jìn)程。另有研究證實(shí)，防止STAT3活化與抑制大腸癌細(xì)胞EMT和腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)[20]，因此推測(cè)miR-4458可能通過(guò)靶向抑制STAT3表達(dá)，抑制HT-29細(xì)胞的遷移、侵襲和EMT行為，miR-4458可能是治療CRC腫瘤的新靶點(diǎn)。

綜上所述，miR-4458可能通過(guò)靶向抑制STAT3表達(dá)，抑制HT-29細(xì)胞增殖、凋亡和EMT，為臨床治療CRC提供了新的靶標(biāo)。但鑒于CRC發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，可能涉及多種通路，本課題將聯(lián)合小鼠模型和臨床試驗(yàn)對(duì)miR-4458的調(diào)控機(jī)制進(jìn)行更深入研究。