GABA和CaCl2復(fù)配對(duì)鹽堿脅迫下番茄幼苗生長(zhǎng)、葉綠素?zé)晒鈪?shù)和活性氧的影響

陳光鑫 丁 棟 李 倩 陳迎雪 王葉寧 呂晨希 高洪波 吳曉蕾

（河北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，河北保定 071001）

土壤鹽堿化現(xiàn)象是世界性生態(tài)和資源問(wèn)題，嚴(yán)重限制了農(nóng)業(yè)的發(fā)展。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，我國(guó)鹽堿化土壤面積約為990萬(wàn)hm2（張?bào)w彬 等，2017），特別是在我國(guó)北方地區(qū)，鹽堿脅迫已成為制約農(nóng)作物產(chǎn)量和品質(zhì)的主要非生物脅迫因素之一（姜偉，2010）。土壤鹽堿化主要受自然和人為因素共同影響（Li et al.，2015），設(shè)施栽培環(huán)境由于相對(duì)封閉，復(fù)種指數(shù)高，土壤更易受化肥過(guò)量施用及灌溉不足影響而引發(fā)次生鹽堿化（Li et al.，2015）。不同于中性鹽脅迫，鹽堿脅迫除引起植物失水萎蔫、營(yíng)養(yǎng)失衡及離子毒害外，還會(huì)造成高pH脅迫（Yang et al.，2007），從而對(duì)植物造成更大的傷害。因此，如何有效緩解鹽堿脅迫已成為備受關(guān)注的課題。

番茄（Solanum lycopersicumL.）是我國(guó)廣泛栽培的一種重要園藝作物。作為番茄生產(chǎn)大國(guó)，2017年我國(guó)番茄種植面積為132萬(wàn)hm2，其中近50%為設(shè)施栽培。番茄屬中度鹽敏感型園藝作物（Katerji et al.，2000），隨著設(shè)施土壤鹽堿化的日益加重，對(duì)番茄產(chǎn)量和品質(zhì)形成了較大的威脅。以往的研究大多集中于鹽脅迫對(duì)植物產(chǎn)生的影響（羅達(dá) 等，2019；蘇蘭茜 等，2019），針對(duì)植物鹽堿脅迫的響應(yīng)機(jī)制研究還較少。在緩解鹽堿脅迫方面，外源物質(zhì)的添加是提高鹽堿脅迫下植物耐性和作物產(chǎn)量的一種簡(jiǎn)單有效的方法（Jin et al.，2019；趙穎 等，2020）。γ-氨基丁酸（GABA）是動(dòng)物、植物中廣泛存在的一種天然的非蛋白氨基酸，在植物中，GABA作為一種代謝物或信號(hào)分子在脅迫條件下的許多生理過(guò)程中發(fā)揮重要作用（Lang et al.，2016；Zhen et al.，2018），內(nèi)源GABA可受鹽刺激和外源GABA誘導(dǎo)的影響，提高植物抗鹽脅迫能力（Shelp et al.，2012；Fa?s et al.，2015）。鈣作為植物必需的大量營(yíng)養(yǎng)元素之一以及胞內(nèi)重要的第二信使，對(duì)于植物逆境響應(yīng)非常重要（陳立松和劉星輝，1997）。有研究表明施用外源鈣可以降低植物吸收Na+的能力、改善細(xì)胞對(duì)鹽的適應(yīng)能力（朱義等，2007）。谷氨酸脫羧酶（GAD）是GABA支路中合成GABA的限速酶（Inatomi &Slaughter，1971），在其C-末端有與鈣調(diào)素結(jié)合區(qū)域（Yin et al.，2015），而逆境脅迫會(huì)造成植物胞內(nèi)或胞外Ca2+濃度積累從而激活GAD，誘導(dǎo)GABA大量積累（Kinnersley &Turano，2000）。但Ca2+在GABA誘導(dǎo)植物抗逆中的具體作用機(jī)制尚不清楚。

為此，在前期針對(duì)GABA提高番茄耐鹽性研究的基礎(chǔ)上（羅黃穎 等，2011），本試驗(yàn)以鹽敏感型番茄品種中雜9號(hào)為試材（Hu et al.，2009），采用表型差異顯著的鹽堿脅迫濃度（60 mmol ·L-1NaCl+60 mmol·L-1NaHCO3）（梁楊楊 等，2016），研究單獨(dú)添加GABA和CaCl2及兩者復(fù)配組合對(duì)鹽堿脅迫下番茄幼苗生長(zhǎng)、葉綠素?zé)晒夂突钚匝醯戎笜?biāo)的影響，探討外源GABA和鈣在提高番茄耐鹽堿性過(guò)程中相互作用的生理調(diào)節(jié)機(jī)制，為生產(chǎn)中外源物質(zhì)施用提高番茄耐鹽堿性及相關(guān)制劑開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供理論和實(shí)踐依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試材培養(yǎng)與鹽堿脅迫處理

本試驗(yàn)在河北農(nóng)業(yè)大學(xué)西校區(qū)園藝學(xué)院試驗(yàn)溫室內(nèi)進(jìn)行，供試番茄品種為中雜9號(hào)，購(gòu)自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所。GABA購(gòu)自美國(guó)Sigma-Adrich公 司，CaCl2、NaCl、NaHCO3均 為分析純?cè)噭?。前期預(yù)備試驗(yàn)已篩選出差異顯著的鹽堿脅迫處理濃度。2018年5月23日，將番茄種子催芽后，采用72孔穴盤(pán)，使用草炭、珍珠巖混配基質(zhì)進(jìn)行育苗，澆灌Hoagland’s營(yíng)養(yǎng)液（pH值6.5，EC值1.8 mS·cm-1）。6月20日，選取整齊一致且長(zhǎng)勢(shì)良好的四葉一心幼苗，洗去幼苗根部基質(zhì)，定植于容積20 L的灰色塑料盆中進(jìn)行水培，用充氧泵及時(shí)補(bǔ)充氧氣，保證番茄幼苗正常生長(zhǎng)。用Hoagland’s營(yíng)養(yǎng)液預(yù)培養(yǎng)3 d后，設(shè)置如下10個(gè)配方進(jìn)行水培（表1）。每處理3盆，每盆定植50株番茄幼苗。處理后不同時(shí)間內(nèi)取樣測(cè)定幼苗的生長(zhǎng)及生理指標(biāo)，生長(zhǎng)指標(biāo)每處理取樣10株，生理指標(biāo)取樣6株，3次重復(fù)。

表1 處理編號(hào)及具體處理配方

1.2 測(cè)定指標(biāo)和方法

在處理0、2、4、6 d，每處理固定選取10株幼苗測(cè)定株高、莖粗，株高測(cè)量部位為幼苗莖基部至頂部生長(zhǎng)點(diǎn)，株高生長(zhǎng)速率按公式〔（測(cè)定株高-前一次測(cè)定株高）/前一次測(cè)定株高×100%〕計(jì)算；莖粗測(cè)量部位為莖基部以上2 cm，莖粗生長(zhǎng)速率按〔（測(cè)定莖粗-前一次測(cè)定莖粗）/前一次測(cè)定莖粗×100%〕計(jì)算。在處理0、2、4、6 d，每處理選取均勻一致的10株幼苗，采用LA-S根系掃描儀測(cè)定根長(zhǎng)和根數(shù)，生長(zhǎng)速率計(jì)算公式同上。于處理6 d后，每處理選取10株幼苗，稱(chēng)量全株鮮質(zhì)量，在烘箱內(nèi)105 ℃下殺青10 min后在80 ℃烘干至恒重，測(cè)定植株干質(zhì)量。于處理6 d后，每處理隨機(jī)選取6株幼苗，采用葉色指數(shù)儀（SPAD-502 Plus，日本）測(cè)定從上向下數(shù)第3片展開(kāi)葉片SPAD值（葉色指數(shù)），葉綠素?zé)晒鈨x（FluorCam開(kāi)放式葉綠素?zé)晒獬上裣到y(tǒng)，捷克）測(cè)定從上向下數(shù)第3片展開(kāi)葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)。于處理2、4、6 d，每處理隨機(jī)選取6株幼苗從上向下數(shù)第3、4片展開(kāi)葉片，參照Thordal-Christensen等（1997）的方法測(cè)定超氧陰離子產(chǎn)生速率和H2O2含量。

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用Excel 2007和SAS 8.1軟件進(jìn)行處理和統(tǒng)計(jì)分析，各測(cè)定數(shù)據(jù)均源于3次測(cè)試重復(fù)結(jié)果的平均值。采用單因素和Duncan’s法進(jìn)行方差分析和差異顯著性比較（P＜0.05），利用Excel軟件繪圖，圖表中數(shù)據(jù)為平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)誤。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同GABA和CaCl2 復(fù)配組合對(duì)鹽堿脅迫下番茄幼苗生長(zhǎng)的影響

2.1.1 不同GABA和CaCl2復(fù)配組合對(duì)鹽堿脅迫下番茄幼苗株高和莖粗生長(zhǎng)速率的影響 由圖1-A可知，在整個(gè)處理過(guò)程中，SA處理的幼苗株高生長(zhǎng)速率均顯著低于對(duì)照，降低幅度隨脅迫時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸增加，分別達(dá)到39.3%、58.3%、67.8%。外源CaCl2和GABA單獨(dú)處理和復(fù)配處理均可有效緩解鹽堿脅迫對(duì)番茄幼苗生長(zhǎng)的抑制作用，促進(jìn)株高生長(zhǎng)速率增加。其中CaCl2處理中以SA +Ca6處理的株高生長(zhǎng)速率較高，較SA處理提高了24.1%～50.2%，差異顯著；GABA處理中以SA +GABA5處理的株高生長(zhǎng)速率較高，較SA處理提高了23.0%～55.3%，差異顯著；復(fù)配組合中以SA +Ca6+GABA5的株高生長(zhǎng)速率最高，較SA處理提高幅度呈隨脅迫時(shí)間延長(zhǎng)而上升的趨勢(shì)，在處理6 d時(shí)達(dá)到79.6%。

如圖1-B所示，與對(duì)照相比，鹽堿脅迫顯著抑制了番茄幼苗莖粗的增加，處理2、4、6 d時(shí)降低幅度分別達(dá)到67.8%、77.8%和80.4%，呈現(xiàn)出隨脅迫時(shí)間延長(zhǎng)降低幅度逐漸增大的趨勢(shì)。外源CaCl2和GABA單獨(dú)處理和復(fù)配處理均可促進(jìn)幼苗莖粗的增加，但提高幅度差異較大。其中以SA+Ca3+GABA5、SA+Ca6+GABA5復(fù) 配組合效果較好，在整個(gè)處理過(guò)程中莖粗生長(zhǎng)速率均高于其他單獨(dú)組合和復(fù)配組合，相較于SA處理莖粗生長(zhǎng)速率分別提高了100.9%～138.6%和103.9%～148.4%，并且相較于其他組合，在脅迫6 d時(shí)依然保持了較高的莖粗生長(zhǎng)速率。

圖1 鹽堿脅迫下不同GABA和CaCl2 復(fù)配組合的株高和莖粗生長(zhǎng)速率

2.1.2 不同GABA和CaCl2復(fù)配組合對(duì)鹽堿脅迫下番茄幼苗根長(zhǎng)和根數(shù)生長(zhǎng)速率的影響 由圖2-A可以看出，SA處理對(duì)于幼苗根系伸長(zhǎng)有顯著的抑制作用，表現(xiàn)為根長(zhǎng)生長(zhǎng)速率隨處理時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸下降，整個(gè)脅迫過(guò)程中較對(duì)照降低86.3%、91.9%和94.8%。與SA處理相比，在脅迫6 d時(shí)，2個(gè)濃度的外源GABA單獨(dú)處理對(duì)于根長(zhǎng)生長(zhǎng)速率的提升達(dá)到4倍以上，而外源CaCl2單獨(dú)處理對(duì)于根長(zhǎng)生長(zhǎng)率的提升僅為2.8倍，表明外源GABA對(duì)于根長(zhǎng)的緩解作用更好。單獨(dú)處理的2個(gè)濃度相比，較高濃度的CaCl2和GABA效果均好于較低濃度。復(fù)配組合中以SA+Ca6+GABA5的根長(zhǎng)生長(zhǎng)速率最高，在脅迫6 d時(shí)依然保持了較高的增長(zhǎng)速率，達(dá)到SA處理的6.9倍，且在處理4 d和6 d時(shí)，顯著高于其他外源添加處理。

圖2 鹽堿脅迫下不同GABA和CaCl2 復(fù)配組合的根長(zhǎng)和根數(shù)生長(zhǎng)速率

SA處理對(duì)于幼苗根數(shù)的增加也有顯著的抑制作用，與對(duì)照相比，根數(shù)生長(zhǎng)速率的降低幅度分別達(dá)到55.0%、71.4%和82.6%（圖2-B）。處理6 d時(shí)復(fù)配組合對(duì)于根數(shù)的增加作用好于外源GABA單獨(dú)處理，而外源GABA單獨(dú)處理好于外源CaCl2單獨(dú)處理，最優(yōu)復(fù)配組合為SA+Ca6+GABA5，整個(gè)處理期間的根數(shù)生長(zhǎng)速率最高，其次為SA+Ca6+GABA2.5處理，且2個(gè)處理間差異不顯著。

2.1.3 不同GABA和CaCl2復(fù)配組合對(duì)鹽堿脅迫下番茄幼苗干、鮮質(zhì)量的影響 由表2可知，SA處理的番茄幼苗鮮質(zhì)量和干質(zhì)量與對(duì)照存在顯著差異，其中鮮質(zhì)量較對(duì)照降低了32.9%，干質(zhì)量則下降了13.2%，說(shuō)明鹽堿脅迫對(duì)于植株鮮質(zhì)量的影響大于對(duì)干質(zhì)量的影響。與SA處理相比，無(wú)論是外源GABA單獨(dú)處理、外源CaCl2單獨(dú)處理，還是復(fù)配處理，均顯著增加了幼苗的鮮質(zhì)量；除SA +Ca3+GABA2.5處理外，各外源添加處理的干質(zhì)量均顯著高于SA處理。復(fù)配處理中以SA+Ca6 +GABA5效果最好，較SA處理鮮質(zhì)量提高27.7%，干質(zhì)量提高12.1%。

表2 不同GABA和CaCl2 復(fù)配組合對(duì)鹽堿脅迫下番茄幼苗干、鮮質(zhì)量的影響

2.2 不同GABA和CaCl2 復(fù)配組合對(duì)鹽堿脅迫下番茄幼苗葉色指數(shù)和葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響

由表3可以看出，SA處理的幼苗葉片葉色指數(shù)顯著低于對(duì)照和其他外源添加處理，其中較對(duì)照降低了30.8%。外源GABA單獨(dú)處理中SA +GABA5的葉色指數(shù)較SA+GABA2.5顯著提高，外源CaCl2單獨(dú)處理中SA+Ca6效果好于SA +Ca3。復(fù)配處理中SA+Ca3+GABA5葉色指數(shù)最高，其次為SA+Ca6+GABA5處理，且兩者差異不顯著。

表3 不同GABA和CaCl2 復(fù)配組合對(duì)鹽堿脅迫下番茄幼苗葉色指數(shù)和葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響

SA處理的幼苗葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)與對(duì)照差異顯著，表明鹽堿脅迫對(duì)幼苗葉片光合系統(tǒng)造成了傷害，主要表現(xiàn)為Fv/Fm、ETR、φPS Ⅱ、qP的顯著降低，而NPQ則顯著上升。各外源添加處理均可顯著影響鹽堿脅迫下幼苗葉片的葉綠素?zé)晒鈪?shù)，SA+GABA5處理對(duì)于葉綠素?zé)晒庀到y(tǒng)傷害的緩解效果好于2個(gè)外源CaCl2單獨(dú)處理，表現(xiàn)為ETR顯著高于2個(gè)外源CaCl2單獨(dú)處理，F(xiàn)v/Fm、φPS Ⅱ、qP在各單獨(dú)處理中最高。復(fù)配處理中以SA+Ca6+GABA5和SA+Ca3+GABA5效 果較好，除NPQ外，兩者之間沒(méi)有顯著差異。

2.3 不同GABA和CaCl2 復(fù)配組合對(duì)鹽堿脅迫下番茄幼苗活性氧代謝的影響

如圖3-A所示，鹽堿脅迫處理顯著提高了番茄葉片H2O2含量，整個(gè)處理過(guò)程中SA處理較對(duì)照H2O2含量增加94.5%～127.1%，說(shuō)明鹽堿脅迫對(duì)植株葉片細(xì)胞造成了嚴(yán)重傷害。與SA處理相比，外源添加GABA和CaCl2均可顯著降低葉片中H2O2含量。與CaCl2單獨(dú)處理相比，GABA單獨(dú)處理對(duì)于H2O2的清除具有更強(qiáng)的持續(xù)性，整個(gè)處理期間H2O2含量降低幅度均超過(guò)20%。復(fù)配處理中SA+Ca6+GABA5對(duì)于H2O2的清除作用最強(qiáng)，H2O2含量降低幅度達(dá)到32.5%～39.5%。

圖3 鹽堿脅迫下不同GABA和CaCl2復(fù)配組合的過(guò)氧化氫含量和超氧陰離子產(chǎn)生速率

3 討論與結(jié)論

生物量降低是鹽脅迫下植物最明顯的表型體現(xiàn)（王素平 等，2006）。鹽堿脅迫誘導(dǎo)滲透脅迫和氧化脅迫，干擾植物代謝，進(jìn)而限制植物生長(zhǎng)發(fā)育。已有報(bào)道指出外源CaCl2可顯著提高鹽脅迫下大蒜幼苗的株高和根長(zhǎng)（Chen et al.，2011）。河北農(nóng)業(yè)大學(xué)設(shè)施蔬菜課題組前期研究表明，外源GABA施用可提高鹽堿脅迫下番茄幼苗地上部和地下部鮮質(zhì)量（梁楊楊 等，2016）。本試驗(yàn)中，GABA和CaCl2單獨(dú)使用均有利于鹽堿脅迫下番茄幼苗生長(zhǎng)，表現(xiàn)為株高、莖粗、根長(zhǎng)和根數(shù)生長(zhǎng)速率以及干鮮質(zhì)量的提升。GABA和CaCl2存在濃度效應(yīng)，整體表現(xiàn)為高濃度（6 mmol·L-1CaCl2、5 mmol ·L-1GABA）好于低濃度（3 mmol·L-1CaCl2、2.5 mmol·L-1GABA）?？傮w來(lái)看，添加5 mmol·L-1GABA對(duì)于生物量的提升效果好于添加6 mmol ·L-1CaCl2的處理，說(shuō)明對(duì)于上述濃度來(lái)說(shuō)，GABA對(duì)于鹽堿脅迫的緩解作用大于CaCl2，可能的原因是選用的CaCl2單獨(dú)處理濃度還未達(dá)最適濃度。與單獨(dú)添加處理相比，4個(gè)復(fù)配組合在不同程度上緩解了鹽堿脅迫對(duì)幼苗生長(zhǎng)的抑制，其中表現(xiàn)最好的是SA+Ca6+GABA5處理，在外源添加處理中幼苗生長(zhǎng)指標(biāo)均達(dá)最高，SA+Ca3+GABA5處理表現(xiàn)次之，且在多個(gè)時(shí)間點(diǎn)與SA+Ca6+GABA5處理無(wú)顯著差異。由此可以看出，合理濃度的復(fù)配處理整體較單獨(dú)處理提高了番茄幼苗的耐鹽堿性，并且緩解效果主要?dú)w功于GABA，當(dāng)選用較高濃度GABA與不同濃度CaCl2復(fù)配時(shí)，其組合效果均較好，CaCl2濃度的高低對(duì)于復(fù)配組合的影響較小。

葉綠素對(duì)光合作用至關(guān)重要。光合能力下降是鹽堿脅迫下植物生長(zhǎng)受到抑制的主要原因。鹽堿脅迫會(huì)降低葉片的光合作用（Xiang et al.，2016；Radanielson et al.，2018）。植物中葉綠素的生物合成過(guò)程中任何環(huán)節(jié)出現(xiàn)問(wèn)題，葉綠素含量就會(huì)受到影響（Min et al.，2006；Tanaka &Tanaka，2006）。已有研究表明，GABA處理減輕了脅迫引起的光合作用降低，恢復(fù)了葉綠體結(jié)構(gòu)損傷（Xiang et al.，2016）。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)外源CaCl2、GABA單獨(dú)處理和復(fù)配處理均可以達(dá)到顯著改善葉綠素?zé)晒鈪?shù)的效果，雖然復(fù)配處理組合SA+Ca6+GABA5僅在NPQ指標(biāo)上與其他外源添加處理有顯著差異，但其參數(shù)在各處理間均為最優(yōu)，說(shuō)明GABA和CaCl2復(fù)配較單獨(dú)處理可以有效提高番茄葉片光合能力，主要原因在于GABA和CaCl2均可緩解鹽堿脅迫造成的離子毒害，維持良好的營(yíng)養(yǎng)元素吸收，從而維持細(xì)胞氧化還原平衡，促進(jìn)葉綠素的正常合成。

活性氧（ROS）是調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)、代謝和應(yīng)激反應(yīng)的重要信號(hào)分子（Baxter et al.，2014；Liu et al.，2018）。逆境引發(fā)的過(guò)多活性氧產(chǎn)生與細(xì)胞膜損傷和電解質(zhì)滲漏密切相關(guān)（Demidchik et al.，2014）。外源GABA處理能有效地緩解鹽堿脅迫引起的生長(zhǎng)限制和膜脂氧化（Jin et al.，2019），但還沒(méi)有直接證據(jù)表明GABA直接清除ROS來(lái)緩解脅迫傷害。因此猜測(cè)GABA增強(qiáng)脅迫耐受力可能是通過(guò)抗氧化系統(tǒng)介導(dǎo)的。本試驗(yàn)結(jié)果表明，外源GABA可明顯降低鹽堿脅迫下葉片H2O2含量和產(chǎn)生速率。此外，本試驗(yàn)更加關(guān)注的是GABA和CaCl2的復(fù)配效果，其中SA+Ca6+GABA5處理的H2O2含量和產(chǎn)生速率最低，說(shuō)明CaCl2的添加可進(jìn)一步增強(qiáng)GABA對(duì)番茄葉片清除活性氧能力的提高。GABA誘導(dǎo)植物逆境耐性增強(qiáng)與Ca2+調(diào)節(jié)通路密切相關(guān)（Yu et al.，2014）。與鹽脅迫不同的是，鹽堿脅迫造成的高pH環(huán)境會(huì)加劇根系離子吸收的障礙，迫使胞內(nèi)環(huán)境酸化，脅迫條件下胞質(zhì)中Ca2+/CaM和H+濃度上升，均可促進(jìn)GAD的活性使GABA的含量增加（Aurisano et al.，1995）。這也可能是復(fù)配處理效果好于單獨(dú)處理的原因。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，與單獨(dú)添加處理相比，復(fù)配處理SA+Ca6+GABA5對(duì)于鹽堿脅迫傷害的緩解效果更好，說(shuō)明外源CaCl2的添加對(duì)于GABA增強(qiáng)植物耐鹽堿能力有促進(jìn)作用，但其對(duì)于鹽堿脅迫傷害的緩解效應(yīng)并沒(méi)有顯著高于其他復(fù)配處理和單獨(dú)處理，因此認(rèn)為復(fù)配處理表現(xiàn)的是協(xié)同作用而并不是簡(jiǎn)單的疊加關(guān)系，是代謝調(diào)控的結(jié)果。CaCl2可能通過(guò)代謝調(diào)控GABA來(lái)誘導(dǎo)植物提高耐鹽堿能力。因此，外源GABA和CaCl2在抗逆過(guò)程中如何影響內(nèi)源GABA和Ca2+的變化，從而更好地發(fā)揮協(xié)同效應(yīng)還有待進(jìn)一步明確，此外，本試驗(yàn)結(jié)果還為GABA與鈣復(fù)配制劑在鹽堿土生產(chǎn)上的應(yīng)用提供了參考。