芒果苷通過(guò)PI3K/Akt/mTOR通路對(duì)蛛網(wǎng)膜下腔出血后神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用*

姬康祁,周文科

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科/河南省神經(jīng)修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南新鄉(xiāng) 453000)

蛛網(wǎng)膜下腔出血(SAH)是腦卒中的嚴(yán)重亞型[1]。研究人員認(rèn)為SAH后72 h內(nèi)發(fā)生的早期腦損傷(EBI)是SAH預(yù)后不良的主要原因[2]。已有研究表明，SAH后會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的線粒體功能障礙[3]，進(jìn)一步誘發(fā)細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷和凋亡，從而導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞的損傷甚至死亡[4]，所以SAH的早期治療成為關(guān)注的重點(diǎn)。

芒果苷(MF)是天然存在于許多植物中的植物多酚，具有多種藥理作用，如抗氧化、抗炎、抗腫瘤和治療糖尿病等[5-6]。有研究表明，MF可通過(guò)多種途徑去預(yù)防或者修復(fù)包括腦缺血再灌注損傷、腦炎等疾?。徊⑶襇F會(huì)通過(guò)影響線粒體凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)改善魚(yú)藤酮誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[7]。有研究表明，磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)通路可通過(guò)介導(dǎo)凋亡蛋白去抑制細(xì)胞凋亡[8]，而MF又具有廣泛的生物活性。本實(shí)驗(yàn)旨在研究MF通過(guò)PI3K/Akt/雷帕霉素靶蛋白(mTOR)途徑改善蛛網(wǎng)膜下腔出血后早期階段神經(jīng)細(xì)胞線粒體功能，從而抑制神經(jīng)細(xì)胞的凋亡。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞

Neuro-2a細(xì)胞由中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)購(gòu)買(mǎi)。

1.2 主要試劑與儀器

青鏈霉素、FBS、DMEM/HIGH GLUCOSE培養(yǎng)基購(gòu)于美國(guó)Hyclone公司，DMSO、高速低溫離心機(jī)、多功能酶標(biāo)儀均購(gòu)于美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司，氧合血紅蛋白(OxyHb)購(gòu)于上海源葉生物科技有限公司，MF購(gòu)于美國(guó)MCE公司，MTT、JC-1熒光探針、DCFC-DA熒光探針、線粒體綠色熒光探針、溶酶體紅色熒光探針、細(xì)胞線粒體分離試劑盒、二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒均購(gòu)于上海碧云天科技有限公司，凋亡相關(guān)蛋白淋巴細(xì)胞瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2關(guān)聯(lián)X蛋白(Bax)、細(xì)胞色素C(Cyt-C)、Caspase-3抗體購(gòu)于北京博奧森科技有限公司，PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR 抗體購(gòu)自美國(guó)CST公司，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱購(gòu)于德國(guó)Heraeus公司，熒光顯微鏡購(gòu)于德國(guó)Carl Zeiss公司。

1.3 方法

1.3.1Neuro-2a細(xì)胞培養(yǎng)及分組

Neuro-2a細(xì)胞的培養(yǎng)基為含10% FBS和1%青霉素/鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，置于37 ℃，5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。根據(jù)文獻(xiàn)[9]提出的培養(yǎng)方法制備SAH細(xì)胞模型，對(duì)照組：常規(guī)進(jìn)行換液，不加任何藥物處理；SAH組：在細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，加入OxyHb，使其終濃度為10 μmol/L；MF+SAH組：加入250 μmol/L的MF，孵育30 min，加入OxyHb，使終濃度達(dá)到10 μmol/L。

1.3.2MTT檢測(cè)Neuro-2a細(xì)胞的活力

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Neuro-2a細(xì)胞按照每孔1×104/100 μL接種到96孔板中，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，于37 ℃，5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后，加入不同濃度的MF預(yù)處理30 min，加入OxyHb，培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h后每孔加入20 μL MTT(5 mg/mL)，置于培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)4 h后加入100 μL的二甲基亞砜，在室溫中充分搖勻，用多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm處的吸光度。

1.3.3熒光顯微鏡觀察Neuro-2a細(xì)胞線粒體膜電位(Δψm)和ROS

在細(xì)胞完成貼壁后，加入OxyHb和MF處理繼續(xù)培養(yǎng)24 h，加入JC-1熒光探針染色30 min，該探針可聚集在線粒體的基質(zhì)中，形成聚合物，當(dāng)Δψm較高時(shí)，激發(fā)光會(huì)激發(fā)紅色熒光，當(dāng)出現(xiàn)線粒體功能障礙時(shí)，Δψm較低，線粒體會(huì)產(chǎn)生綠色熒光，可以用紅綠熒光的相對(duì)比例去衡量Δψm的變化。細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束后，分別向各組加入DCFC-DA熒光探針(10 μmol/L)后孵育30 min后用孵育液洗滌，用熒光顯微鏡(Zeiss Axio A1)對(duì)上述實(shí)驗(yàn)細(xì)胞拍照記錄。

1.3.4多功能酶標(biāo)線測(cè)定Neuro-2a細(xì)胞Δψm和RQS

Neuro-2a細(xì)胞按照3×105/孔接種到6孔板中。細(xì)胞造模并加藥后繼續(xù)培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞，用PBS洗2次，加入500 μL JC-1工作液，37 ℃孵育30 min，利用多功能酶標(biāo)儀測(cè)定，如果JC-1為單體進(jìn)入線粒體內(nèi)部，則以激發(fā)光485 nm，發(fā)射光535 nm檢測(cè)出綠光，如果JC-1為聚合體位于線粒體外膜，則以激發(fā)光530 nm，發(fā)射光600 nm檢測(cè)JC-1為紅光。采用綠紅比(單體:聚合體)熒光強(qiáng)度法測(cè)定Δψm，綠紅比率低代表Δψm處于極化狀態(tài)；反之，Δψm處于去極化狀態(tài)。

1.3.5測(cè)定Neuro-2a細(xì)胞ROS量

按1.3.4方法對(duì)細(xì)胞造模并加藥后繼續(xù)培養(yǎng)24 h，用PBS反復(fù)洗滌，加入DCFC-DA 探針(10 μmol/L)在37 ℃保溫箱中避光孵育30 min。應(yīng)用多功能酶標(biāo)儀，以激發(fā)光485 nm，發(fā)射光535 nm檢測(cè)熒光強(qiáng)度。

1.3.6熒光顯微鏡觀察Neuro-2a細(xì)胞線粒體和溶酶體的共同定位

Neuro-2a細(xì)胞按1.3.1方法在6孔板中培養(yǎng)24 h，用OxyHb和MF處理繼續(xù)孵育24 h，在實(shí)驗(yàn)結(jié)束以后向3組培養(yǎng)基中分別加入線粒體熒光綠色探針和溶酶體紅色探針，37 ℃孵育30 min后，吸去培養(yǎng)基，PBS洗滌多次，置于熒光顯微鏡下拍照。

1.3.7Western blot 檢測(cè)MF對(duì)Neuro-2a細(xì)胞中PI3K、Akt、mTOR、Bcl-2、Bax、CytC、Caspase-3的表達(dá)

Neuro-2a細(xì)胞通過(guò)線粒體分離試劑提取出線粒體蛋白和胞漿蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度。加入蛋白上樣緩沖液，沸水浴10 min，行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，濃縮膠80 V、20 min，分離膠100 V，1 h，轉(zhuǎn)膜(100 mA、150 min)，用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，一抗包括：Caspase-3 1∶1000；Bcl-2 1∶500；Bax 1∶500；Cytc 1∶500；PI3K 1∶200；p-PI3K 1∶200；Akt 1∶200；p-Akt 1∶200；mTOR 1∶200；p-mTOR 1∶200；GAPDH 1∶2 000；COXⅣ 1∶2 000；兔抗β-actin抗體1∶2 000，于4 ℃搖床孵育過(guò)夜，室溫孵育二抗山羊抗兔IgG 抗體(1∶1 000)1 h，顯影曝光。用Image-J圖像分析系統(tǒng)對(duì)蛋白條帶進(jìn)行分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 MF對(duì)Neuro-2a細(xì)胞的活力影響

MTT實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)法顯示。隨著MF濃度增加，Neuro-2a細(xì)胞活力均下降，并且與MF濃度增加呈正相關(guān)，50、100、150、200、250 μmol/L組24 h抑制率分別為(1.254±0.125)%、(4.369±0.256)%、(10.752±0.345)%、(20.235±0.798)%、(27.952±0.898)%，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而250 μmol/L組最為顯著，故采用250 μmol/L濃度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.2 MF對(duì)Neuro-2a細(xì)胞Δψm的影響

與對(duì)照組中較多的紅色信號(hào)相比，OxyHb誘導(dǎo)了較多的綠色熒光信號(hào)，在線粒體外成員處積累了較多的單體。然而，MF逆轉(zhuǎn)了這一現(xiàn)象，檢測(cè)到更多的紅色熒光信號(hào)。對(duì)照組Δψm為7.91±0.21，SAH組明顯較對(duì)照組升高9.38±0.39(P<0.05)，而應(yīng)用MF之后Δψm恢復(fù)為8.31±0.25(P<0.05)，見(jiàn)圖1。

A:對(duì)照組；B:SAH組；C：SAH+MF組。

2.3 MF對(duì)Neuro-2a細(xì)胞內(nèi)ROS的影響

MF治療后則綠色熒光明顯降低。定量分析顯示SAH組ROS水平由對(duì)照組的1.82 ± 0.02顯著升高至2.61 ± 0.05(P<0.01)，而MF治療后則以劑量依賴(lài)方式減少ROS的生成，ROS水平降低為2.31± 0.03(P<0.01)，見(jiàn)圖2。

A:對(duì)照組；B:SAH組；C：SAH+MF組。

2.4 MF對(duì)Neuro-2a細(xì)胞的線粒體和溶酶體共同定位的影響

與對(duì)照組相比，SAH組存在大量綠色熒光，大量線粒體因功能障礙集聚在細(xì)胞中無(wú)法被清除，在應(yīng)用MF后溶酶體又重新吞噬受損線粒體，見(jiàn)圖3。

A:對(duì)照組；B:SAH組；C：SAH+MF組。

2.5 通過(guò)Western blot檢測(cè)MF對(duì)Neuro-2a細(xì)胞內(nèi)PI3K、Akt、mTOR表達(dá)的影響

與對(duì)照組相比，SAH組中p-PI3K、p-Akt、p-mTOR 的表達(dá)水平明顯下調(diào)(P<0.05)；與SAH組相比，MF+SAH組中p-PI3K、p-Akt、p-mTOR 的表達(dá)水平顯著上調(diào)(P<0.05)，見(jiàn)圖4、表1。

A：對(duì)照組；B：SAH組；C：SAH+MF組。

表1 3組Neuro-2a細(xì)胞胞漿內(nèi)PI3K/Akt/mTOR通路蛋白的表達(dá)比較

2.6 通過(guò)Western blot檢測(cè)MF對(duì)Neuro-2a細(xì)胞胞漿內(nèi)和線粒體內(nèi)Cyt-C釋放的影響

與對(duì)照組相比，SAH組線粒體中Cyt-C明顯下降(P<0.05)；與SAH組對(duì)比，MF+SAH組細(xì)胞線粒體中Cyt-C明顯上升(P<0.05)。與對(duì)照組相比，SAH組細(xì)胞胞漿中Cyt-C明顯上升(P<0.05)；與SAH組對(duì)比，MF+SAH組細(xì)胞胞漿中Cyt-C明顯下降(P<0.05)，見(jiàn)圖5、表2。

A：對(duì)照組，B：SAH組，C：SAH+MF組。

表2 3組Neuro-2a細(xì)胞胞漿和線粒體內(nèi)Cyt-C的表達(dá)比較

2.7 通過(guò)Western blot檢測(cè)MF對(duì)Neuro-2a細(xì)胞中凋亡蛋白的表達(dá)

與對(duì)照組對(duì)比，SAH組中蛋白Bax和Caspase-3表達(dá)均明顯上升(P<0.05)；蛋白Bcl-2的表達(dá)明顯下降(P<0.05)。與SAH組對(duì)比，MF+SAH干預(yù)組中蛋白Bax和Caspase-3表達(dá)均明顯下降(P<0.05)；蛋白Bcl-2的表達(dá)明顯上升(P<0.05)，圖6、表3。

A：對(duì)照組；B：SAH組；C：SAH+MF組。

表3 3組Neuro-2a細(xì)胞中Bax、Bcl-2、Caspase-3的表達(dá)比較

3 討 論

線粒體被認(rèn)為是許多信號(hào)分子相互溝通、控制氧化應(yīng)激、細(xì)胞鈣緩沖、凋亡、自噬的信號(hào)平臺(tái)[10-11]。SAH早期階段由于腦組織的急性腦損傷造成神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)線粒體功能障礙，進(jìn)一步導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞的凋亡[12]；而SAH后的OxyHb刺激是誘導(dǎo)線粒體損傷的重要原因，損傷的線粒體釋放大量ROS和細(xì)胞色素C到達(dá)胞質(zhì)，最終造成神經(jīng)細(xì)胞的凋亡[13-14]。本實(shí)驗(yàn)中SAH細(xì)胞模型關(guān)于凋亡的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也印證了這一點(diǎn)。所以推測(cè)線粒體在SAH早期階段發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，在本研究中以維持線粒體功能穩(wěn)定為目標(biāo)減緩神經(jīng)細(xì)胞的凋亡。本研究結(jié)果證實(shí)，MF可以通過(guò)改善線粒體功能障礙從而抑制神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，達(dá)到神經(jīng)保護(hù)作用。

MF是一種主要從龍膽科和漆樹(shù)科植物中提取的氧雜蒽酮類(lèi)化合物，也是中藥知母的主要活性成分[15]，具有強(qiáng)大的抗氧化和清除氧自由基等特點(diǎn)，因此在治療早期SAH中是一個(gè)非常有前景的藥物，但SAH發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，MF在SAH中如何改善線粒體功能障礙，從而達(dá)到對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用成為關(guān)注的重點(diǎn)。

本課題組早期實(shí)驗(yàn)已證實(shí)SAH后氧合血紅蛋白誘導(dǎo)[Ca2+]m超載[16]，導(dǎo)致Δψm去極化，使線粒體釋放過(guò)量的ROS造成神經(jīng)細(xì)胞的氧化應(yīng)激，從而造成線粒體功能障礙，使Cyt-C從線粒體內(nèi)逐漸轉(zhuǎn)移到胞漿里，從而誘導(dǎo)Caspase-3的活化，Caspase-3活化后進(jìn)一步調(diào)控下游凋亡蛋白，從而引發(fā)凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)，而線粒體內(nèi)的Cyt-C則減少，反過(guò)來(lái)又誘發(fā)ROS的釋放，進(jìn)一步加劇線粒體的損傷。本研究發(fā)現(xiàn)，MF治療后，Δψm恢復(fù)正常，且細(xì)胞內(nèi)ROS水平下降到正常水平，緩解了SAH后神經(jīng)細(xì)胞的氧化應(yīng)激，表明MF具有抗氧化和清除氧自由基的特點(diǎn)。結(jié)果表明，SAH組細(xì)胞胞漿內(nèi)Cyt-C表達(dá)顯著增加，線粒體內(nèi)Cyt-C表達(dá)顯著減少，Bax和Caspase-3表達(dá)顯著增加，Bcl-2表達(dá)顯著減少；應(yīng)用MF后，胞漿內(nèi)Cyt-C表達(dá)顯著下降，線粒體內(nèi)Cyt-C表達(dá)顯著增加，Bax和Caspase-3表達(dá)顯著減少，Bcl-2表達(dá)顯著增加。以上結(jié)果表明MF可通過(guò)維持Δψm穩(wěn)定，降低ROS產(chǎn)生的氧化應(yīng)激，從而抑制細(xì)胞內(nèi)凋亡的級(jí)聯(lián)反應(yīng)。

而MF如何在SAH后的神經(jīng)細(xì)胞中發(fā)揮作用，去改善線粒體功能障礙和抑制神經(jīng)細(xì)胞的凋亡成為關(guān)注的重點(diǎn)。PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路在細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞周期、凋亡、自噬等方面有重要調(diào)節(jié)作用[17]。有研究報(bào)道PI3K/Akt通路對(duì)于細(xì)胞的凋亡有抑制作用，而磷酸化的Akt可進(jìn)一步激活mTOR信號(hào)通路，mTOR信號(hào)通路作為該通路的重要下游效應(yīng)蛋白，對(duì)細(xì)胞凋亡起著重要作用[18]。本研究結(jié)果顯示，SAH組神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)p-PI3K、p-Akt、p-mTOR的表達(dá)均降低，而細(xì)胞內(nèi)Bax、Caspase-3和Cyt-C的表達(dá)升高，Bcl-2的表達(dá)下降，表明PI3K/Akt/mTOR通路在SAH早期階段可能受到了抑制，從而下游凋亡蛋白表達(dá)升高。而MF+SAH組，p-PI3K、p-Akt、p-mTOR的表達(dá)均增強(qiáng)，而相關(guān)凋亡蛋白表達(dá)受到抑制。說(shuō)明MF通過(guò)PI3K/Akt/mTOR通路參與了對(duì)神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)凋亡蛋白的調(diào)控。正常情況下，線粒體受損后溶酶體會(huì)被誘導(dǎo)清除受損線粒體，去維持線粒體的更新和功能。根據(jù)線粒體熒光和溶酶體熒光表明，在SAH組中更多的受損線粒體因?yàn)楣δ苷系K而導(dǎo)致無(wú)法被溶酶體清除。而通過(guò)MF治療過(guò)后，更多的線粒體被清除，預(yù)示著線粒體進(jìn)入正常的清除途徑，也可以從側(cè)面反映出神經(jīng)細(xì)胞線粒體功能障礙恢復(fù)正常。

綜上所述，研究表明MF可以通過(guò)穩(wěn)定Δψm，減少ROS的產(chǎn)生，改善線粒體功能障礙，從而抑制SAH早期階段神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，而對(duì)于凋亡蛋白的調(diào)控與PI3K/Akt/mTOR通路有著密不可分的關(guān)系，MF有望成為治療早期SAH中潛在的治療靶點(diǎn)。