南瓜爛果病病原菌的分離與鑒定

劉文杰 王文政 羅 蘭*

（1 青島農(nóng)業(yè)大學(xué)植物醫(yī)學(xué)學(xué)院，山東省植物病蟲害綜合防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東青島 266109；2 濰坊職業(yè)學(xué)院，山東濰坊 262737）

南瓜為葫蘆科南瓜屬（Cucurbita）一年生草本植物，在世界范圍內(nèi)廣泛栽培，有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和觀賞價(jià)值（林德佩，2000）。南瓜果實(shí)營(yíng)養(yǎng)豐富，在蔬菜中淀粉含量?jī)H次于豆類及薯芋類作物，并含有較高的VC和蛋白質(zhì)，其加工品深受糖尿病患者歡迎（胡金宏和張珉，2016）。據(jù)FAO統(tǒng)計(jì)，2020年全球南瓜產(chǎn)量超過2 000萬t，而我國(guó)的南瓜產(chǎn)量約占世界總產(chǎn)量的50%（梁偉 等，2021）。南瓜不僅生長(zhǎng)期間受到植物病原菌的侵染（曾臘春和李臘生，2010），采后貯藏期間同樣也會(huì)受到真菌侵染造成爛果，而且損失遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于生長(zhǎng)期，嚴(yán)重影響其經(jīng)濟(jì)價(jià)值（韋瑩瑩 等，2012）。2019年露地蔬菜化肥農(nóng)藥雙減研究課題組對(duì)山東省青島膠州采集的南瓜進(jìn)行貯藏期間的病害調(diào)查及病原菌分離，并對(duì)致病性進(jìn)行初步研究，以期為南瓜采后病害的防治提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病原菌的分離

南瓜爛果樣品于2019年9月采自山東省青島市膠州市西安家溝村，南瓜品種為蜜罐。采用組織塊分離法，并在病處挑取少量菌絲體，轉(zhuǎn)入PDA平板，28 ℃培養(yǎng)，待長(zhǎng)出菌絲后，挑取少量菌絲在PDA培養(yǎng)基上進(jìn)一步純化，根據(jù)形態(tài)學(xué)觀察和致病性確定為2個(gè)菌株，分別命名為Fn和Rn，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 病原菌的鑒定

1.2.1 形態(tài)學(xué)觀察 在PDA平板上活化菌株，挑取少量菌絲于光學(xué)顯微鏡下鏡檢。參考許志剛（2009）的方法觀察病原菌形態(tài)特征，并對(duì)病原菌進(jìn)行鑒定，初步明確菌株的分類地位。

1.2.2 致病性測(cè)定 采用針刺法接種。先將南瓜洗凈，75%乙醇表面消毒，晾干后接種培養(yǎng)好的菌株Fn和Rn菌餅，每個(gè)瓜接種3處，以不接種為對(duì)照，每處理1個(gè)瓜，重復(fù)3次，用脫脂棉保濕48 h。觀察和記錄南瓜果實(shí)的發(fā)病情況。同時(shí)，對(duì)發(fā)病部位組織進(jìn)行再分離和鏡檢，比對(duì)其形態(tài)特征是否與接種的菌株一致。

1.2.3 分子生物學(xué)鑒定 利用生工生物工程（上海）股份有限公司DNA快速抽提試劑盒進(jìn)行Fn和Rn菌株基因組DNA的提取，并以此為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物為ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）。采 用25 μL PCR反應(yīng)體系：ddH2O 17.25 μL、10× EasyTaqBuffer 2.5 μL、dNTPs（2.5 mmol·L-1）2 μL、引物ITS1 1 μL、引 物ITS4 1 μL、DNA 1 μL、EasyTaqDNA Polymerase 0.25 μL。反應(yīng)程序：94 ℃，3 min；94 ℃ 45 s，58 ℃ 45 s，72 ℃ 40 s，34個(gè)循環(huán)；72 ℃，10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，由生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。將獲得序列在NCBI中進(jìn)行BLAST比對(duì)，采用MEGA 7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，確定菌株的分類地位（劉娟，2014）。

2 結(jié)果與分析

2.1 南瓜爛果病病原菌的分離

從自然發(fā)病的南瓜果實(shí)上分離、純化得到2種病原菌，分別編號(hào)為Fn和Rn。Fn在南瓜果實(shí)上形成的病斑凹陷，輪紋狀，病斑上有白色的菌絲及孢子（圖1-a）；Fn在PDA培養(yǎng)基上形成白色菌落，呈放射狀生長(zhǎng)，氣生菌絲較豐富（圖1-b）。Rn在南瓜果實(shí)上形成的病斑為軟腐，按壓易破裂，病斑上著生繁茂的灰白色菌絲，菌絲生長(zhǎng)速度快，肉眼可見球形或近球形孢子囊（圖2-a）；Rn在PDA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)迅速，初期為白色菌落（圖2-b），后期產(chǎn)生黑色孢子囊。

圖1 南瓜爛果病的癥狀與菌株Fn菌落形態(tài)

圖2 南瓜爛果病的癥狀與菌株Rn菌落形態(tài)

2.2 致病性測(cè)定

菌株Fn接種5 d后開始出現(xiàn)病斑，病斑下陷，但不軟腐，其上產(chǎn)生菌絲及孢子，隨著時(shí)間延長(zhǎng)病斑進(jìn)一步擴(kuò)展（圖3），鏡檢為鐮刀菌，發(fā)病癥狀與貯藏期自然發(fā)病癥狀一致。菌株Rn接種后初期出現(xiàn)水漬狀腐爛，病斑擴(kuò)展很快，5 d后產(chǎn)生豐富的菌絲及肉眼可見的孢子囊，接種8 d后整個(gè)南瓜果實(shí)基本腐爛（圖4），鏡檢為根霉菌，發(fā)病癥狀與貯藏期自然發(fā)病癥狀一致。因此確定菌株Fn和Rn為引起南瓜爛果病的病原菌。

圖3 菌株Fn回接后南瓜發(fā)病癥狀

圖4 菌株Rn回接后南瓜發(fā)病癥狀

2.3 致病菌的鑒定

2.3.1 形態(tài)學(xué)鑒定 菌株Fn在PDA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)緩慢，菌落為白色。經(jīng)顯微鏡觀察，菌絲有隔，分生孢子梗短、無色（圖5-a）；大型分生孢子多細(xì)胞，鐮刀形；小型分生孢子單細(xì)胞，橢圓形至卵圓形（圖5-b）。初步鑒定菌株Fn為鐮刀菌（Fusariumspp.）。

圖5 菌株Fn分生孢子梗和分生孢子的形態(tài)

菌株Rn在PDA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)迅速，菌絲茂盛，初期為白色菌落，后期產(chǎn)生肉眼可見黑色孢子囊。經(jīng)顯微鏡觀察，菌絲無隔，具假根（圖6-a），孢囊梗直立，頂端產(chǎn)生孢子囊，孢囊孢子近球形（圖6-b）。初步鑒定菌株Rn為根霉菌（Rhizopusspp.）。

圖6 菌株Rn假根、孢囊梗和孢囊孢子的形態(tài)

2.3.2 分子生物學(xué)鑒定 菌株Fn的rDNAITS序列長(zhǎng)度為530 bp（GenBank的登錄號(hào)為MW467589）。利用Mega 7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖7），菌株Fn與腐皮鐮刀菌Fusarium solani（GenBank的登錄號(hào)為L(zhǎng)C318412.1）在同一分支上，相似度99.24%。結(jié)合形態(tài)學(xué)特征，確定菌株Fn屬于腐皮鐮刀菌Fusarium solani。

圖7 基于rDNA-ITS序列構(gòu)建的菌株Fn的系統(tǒng)發(fā)育樹

菌株Rn的rDNA-ITS序列長(zhǎng)度為851 bp（GenBank的登錄號(hào)為MW467979）。利用Mega 7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖8），菌株Rn與匍枝根霉菌Rhizopus stolonifer（GenBank的登錄號(hào)為KM203865.1）在同一分支上，相似度98.26%。結(jié)合形態(tài)學(xué)特征，確定菌株Rn屬于匍枝根霉菌Rhizopus stolonifer。

圖8 基于rDNA-ITS序列構(gòu)建的菌株Rn的系統(tǒng)發(fā)育樹

3 討論與結(jié)論

本試驗(yàn)從發(fā)病南瓜果實(shí)上分離獲得Fn菌株和Rn菌株，通過對(duì)其進(jìn)行致病性測(cè)定和柯赫氏法則驗(yàn)證，明確其為南瓜爛果病的病原菌，可以在機(jī)械傷害存在的條件下，通過傷口侵染引起南瓜果實(shí)腐爛。經(jīng)形態(tài)學(xué)及分子生物學(xué)鑒定，F(xiàn)n菌株和Rn菌株分別為腐皮鐮刀菌（Fusarium solani）和匍枝根霉菌（Rhizopus stolonifer）。

鐮刀菌種類較多，分為腐生性和寄生性兩類，寄生性的鐮刀菌是世界范圍內(nèi)分布廣泛的一類真菌，寄主范圍廣，侵染能力強(qiáng)，可侵染植物的根、莖、穗和果實(shí)，引起植物的根腐、莖腐等多種病害，如植物生長(zhǎng)期間的大白菜枯萎病（閆文雪 等，2018），貯藏期間的馬鈴薯干腐病和芋艿爛果病（楊波 等，2019；趙璐藐 等，2020）。但有關(guān)腐皮鐮刀菌（Fusarium solani）引起南瓜貯藏期病害鮮有報(bào)道。鐮刀菌產(chǎn)生的毒素是危險(xiǎn)的食品污染物，對(duì)人畜健康造成嚴(yán)重危害。其毒素的種類及特性有待進(jìn)一步的研究。

根霉菌是實(shí)驗(yàn)室常見污染菌，還是條件致病菌，可引起食品霉變，在自然界普遍分布且寄主范圍廣泛，常造成多種水果如柑橘、桃、蜜瓜、葡萄、棗、草莓等及甘薯的采后腐爛（胡光耀 等，2019；陳江華 等，2020），但引起南瓜果實(shí)腐爛未見報(bào)道。南瓜在我國(guó)種植面積較大，采后病害不容小覷，在采收時(shí)應(yīng)注意不要造成傷口，貯藏期間保持低溫干燥，有關(guān)引起南瓜果實(shí)腐爛的其他病原微生物還有待進(jìn)一步的調(diào)查與鑒定。

本文是由腐皮鐮刀菌和匍枝根霉菌引起南瓜爛果病的首次報(bào)道。