高效液相色譜法測(cè)水果罐頭的四種合成著色劑

◎ 張志輝

（昭通市質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督綜合檢測(cè)中心，云南 昭通 657000）

國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中合成著色劑》（GB 5009.35—2016）中規(guī)定，采用聚酰胺吸附法和液-液分配法測(cè)定合成著色劑，聚酰胺吸附法操作煩瑣，液-液分配法只適用于赤蘚紅的測(cè)定[1]。本文采用高效液相色譜-二極管陣列多波長(zhǎng)檢測(cè)法檢測(cè)檸檬黃、莧菜紅、胭脂紅、日落黃4種人工合成著色劑，此方法可大大提高檢測(cè)靈敏度，并有效克服254 nm處的梯度洗脫時(shí)造成的基線漂移問(wèn)題，提高了檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性和精密度，簡(jiǎn)化操作步驟，縮短檢驗(yàn)時(shí)間，提高檢驗(yàn)效率，并保證檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

1 材料與方法

1.1 儀器設(shè)備

高效液相色譜儀（LC20AB，島津公司），配有二極管陣列檢測(cè)器；電子天平0.1 mg（AL204、梅特勒-托利多）；勻漿機(jī)（IKA T25）；電子恒溫水浴鍋（HWS12、上海一恒）；超純水機(jī)（Milli-Q Direct16）；3 000 r·min-1離心機(jī)（TGL16、長(zhǎng)沙英泰）；0.45 μm水性過(guò)濾膜、固相萃取裝置。

1.2 材料與試劑

水果罐頭：蘋(píng)果、櫻桃、梨、桃，4個(gè)批次；標(biāo)準(zhǔn)溶液（中國(guó)計(jì)量研究院）：檸檬黃（批號(hào)：GBW（E）100001a）、莧菜紅（批號(hào)：GBW（E）100002a）、日落黃（批號(hào)：GBW（E）100003a）、胭脂紅（批號(hào)：GBW（E）100004a），濃度為0.5 mg·mL-1；分析純類：無(wú)水乙醇、氨水、鹽酸、乙酸銨；色譜純類：甲醇；固相萃取柱。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)液配制

精準(zhǔn)量取0.5 mg·mL-1混標(biāo)1 mL于10 mL容量瓶中，用純水定容，得50 μg·mL-1標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，取2.5 mL于25 mL容量瓶定容得5 μg·mL-1混標(biāo)。取0.2 mL、0.4 mL、0.8 mL、2.0 mL、6.0 mL和10 mL于10 mL容量瓶定容，得 0.100 μg·mL-1、0.200 μg·mL-1、0.400 μg·mL-1、1.00 μg·mL-1、3.00 μg·mL-1和 5.00 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)梯度液。

1.3.2 色譜條件

流動(dòng)相：A相為甲醇，B相為0.02 mol·L-1乙酸銨溶液；梯度洗脫設(shè)置詳見(jiàn)表1。流速：1.0 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)：檸檬黃428 nm、莧菜紅521 nm、胭脂紅509 nm、日落黃483 nm；色譜柱：Diamonsil-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

1.3.3 樣品處理方法

將樣品攪碎均勻，稱取2 g樣品（精確至0.000 1 g）放入離心管中，加10 mL無(wú)水乙醇-氨水溶液（7∶3），渦旋0.5 min后在3 000 r·min-1離心機(jī)離心10 min，上清液用玻璃漏斗過(guò)濾收集，剩余殘?jiān)僦貜?fù)3次，收集濾液約40 mL，置于恒溫水浴鍋蒸發(fā)約2 mL。用2%的氨水調(diào)pH值為8，轉(zhuǎn)移到固相萃取柱。甲醇和水預(yù)處理過(guò)，依次用3mL pH值為8的水和pH值為8的50%甲醇清洗萃取柱，丟棄全部流出液。再用10 mL鹽酸-乙醇溶液（1∶1）將著色劑洗脫出萃取柱，收集洗脫濾液，氨水調(diào)節(jié)pH至7，80 ℃水浴蒸干，冷卻后用50%甲醇定容到10 mL，用0.45 μm 濾膜過(guò)濾進(jìn)樣[2-8]。

2 結(jié)果與分析

2.1 試驗(yàn)結(jié)果

在1.3色譜條件下，標(biāo)液過(guò)0.45 μm濾膜，進(jìn)樣10 μL，測(cè)得合成著色劑檸檬黃、莧菜紅、胭脂紅、日落黃保留時(shí)間分別為3.657 min、4.543 min、7.037 min、9.010 min。

根據(jù)進(jìn)樣色譜圖和《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中合成著色劑的測(cè)定》（GB 5009.35—2016）中計(jì)算公式得到蘋(píng)果、櫻桃、梨和桃（2.032 3 g）中4種著色劑檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表2。檸檬黃檢出限為1.80 μg·mL-1、莧菜紅檢出限為 1.48 μg·mL-1、胭脂紅檢出限為 1.36 μg·mL-1、日落黃檢出限為 0.20 μg·mL-1。

表2 水果罐頭中4種合成著色劑檢測(cè)結(jié)果表（單位：μg·mL-1）

2.2 加標(biāo)回收率及精密度實(shí)驗(yàn)

在10 g糖水蘋(píng)果中，加入適量低（10 μg·mL-1）、中（20 μg·mL-1）、高（30 μg·mL-1）濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，平行添加3份，進(jìn)行加標(biāo)回收率試驗(yàn)。過(guò)濾后進(jìn)行HPLC分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)詳見(jiàn)表3。結(jié)果顯示，4種合成著色劑的回收率均在91.9%及以上，萃取效率好。進(jìn)行6次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.59%～4.62%，均小于5%，精密度高。

表3 檸檬黃、芥菜紅、胭脂紅、日落黃加標(biāo)回收率和相對(duì)偏差表（n=6）

3 結(jié)論

對(duì)水果罐頭進(jìn)行前處理時(shí)，若用GB/T 5009.35—2016里的聚酰胺吸附法，難以抽濾且會(huì)洗脫不完全。實(shí)驗(yàn)中加入無(wú)水乙醇-氨水溶液進(jìn)行蒸發(fā)濃縮，不需吸附和解吸附，進(jìn)行煩瑣處理，可以減少操作過(guò)程中因溫度、pH值、吸附及解吸附等對(duì)合成著色劑的破壞，從而降低損失。 選用無(wú)水乙醇-氨水溶液作為提取溶劑，提高了合成著色劑的溶出率，進(jìn)而提高了回收率。本次實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)水果罐頭中合成著色劑在梯度洗脫條件下，通過(guò)降低有機(jī)相的比例，使保留時(shí)間延長(zhǎng)，從而測(cè)定峰面積，使這4種色素得到很好的分離。在加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，濃度為20 μg·mL-1時(shí)回收率較高。采用水果罐頭作研究對(duì)象，通過(guò)對(duì)樣品前處理及梯度洗脫條件的優(yōu)化，建立了一種測(cè)定合成著色劑的方法。此法簡(jiǎn)單、快捷、準(zhǔn)確、回收率高，為檢測(cè)大批量樣品提供依據(jù)，能提高工作效率，節(jié)省檢驗(yàn)時(shí)間。