低溫弱光下aga2突變體西瓜果實(shí)糖代謝差異表達(dá)基因分析

丁雙玉 任 毅 宮國義 張海英 郭紹貴 于泳濤 李茂營 張 潔 許 勇*

（1 北京農(nóng)學(xué)院植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京 102206；2 北京市農(nóng)林科學(xué)院蔬菜研究中心，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華北地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京蔬菜種質(zhì)改良實(shí)驗(yàn)室，北京 100097）

西瓜（Citrullus lanatus）是我國重要的園藝作物，秋茬栽培西瓜果實(shí)膨大期常出現(xiàn)低溫脅迫導(dǎo)致果實(shí)膨大速度慢，糖度下降，影響西瓜的產(chǎn)量和品質(zhì)。因此，研究低溫影響下西瓜果實(shí)糖分積累的響應(yīng)基因?qū)τ谔岣咔锊缥鞴系漠a(chǎn)量和品質(zhì)具有重要意義。

低溫會(huì)引起作物果實(shí)的生理生化水平發(fā)生變化（Keller &Steffen，1995），其中可溶性糖含量變化是重要的理化指標(biāo)之一（Shao et al.，2013）。關(guān)于低溫引起作物果實(shí)糖分變化的研究已有較多報(bào)道，糖與低溫逆境的關(guān)聯(lián)現(xiàn)象最先在馬鈴薯塊莖上被發(fā)現(xiàn)（Gounaris，2001），而后在甜瓜（郝敬虹等，2009）、番茄（王麗娟和李天來，2011）、黃瓜（Gu et al.，2017）、甘蔗（Selvarajan et al.，2018）中也檢測到果實(shí)可溶性糖含量變化與低溫關(guān)聯(lián)。低溫弱光可降低果實(shí)含糖量，郝敬虹（2009）在甜瓜果實(shí)膨大期進(jìn)行夜間9 ℃處理，結(jié)果表明低溫顯著降低了果糖（Fructose）、葡萄糖（Glucose）、蔗糖（Sucrose）、棉籽糖（Raffinose）和水蘇糖（Stachyose）含量；王麗娟和李天來（2011）發(fā)現(xiàn)，低溫下番茄膨大期果實(shí)中的果糖、葡萄糖和蔗糖含量均較常溫處理下降。

果實(shí)糖分積累與溫度密切相關(guān)，已有研究主要集中于低溫下不同種質(zhì)資源糖代謝酶活性和可溶性糖含量的變化，材料遺傳背景差異較大，尚未利用突變體材料挖掘糖分積累關(guān)鍵基因的表達(dá)和可溶性糖含量的關(guān)系。低溫條件下果實(shí)糖含量變化的分子機(jī)理尚未取得突破，尤其是在西瓜中被低溫抑制的關(guān)鍵糖代謝酶基因調(diào)控果實(shí)糖分積累的分子機(jī)制還鮮見報(bào)道。研究低溫條件下西瓜果實(shí)發(fā)育階段糖代謝關(guān)鍵酶基因的作用及調(diào)控機(jī)制具有重要的理論與實(shí)踐意義。

堿性α-半乳糖苷酶AGA2（alkaline alphagalactosidase）是將西瓜果實(shí)棉籽糖家族寡糖（raffinose family oligosaccharides，RFOs）水解為蔗糖的關(guān)鍵酶（Ren et al.，2021），本試驗(yàn)通過對(duì)低溫弱光條件下aga2突變體果實(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，以期明確aga2果實(shí)在低溫弱光條件下糖含量下降與糖代謝關(guān)鍵酶基因表達(dá)之間的關(guān)系，為西瓜果實(shí)響應(yīng)低溫弱光環(huán)境的糖代謝調(diào)控機(jī)制的建立以及后續(xù)進(jìn)行的遺傳轉(zhuǎn)化奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

aga2是堿性α-半乳糖苷酶（AGA2）基因突變株系，由北京市農(nóng)林科學(xué)院蔬菜研究中心西瓜課題組提供，2019年7月下旬定植于北京市農(nóng)林科學(xué)院蔬菜研究中心試驗(yàn)農(nóng)場，常規(guī)田間生產(chǎn)管理；低溫處理（low temperature，簡稱LT）比正常溫度的對(duì)照（normal temperature，簡稱NT）定植時(shí)間晚7 d，9月下旬開始授粉，授粉后20 d左右開始感受低溫。由于晚7 d定植，低溫處理的aga2果實(shí)生長期間溫度為10～25 ℃，有效積溫700 ℃左右，光照強(qiáng)度為100 μmol·m-2·s-1左右；正常溫度的對(duì)照aga2突變體果實(shí)生長期間溫度為25～35 ℃，有效積溫900 ℃左右，光照強(qiáng)度為300 μmol·m-2·s-1左右。授粉后34 d，果實(shí)進(jìn)入糖分積累的最后階段，分別取不含種子的中心果肉，3次重復(fù)，分別標(biāo)記為LT34M-1、LT34M-2、LT34M-3、NT34M-1、NT34M-2、NT34M-3，置于-80 ℃冰箱保存。

糖含量測定依據(jù) Hu等（2009）的方法，并加以改進(jìn)。取樣品3 g在研缽中充分研磨后加入 5 mL 80%乙醇，再研磨3 min，置于10 mL離心管中，80 ℃水浴保溫30 min，取出冷卻至室溫，離心后收集上清液，殘?jiān)?0 ℃水浴中反復(fù)再抽提2次，合并3次抽提液，轉(zhuǎn)入旋轉(zhuǎn)蒸干儀中，在45 ℃低溫蒸干，用1 mL超純水溶解，轉(zhuǎn)入1.5 mL離心管中，12 000 r·min-1離心20 min，0.45 μm水相濾膜過濾，4 ℃保存?zhèn)溆?。Shodex Asahipak NH2P-50 4E色譜柱，柱溫35 ℃，2410示差折光檢測器，流動(dòng)相比例為70%乙腈∶30%超純水，流速為1.0 mL ·min-1，糖分標(biāo)準(zhǔn)品均購自sigma公司。果糖、葡萄糖、蔗糖、棉籽糖標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間分別為：5.544、6.716、8.247、12.200 min。

提取aga2突變體果實(shí)總RNA，RNA樣品經(jīng)純度、濃度和完整性檢測等，構(gòu)建 cDNA分子文庫，再對(duì)文庫的質(zhì)量進(jìn)行檢測。轉(zhuǎn)錄組文庫構(gòu)建、高通量測序和序列組裝工作均由北京奧維森基因科技有限公司完成。利用Illumina二代高通量測序平臺(tái)，采用PE150測序策略得到raw reads pairs，對(duì)各樣本的原始測序數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾質(zhì)控后得到clean reads pairs，分別利用Tophat 2和Cufflinks完成比對(duì)和轉(zhuǎn)錄本拼接分析，對(duì)所有基因進(jìn)行定量分析，計(jì)算各基因的表達(dá)水平，定量指標(biāo)為 TPM（transcripts per million reads）。利 用 DESeq2軟 件進(jìn)行基因差異表達(dá)分析，以Padjust ＜0.05和|log2（fold change）|≥1為標(biāo)準(zhǔn)篩選差異表達(dá)基因（differential expressed gene，DEG）。將差異表達(dá)基因與 GO（gene ontology）和 KEGG（kyoto encyclopedia of genes and genomes）數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)，對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行功能富集分析，采用Goseq軟件進(jìn)行 GO富集分析，此方法基于Wallenius non-central超幾何分布，能更準(zhǔn)確地計(jì)算出差異基因所富集的GO term的概率。Pathway顯著性富集分析以KEGG數(shù)據(jù)庫中Pathway為單位，應(yīng)用超幾何檢驗(yàn)，找出差異表達(dá)基因顯著性富集的Pathway，以Padjust ＜0.05為閾值，滿足此條件則認(rèn)為此GO功能/KEGG通路存在顯著富集情況。

對(duì)轉(zhuǎn)錄組測序中的候選基因進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證，并利用 Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物（表1），采用qPCR的方法對(duì)其表達(dá)水平進(jìn)行驗(yàn)證。將各個(gè)處理的樣品總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以此為模板，進(jìn)行qPCR反應(yīng)，以西瓜Actin為內(nèi)參，采用2–ΔΔCt法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量（Livak &Schmittgen，2001），每個(gè)目的基因分別進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)和3次技術(shù)重復(fù)。

表1 qPCR反應(yīng)所用引物

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫弱光下aga2 突變體西瓜果實(shí)表型及糖含量的變化

正常溫度和低溫弱光下的突變體西瓜果實(shí)表型差異明顯（圖1），低溫弱光下授粉34 d后的突變體果實(shí)明顯不成熟。由圖2可知，正常溫度下突變體的果實(shí)糖含量比低溫弱光下高50%左右，其中蔗糖（Suc）含量比低溫弱光下高1倍以上；二者蔗糖、果糖（Fru）、葡萄糖（Glc）含量均表現(xiàn)出極顯著差異，棉籽糖（Raf）含量差異不顯著。

圖1 正常溫度和低溫弱光下aga2 突變體西瓜果實(shí)表型差異

圖2 正常溫度和低溫弱光下aga2 突變體西瓜果實(shí)糖含量差異

2.2 正常溫度和低溫弱光下aga2 突變體差異表達(dá)基因概況

差異表達(dá)基因火山圖可以比較直觀地反映本組差異基因分布（圖3），比較LT34M vs NT34M的差異表達(dá)基因，將差異基因的閾值標(biāo)準(zhǔn)設(shè)定為：|log2（fold change）|≥1且Padjust ＜0.05，得到突變體西瓜果實(shí)中差異表達(dá)基因1 676個(gè)，其中上調(diào)基因686個(gè)，下調(diào)基因990個(gè)，下調(diào)基因個(gè)數(shù)約為上調(diào)基因的1.4倍，說明低溫弱光下突變體西瓜中更多基因被抑制表達(dá)。

圖3 差異表達(dá)基因火山圖

2.3 aga2 突變體西瓜果實(shí)中差異表達(dá)基因富集的主要代謝途徑

GO是一種廣泛應(yīng)用于生物信息領(lǐng)域甚至整個(gè)生物領(lǐng)域的分類系統(tǒng)。它主要按照以下3個(gè)功能進(jìn)行分類：細(xì)胞組分（cellular component）、分子功能（molecular function）和生物過程（biological process）。差異基因GO富集的柱狀圖可以直觀地反映富集在生物過程、細(xì)胞組分和分子功能GO term上差異基因的數(shù)量分布。圖4顯示，LT34M vs NT34M中的下調(diào)差異基因主要富集在生物過程中的碳水化合物代謝過程（63個(gè)），下調(diào)差異基因主要富集在分子功能中的轉(zhuǎn)移酶（126個(gè)）、己糖轉(zhuǎn)移酶（27個(gè)）、糖基轉(zhuǎn)移酶（29個(gè)）、醇基磷酸轉(zhuǎn)移酶（66個(gè)）以及激酶（69個(gè)）5個(gè)亞類。

圖4 下調(diào)基因GO富集柱狀圖

KEGG是系統(tǒng)分析基因功能、基因組信息數(shù)據(jù)庫的方法，可將基因及其表達(dá)信息作為一個(gè)整體網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行研究。通過KEGG分析LT34M vs NT34M的DEGs，共富集到112個(gè)通路，選擇富集程度靠前的代謝通路散點(diǎn)圖展開分析。下調(diào)基因主要富集在激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)（25個(gè)）、甾體生物合成（6個(gè)）、光合作用（7個(gè)）、二萜類生物合成（5個(gè)）、DNA復(fù)制（6個(gè)）、半乳糖代謝（6個(gè)）、次級(jí)代謝產(chǎn)物的生物合成（61個(gè)）以及類黃酮生物合成（3個(gè)）等代謝通路上。本試驗(yàn)重點(diǎn)分析了差異基因中負(fù)調(diào)控的半乳糖代謝途徑，篩選此代謝通路上的差異表達(dá)關(guān)鍵基因，為后續(xù)研究西瓜果實(shí)糖代謝關(guān)鍵基因?qū)囟软憫?yīng)表達(dá)提供線索。

2.4 aga2 突變體西瓜果實(shí)中關(guān)鍵候選基因的篩選及半乳糖代謝途徑的分析

通過對(duì)差異基因進(jìn)行GO注釋以及KEGG通路分析，并且根據(jù)差異基因表達(dá)量的變化以及差異表達(dá)倍數(shù)，篩選出在低溫弱光條件下與西瓜果實(shí)糖分積累相關(guān)的候選基因（表2）。聚類熱圖可以直觀地反映出正常溫度和低溫弱光下突變體西瓜果實(shí)中關(guān)鍵基因的變化情況，如圖5所示，經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)化處理后差異基因類似或相同的表達(dá)模式聚類到一起。上調(diào)表達(dá)的基因主要是MYB、NAC、WRKY家族中的基因，下調(diào)表達(dá)的基因主要是肌醇半乳糖苷合酶（galactinol synthase，GAS）（Cla009222）和AGA（Cla019238、Cla022883）等半乳糖代謝途徑中的關(guān)鍵基因。半乳糖代謝是糖分積累的重要途徑，GAS合成棉籽糖合成前體—肌醇半乳糖苷（Galactinol），隨后棉籽糖通過AGA水解成蔗糖和半乳糖（Galactose）。

圖5 差異基因表達(dá)的聚類分析結(jié)果

表2 差異表達(dá)候選基因信息

通過分析差異基因通路及其表達(dá)量發(fā)現(xiàn)（圖6），低溫弱光下突變體中GAS（Cla009222）、AGA（Cla019238、Cla022883）的基因表達(dá)均被下調(diào)，它們的差異倍數(shù)分別是15.0、2.7、3.5倍。

圖6 KEGG中半乳糖代謝途徑基因表達(dá)量分析

2.5 qRT-PCR分析

將圖4中的DEGs進(jìn)行qRT-PCR實(shí)時(shí)分析，以西瓜Actin基因（Cla97C02G026960）作為內(nèi)參進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證。qRT-PCR中的DEGs的相對(duì)表達(dá)量與轉(zhuǎn)錄組水平相符（圖7），各基因在正常溫度和低溫弱光下的表達(dá)量趨勢一致，表明轉(zhuǎn)錄組水平分析結(jié)果可信。

圖7 差異表達(dá)基因qRT-PCR相對(duì)表達(dá)量

3 討論與結(jié)論

不同作物中糖代謝關(guān)鍵酶基因響應(yīng)低溫條件下糖分積累的研究顯示，低溫可誘導(dǎo)果實(shí)中酸性轉(zhuǎn)化酶（acid invertase，AI）、中性轉(zhuǎn)化酶（neutral invertase，NI）、蔗糖合成酶（sucrose synthase，SS）、蔗糖磷酸合成酶（sucrose phosphate synthase，SPS）的表達(dá)（余芳 等，2014）。在以蔗糖運(yùn)輸為主的作物報(bào)道中，低溫可導(dǎo)致日本梨蔗糖含量下降和己糖積累，分別與蔗糖磷酸合成酶基因（PpSPS1）轉(zhuǎn)錄減少及酸性轉(zhuǎn)化酶基因（PpAIV1）表達(dá)增加有關(guān)（Itai &Tanahashi，2008）；對(duì)番茄進(jìn)行夜間9 ℃亞低溫處理后發(fā)現(xiàn)果實(shí)中果糖、葡萄糖和蔗糖含量較常溫對(duì)照均下降，且果實(shí)中酸性轉(zhuǎn)化酶和中性轉(zhuǎn)化酶活性與葡萄糖和果糖的含量呈極顯著正相關(guān)，蔗糖合成酶活性與蔗糖含量呈極顯著正相關(guān)（王麗娟和李天來，2011）；玉米（Strand et al.，2003）、馬鈴薯（Wang et al.，2009）、桃（Wang et al.，2013）從轉(zhuǎn)錄組水平報(bào)道了低溫可以抑制蔗糖合成基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，從而影響果實(shí)糖分積累。對(duì)于低溫弱光下棉籽糖家族寡糖運(yùn)輸形式的葫蘆科作物糖含量變化的報(bào)道相對(duì)較少。甜瓜果實(shí)中水蘇糖和肌醇半乳糖苷含量下降主要是由于低溫抑制了甜瓜中肌醇半乳糖苷合酶（GAS）活性（郝敬虹，2009）；也有研究發(fā)現(xiàn)低溫下黃瓜葉肉細(xì)胞中的蔗糖、肌醇半乳糖苷、棉籽糖、水蘇糖含量上升，其中肌醇半乳糖苷的上升是由于黃瓜肌醇半乳糖苷合酶中的GAS II和GAS III響應(yīng)低溫上調(diào)表達(dá)所導(dǎo)致（曹文華，2015）；陸慢（2018）證實(shí)了4 ℃低溫脅迫后黃瓜中可溶性糖含量上升是由于3種水蘇糖合成酶基因（stachyose synthase，STS）轉(zhuǎn)錄本響應(yīng)低溫從而上調(diào)表達(dá)。植物體內(nèi)糖含量在低溫下的變化與糖代謝酶關(guān)鍵基因的轉(zhuǎn)錄水平密切相關(guān)。本試驗(yàn)以aga2突變體西瓜果實(shí)作為材料，從轉(zhuǎn)錄組水平探索低溫下果實(shí)糖含量變化，即從響應(yīng)低溫的GAS、AGA基因表達(dá)量的變化解釋了aga2果實(shí)糖含量顯著下降的現(xiàn)象。

KEGG通路分析發(fā)現(xiàn)上調(diào)表達(dá)的基因主要是MYB（Cla018501、Cla004362、Cla010413、Cla013099、Cla000899）、NAC（Cla010201、Cla011761）、WRKY（Cla018026、Cla013967、Cla009557、Cla003370）等轉(zhuǎn)錄因子，MYB、NAC、WRKY轉(zhuǎn)錄因子中抵御低溫脅迫的基因在多種作物中被報(bào)道，MYB轉(zhuǎn)錄因子如西瓜中ClMYB46和Cla007586（高凌云，2016；曹蕾，2017）、蘋果中MdMYB88和MdMYB124等（謝銀鵬，2018）、玉米中的ZmMYB31（Li et al.，2019）等顯著上調(diào)表達(dá)響應(yīng)低溫逆境。NAC轉(zhuǎn)錄因子如花生AhNAC2和AhNAC3基因（劉旭和李玲，2009）、芒 果Mi NACs（余海霞等，2016）、野生黃瓜HdNACs（趙艷青 等，2019）等上調(diào)表達(dá)抵御低溫。WRKY基因家族中分別發(fā)現(xiàn)了15個(gè)葡萄VvWRKYs（Wang et al.，2014）、10個(gè)番茄SlWRKYs（Chen et al.，2015）和12個(gè)西瓜ClWRKYs（Yang et al.，2018）均受低溫脅迫而顯著上調(diào)表達(dá)。

本試驗(yàn)中半乳糖代謝途徑通路中GAS（Cla009222）、AGA（Cla019238、Cla022883）在低溫下均顯著下調(diào)表達(dá)。西瓜中糖分積累模式是：UDP-半乳糖（UDP-galactose）和肌醇（Myoinositol）在肌醇半乳糖苷合酶的作用下合成肌醇半乳糖苷并生成UDP，肌醇半乳糖苷和蔗糖在棉籽糖合酶作用下合成棉籽糖和肌醇，韌皮部運(yùn)輸?shù)拿拮烟潜沪?半乳糖苷酶（AGA）在果實(shí)中水解成蔗糖和半乳糖（圖6）（Carmi et al.，2003；Ren et al.，2021），蔗糖被果實(shí)韌皮部表達(dá)的糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋 白ClVST1（vacuolar sugar transporter）卸載到果肉細(xì)胞間隙（Ren et al.，2020），棉籽糖的水解產(chǎn)物α-半乳糖（α-galactose）是UDP-葡萄糖（UDP-glucose）的合成底物，UDP-葡萄糖能與果糖在蔗糖磷酸合成酶作用下合成蔗糖?？梢姡?半乳糖苷酶不但直接水解棉籽糖生成蔗糖，還提供了合成蔗糖原料UDP-葡萄糖的合成前體α-半乳糖（崔霞霞 等，2018）。aga2突變體中被敲除的ClAGA2基因在正常溫度和低溫弱光情況下均不表達(dá)，而低溫弱光下突變體表現(xiàn)出含糖量降低，說明突變體糖分積累并不完全依賴于此基因的表達(dá)，推測可能存在冗余蛋白能夠互補(bǔ)ClAGA2的功能且被低溫弱光抑制，使得aga2突變體西瓜糖分積累下降。分析差異基因通路及其表達(dá)量發(fā)現(xiàn)低溫弱光下突變體中GAS（Cla009222）、AGA（Cla019238、Cla022883）的基因表達(dá)均顯著下調(diào)，說明Cla009222、Cla019238、Cla022883基因很可能是參與低溫弱光介導(dǎo)的控制棉籽糖在西瓜果實(shí)中卸載的關(guān)鍵基因。推測低溫抑制了該基因的表達(dá)從而抑制了α-半乳糖苷酶家族的整體活性，進(jìn)而影響了棉籽糖水解為蔗糖，從而導(dǎo)致了低溫弱光下突變體果實(shí)的糖含量下降。這與郝敬虹（2009）在低溫下甜瓜中糖代謝酶的研究結(jié)果相似。綜上所述，推測響應(yīng)低溫弱光的GAS（Cla009222）、AGA（Cla019238、Cla022883）共同下調(diào)表達(dá)可能是導(dǎo)致突變體西瓜果實(shí)光合產(chǎn)物不能充分完成糖代謝最終造成果實(shí)糖含量下降的主要原因。

本試驗(yàn)通過轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析，推測低溫條件下西瓜果實(shí)糖含量下降的內(nèi)在因子很可能是棉籽糖合成與卸載的關(guān)鍵酶基因下調(diào)表達(dá)所致，為西瓜果實(shí)響應(yīng)低溫脅迫的糖代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)研究奠定了基礎(chǔ)。