苗藥鐵筷子對免疫抑制小鼠免疫功能的影響*

丁曉麗，索 萍，錢海兵

(1.貴州中醫(yī)藥大學(xué)，貴陽 550025；2.貴州省中醫(yī)藥方證藥理研究特色重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴陽 550025)

免疫通常是指非己抗原性物質(zhì)進(jìn)入體內(nèi)，機(jī)體能清除異物，保持身體功能平衡的一種生理功能。當(dāng)免疫過強(qiáng)時會引發(fā)超敏反應(yīng)、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等自身免疫性疾病，但當(dāng)免疫功能過低時又會誘發(fā)其他免疫缺陷綜合征[1]，因此尋找有效穩(wěn)定的免疫調(diào)節(jié)劑十分重要。苗藥鐵筷子(Helleborus thibetnus Franch.)為蠟梅科蠟梅屬(Chimonanthus)植物蠟梅(Chimonanthus Praecox L.Link)及山蠟梅(Chimonanthus nitens Oliv.)的干燥根及根莖[2]。課題組前期有將其用于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的研究，但并未進(jìn)行針對免疫影響的探索。因此本文采用環(huán)磷酰胺建立免疫力低下小鼠模型，探究鐵筷子對免疫功能低下狀態(tài)的影響，為苗藥鐵筷子用于免疫性疾病提供藥理學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動物

SPF級昆明種小鼠，雌雄各半，體重18～22 g，由遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動物使用許可證：SCXK(遼)2015-0001。

1.1.2主要儀器

紫外可見分光光度計(上海佑科儀器儀表有限公司)；低溫高速離心機(jī)(XK-400，江蘇新康醫(yī)療器械有限公司)；電子分析天平(ALC-210.3，北京愛科勒有限公司)；酶標(biāo)儀(Infinite M200，北京新風(fēng)機(jī)電技術(shù)公司)；8 mm小鼠耳朵打孔器；血細(xì)胞分析儀(XT-2000i，希森美康集團(tuán))。

1.1.3藥品與試劑

黃芪顆粒(貴州漢方藥業(yè)有限公司，批號20180312)；環(huán)磷酰胺(源業(yè)生物有限公司，批號X22D8Y51136)；印度墨汁(源業(yè)生物有限公司，批號L08A9G67537)；干擾素(IFN)-γ酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒(欣博盛生物有限公司，批號M181128-101a)；白細(xì)胞介素(IL)-6 ELISA試劑盒(欣博盛生物有限公司，批號M181128-004a)；IL-2 ELISA試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技有限公司，批號ml083138)；腫瘤壞死因子(TNF)-α ELISA試劑盒(欣博盛生物有限公司，批號M181128-102a)；IgM ELISA試劑盒(欣博盛生物有限公司，批號M181128-129a)；補(bǔ)體C3 ELISA試劑盒(武漢伊萊瑞特生物科技有限公司，批號DP7VCQ53L1)；補(bǔ)體C4 ELISA試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技有限公司，批號ml002048)。

1.1.4苗藥鐵筷子水煎液制備

苗藥鐵筷子，采自貴陽市烏當(dāng)區(qū)三江鎮(zhèn)農(nóng)場，經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院生藥教研室劉曉龍博士鑒定為蠟梅科蠟梅屬植物蠟梅的根。鐵筷子水煎液的制備：取鐵筷子藥材100 g，加水，浸泡0.5 h，然后用電磁爐加熱、過濾，連續(xù)2次，合并2次濾液，濃縮至100 mL，最后得到鐵筷子水煎液，其濃度為1 g/mL，使用前用水稀釋成相應(yīng)倍數(shù)。

1.2 方法

1.2.1動物分組及處理

SPF級昆明種小鼠，180只，雌雄各半，適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后分成空白組，模型組，鐵筷子水煎液高、中、低劑量組(1.00、0.50、0.25 g/mL)，陽性組(黃芪顆粒0.50 g/mL)。于實(shí)驗(yàn)第1天，除空白組外，其余各組小鼠均用環(huán)磷酰胺(50 mg/kg)隔日腹腔注射給藥，連續(xù)30 d，共注射15次，建立免疫低下小鼠模型?？瞻捉M腹腔注射等體積生理鹽水。給藥組分別按鐵筷子水煎液高、中、低劑量灌胃給藥，陽性組給以黃芪顆粒水溶液，空白組和模型組灌胃等體積生理鹽水，每天灌胃1次，連續(xù)30 d。每天灌胃時間晚于環(huán)磷酰胺注射時間30 min。

1.2.2小鼠體重增長率、免疫器官指數(shù)的測定

末次給藥24 h后，各組小鼠抽取10只，記錄小鼠體重，摘眼球取血，頸椎脫臼處死，取胸腺，用濾紙吸干臟器并稱重，計算臟器指數(shù)。計算公式:體重增長率%=(最終體重-初始體重)/初始體重×100%。胸腺指數(shù)=胸腺重量(mg)/體重(g)。

1.2.3遲發(fā)型超敏反應(yīng)的測定

于給藥后第20天，各組中選取10只小鼠腹部去毛，范圍為3 cm2。均勻涂抹配制好的1%的二硝基氟苯，連續(xù)致敏5 d，實(shí)驗(yàn)最后1 d前將1%的二硝基氟苯10 μL均勻涂抹在小鼠右耳兩面進(jìn)行攻擊，左耳涂抹丙酮。24 h后，摘眼球取血0.6～1.0 mL于乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管中，處死小鼠后，用8 mm的小鼠耳打孔器，打下耳片，于萬分之一的天平上精密稱量其重量。左右耳重量之差即為腫脹度。腫脹度=右耳重量-左耳重量。

1.2.4碳廓清實(shí)驗(yàn)

1.2.5小鼠血清中IFN-γ，IL-2，IL-6，TNF-α，IgM，補(bǔ)體C3、C4水平及全血中紅細(xì)胞與白細(xì)胞數(shù)的測定

將1.2.2所取的小鼠血進(jìn)行離心，3 000 r/min離心10 min分離血清，裝入EP管，-80℃保存?zhèn)溆?，參照ELISA試劑盒說明書，檢測血清中IFN-γ，IL-2，IL-6，TNF-α，IgM，補(bǔ)體C3、C4的水平。將1.2.3取得的小鼠全血在4 h內(nèi),利用血細(xì)胞分析儀對小鼠全血中的紅細(xì)胞和白細(xì)胞的數(shù)量進(jìn)行檢測。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 對免疫抑制小鼠體重增長率和免疫器官指數(shù)的影響

模型組小鼠體重增長率、胸腺指數(shù)顯著下降(P<0.05)，免疫抑制小鼠造模成功。鐵筷子水煎液低、中劑量組及陽性組可提高免疫抑制小鼠的體重增長率，與模型組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；鐵筷子各給藥組和陽性組提高了免疫抑制小鼠胸腺指數(shù)(P<0.05)，見圖1。

1:空白組；2:模型組;3:低劑量組;4:中劑量組;5:高劑量組;6:陽性組；a：P<0.05，與空白組比較；b：P<0.05，與模型組比較。

2.2 對免疫抑制小鼠遲發(fā)型超敏反應(yīng)的影響

模型組小鼠耳腫脹與空白組相比明顯降低(P<0.05)，與模型組相比，鐵筷子中劑量、陽性組可顯著增加小鼠耳腫脹度，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖2。

1:空白組；2:模型組;3:低劑量組;4:中劑量組;5:高劑量組;6:陽性組；a：P<0.05，與空白組比較；b：P<0.05，與模型組比較。

2.3 對免疫抑制小鼠巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響

與空白組比較，模型組和各給藥組小鼠吞噬指數(shù)降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，除陽性組外，各給藥組小鼠吞噬指數(shù)雖有增長但不顯著(P>0.05)，見圖3。

1:空白組；2:模型組;3:低劑量組;4:中劑量組;5:高劑量組;6:陽性組；a：P<0.05，與空白組比較；b：P<0.05，與模型組比較。

2.4 對免疫抑制小鼠血清中IFN-γ，IL-2，IL-6，TNF-α，IgM，補(bǔ)體C3、C4及全血中紅細(xì)胞(RBC)，白細(xì)胞(WBC)的影響

模型組小鼠體內(nèi)IFN-γ，IL-2，IL-6，TNF-α，IgM，補(bǔ)體C3、C4水平及RBC和WBC計數(shù)均降低，與空白組比較具差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，鐵筷子中、高劑量及陽性組IFN-γ水平升高，鐵筷子高劑量及陽性組IL-6、IL-2、補(bǔ)體C4水平升高，鐵筷子組及陽性組TNF-α水平升高，鐵筷子中、高劑量及陽性組小鼠體內(nèi)IgM、補(bǔ)體C3水平均升高，且鐵筷子各劑量給藥組都提高免疫抑制小鼠的RBC與WBC計數(shù)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖4。

1:空白組；2:模型組;3:低劑量組;4:中劑量組;5:高劑量組;6:陽性組；a：P<0.05，與空白組比較；b：P<0.05，與模型組比較。

3 討 論

免疫器官、免疫細(xì)胞和免疫分子共同構(gòu)成了人體免疫系統(tǒng)，免疫功能紊亂時常引起疾病的發(fā)生，其中免疫力低下對機(jī)體防御能力有很大的影響，因此增強(qiáng)免疫能力是預(yù)防疾病發(fā)生的關(guān)鍵[3]。胸腺是一重要的中樞免疫器官，T淋巴細(xì)胞的生長發(fā)育與胸腺密切相關(guān)，T淋巴細(xì)胞可直接殺傷靶細(xì)胞，釋放淋巴因子加強(qiáng)免疫應(yīng)答[4-5]，胸腺指數(shù)反映了機(jī)體免疫能力的強(qiáng)弱。本次造模藥物選用環(huán)磷酰胺構(gòu)建免疫抑制小鼠模型，環(huán)磷酰胺可引起免疫器官重量減輕，產(chǎn)生免疫抑制[6-7]。因此，本次實(shí)驗(yàn)采用小劑量多次注射環(huán)磷酰胺(50 mg/kg)的方法建立免疫力低下小鼠模型[8]，結(jié)果表明注射過環(huán)磷酰胺的小鼠體重增長率明顯下降，胸腺指數(shù)顯著降低，說明免疫抑制小鼠模型造模成功，灌胃給藥后，鐵筷子可提高免疫抑制小鼠的體重增長率、胸腺指數(shù)來改善免疫抑制小鼠的免疫能力，說明鐵筷子具有機(jī)體免疫保護(hù)作用。

吞噬指數(shù)主要用于判斷巨噬細(xì)胞吞噬能力的強(qiáng)弱[9]，碳廓清實(shí)驗(yàn)常用于巨噬細(xì)胞吞噬能力的檢測。本研究表明苗藥鐵筷子對免疫抑制小鼠巨噬細(xì)胞吞噬能力有改善作用。遲發(fā)型超敏反應(yīng)是Ⅳ型細(xì)胞介導(dǎo)的遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)，當(dāng)機(jī)體再次受到相同抗原刺激后，抗原提呈細(xì)胞會作用于效應(yīng)T細(xì)胞，CD4+細(xì)胞可通過分泌趨化因子，產(chǎn)生免疫損傷作用，出現(xiàn)炎癥反應(yīng)、腫脹[10]。模型組小鼠其免疫受到抑制，耳腫脹不明顯，但鐵筷子可增強(qiáng)免疫抑制小鼠免疫能力，提高免疫應(yīng)答。紅細(xì)胞、白細(xì)胞水平同樣也反映了機(jī)體免疫能力的強(qiáng)弱，紅細(xì)胞可識別攜帶抗原、促進(jìn)巨噬細(xì)胞的吞噬能力，白細(xì)胞參與了機(jī)體的防御反應(yīng)[11]，鐵筷子可提高免疫抑制小鼠RBC、WBC數(shù)量，表明苗藥鐵筷子可通過調(diào)節(jié)RBC、WBC的數(shù)量調(diào)節(jié)免疫能力。

血清中的細(xì)胞因子、免疫球蛋白以及補(bǔ)體含量的變化反映了機(jī)體免疫能力的強(qiáng)弱，Th細(xì)胞可辨識抗原提呈細(xì)胞，維持機(jī)體正常免疫功能，主要分為Th1和Th2兩個亞型，Th1型包括IL-2、TNF-α、IFN-γ；Th2型包括IL-6、IL-9等[12]。IFN-γ具有抗病毒、抑制細(xì)胞增殖、調(diào)節(jié)免疫及抗腫瘤作用；TNF-α主要由活化的巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞及T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生；IL-6由活化巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，可促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖[13]；IL-2由活化T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生，在調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答中具有重要作用[14]。免疫球蛋白是B淋巴細(xì)胞在抗原刺激下轉(zhuǎn)化為漿細(xì)胞，可以產(chǎn)生能與抗原發(fā)生特異性結(jié)合的抗體[15]。其中IgM是分子量最大的免疫球蛋白，具有強(qiáng)大的殺菌、激活補(bǔ)體、免疫調(diào)理和凝集作用；補(bǔ)體C3主要由巨噬細(xì)胞和肝臟合成，在補(bǔ)體經(jīng)典激活途徑和旁路激活途徑中發(fā)揮著重要的作用。注射了環(huán)磷酰胺的小鼠IFN-γ，IL-2，IL-6，TNF-α，IgM，補(bǔ)體C3、C4水平顯著降低，鐵筷子可明顯提高這些因子的含量，特別是高、中劑量組，提示鐵筷子可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞因子，IgM，補(bǔ)體C3、C4來調(diào)節(jié)機(jī)體免疫能力。

免疫系統(tǒng)是一個復(fù)雜的綜合體，其調(diào)節(jié)可能受多種因素的影響，前期課題組在對類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的研究中，鐵筷子的免疫抑制作用并不是其治療的主要途徑。本次實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)鐵筷子具有增強(qiáng)免疫的能力，可通過提高胸腺指數(shù)、巨噬細(xì)胞吞噬能力以及調(diào)節(jié)體內(nèi)細(xì)胞因子，IgM，補(bǔ)體C3、C4的水平，RBC、WBC數(shù)量來增強(qiáng)機(jī)體免疫能力，改善免疫抑制狀態(tài)。