辣椒苗期抗感黃瓜花葉病毒病比較轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析

雷 陽 成 妍 喬 寧 焦彥生 吳越莉

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，山西太原 030031）

黃瓜花葉病毒（cucumber mosaic virus，CMV）為雀麥花葉病毒科（Bromoviridae）黃瓜花葉病毒屬（Cucumovirus）的代表病毒（Fan et al.，2019）。其寄主范圍涵蓋100個科中的1 200種植物，對辣椒的危害尤為嚴(yán)重（Wei et al.，2017）。在貴州、四川、湖南、湖北以及江浙等辣椒主產(chǎn)區(qū)，黃瓜花葉病毒的檢出率在各種病毒中最高（陳玉珍等，2016）。國外抗CMV辣椒資源篩選工作開展較早，已鑒定出多個對CMV表現(xiàn)抗病的材料，如Perennial（Caranta &Palloix，1996）和Bukang（Kang et al.，2017），并獲得了一系列辣椒品種。國內(nèi)的辣椒種質(zhì)資源豐富且栽培歷史悠久，目前已經(jīng)獲得一些耐CMV的抗性資源（張曉敏 等，2015；李寧等，2016）。雖然目前國內(nèi)外在辣椒CMV抗源篩選上已取得一定成效，但獲得的抗病材料仍較少。利用辣椒抗病品種可有效解決化學(xué)藥劑帶來的農(nóng)藥殘留、病菌抗藥性等問題，因此挖掘抗病種質(zhì)資源、探究抗病機(jī)理，在辣椒育種工作中具有很大的現(xiàn)實意義。

目前高通量測序技術(shù)已在生物學(xué)研究領(lǐng)域廣泛應(yīng)用，該技術(shù)可以快速、全面、準(zhǔn)確地比較不同樣本中存在顯著差異的表達(dá)基因，通過生物信息學(xué)分析探究差異基因功能分類，進(jìn)而篩選出與差異表型相關(guān)的基因群。劉永杰等（2016）對禾谷鐮刀菌侵染后玉米幼根內(nèi)轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)，鐮刀烯醇毒素解毒基因、植物激素調(diào)節(jié)基因和磷脂酶D信號通路在玉米免疫禾谷鐮刀菌的過程中發(fā)揮重要作用。雷陽等（2019）對辣椒抗感疫病材料轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測序分析，在KEGG通路中篩選到117個抗病基因，主要包括植物激素調(diào)節(jié)、氧化磷酸化、植物激素信號傳導(dǎo)、苯丙烷類次生代謝途徑等過程，說明這些途徑在辣椒免疫疫病的過程中高度活躍。李海錄等（2017）對山定子接種褐斑菌后的葉片進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，共篩選到94個抗病基因，涉及氨基酸代謝、植物激素信號傳導(dǎo)等防御途徑。王曉陽等（2020）對棉花短絨突變體和野生種的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測序分析，發(fā)現(xiàn)Ca2+信號傳導(dǎo)、MAPK級聯(lián)反應(yīng)、氧化還原活性等途徑的異常表達(dá)，使得突變體不能正常形成短絨纖維。Zhu等（2018）通過比較辣椒接種CMV的轉(zhuǎn)錄組，發(fā)現(xiàn)WRKY轉(zhuǎn)錄因子可能參與對病毒的免疫反應(yīng)。

本試驗以Illumina HiSeq 2500高通量測序技術(shù)為基礎(chǔ)，從感病材料茄門和抗病材料JJ101中篩選與CMV抗性相關(guān)的轉(zhuǎn)錄本，從而深入了解辣椒抗CMV的轉(zhuǎn)錄組信息，從中篩選造成抗性差異的重要基因，為進(jìn)一步揭示辣椒抗病動態(tài)過程、拓展抗病種質(zhì)資源和抗病育種工作提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試的86份辣椒材料（表1）均由山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所搜集并提供。試驗所用CMV BJ1分離物由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所惠贈。病毒接種在煙草葉片擴(kuò)繁后，-70 ℃冰箱保存。

1.2 CMV接種方法和樣品RNA提取

每份辣椒材料選擇籽粒飽滿、顏色和大小一致的種子播于72孔穴盤（基質(zhì)為腐殖質(zhì)∶珍珠巖=3V∶1V），于2018年4月在山西農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院（太原校區(qū)）溫室中進(jìn)行培養(yǎng)。待幼苗長至3～4片真葉時開始接種。以茄門為感病對照，以Perennial為抗病對照。CMV接種方法、病情分級標(biāo)準(zhǔn)及病情指數(shù)的計算均參照李寧等（2018）的描述。每份材料設(shè)置 3次重復(fù)，每個重復(fù)種植10株。

將篩選出的感病材料茄門和抗病材料JJ101的幼苗葉片分別接種CMV，茄門接種后0 h和72 h的2個處理，分別命名為QIEMEN-0h和QIEMEN-72h；JJ101接種后0 h和72 h的2個處理，分別命名為JJ101-0h和JJ101-72h。將樣品葉片迅速置于液氮中冷凍，然后放在-80 ℃的超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

利用TRIzol試劑提取茄門、JJ101各處理的總RNA，然后利用RNase-free DNase I除去總RNA中殘余的DNA。利用TST-A831-1分光光度計檢測茄門、JJ101葉片總RNA的濃度和純度。

1.3 轉(zhuǎn)錄組文庫構(gòu)建及高通量測序

將提取的QIEMEN-0h、QIEMEN-72h、JJ101-0h和JJ101-72h 4個樣品的葉片總RNA，參 考Orcheski和Brown（2017）的方法構(gòu)建特異性文庫。經(jīng)RNA提取、純化和文庫構(gòu)建后，將樣品送至生工生物工程（上海）股份有限公司，利用Illumina HiSeq測序平臺對文庫進(jìn)行雙端測序。對QIEMEN-0h、QIEMEN-72h、JJ101-0h和JJ101-72h 4個樣本原始數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾，剔除質(zhì)量值低于20%的堿基。最后，利用FastQC對單基質(zhì)量、堿基含量分布、GC含量分布、序列堿基質(zhì)量等4個指標(biāo)的數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制分析。

1.4 轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)分析

將QIEMEN-0h、QIEMEN-72h、JJ101-0h和JJ101-72h 4個樣本數(shù)據(jù)與辣椒參考基因組（Capsicum.annuum.L Zunla-1 Release 2.0，http：//peppersequence.genomics.cn/.）進(jìn)行比對。采用Zatta等（2017）的方法，根據(jù)基因組注釋信息，可得到序列的來源基因以及表達(dá)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)，然后基于比對到基因的序列數(shù)目，用統(tǒng)計學(xué)方法計算表達(dá)量，并進(jìn)一步比較基因、轉(zhuǎn)錄本和外顯子在不同樣品和分組之間的表達(dá)差異。為了能夠在樣品內(nèi)以及樣品間比較基因的表達(dá)量，采用RPKM（reads per kilo bases per million reads）對基因的表達(dá)量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，并在此基礎(chǔ)上以FDR ≤0.001和|log2Ratio|≥1為條件篩選出2組樣本間差異表達(dá)基因。

1.5 qRT-PCR驗證

為了驗證Illumina HiSeq測序后的差異基因準(zhǔn)確性，對植物-病原菌互作通路（KO：04626）的10個差異表達(dá)基因進(jìn)行qRT-PCR驗證。使用軟件Primer 5.0設(shè)計跨越內(nèi)含子與外顯子邊界的引物，可有效剔除假陽性，防止qRT-PCR過程中擴(kuò)增到基因組DNA影響試驗結(jié)果。從QIEMEN-0h、QIEMEN-72h、JJ101-0h和JJ101-72h 4個 樣本中各提取RNA 3.0 μg，利用PrimeScript?Reverse Transcriptese試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。以辣椒延伸因子EF-341α為內(nèi)參基因，采用 SYBR?Premix ExTaqTM（Tli RNaseH Plus）（TaKaRa，USA）進(jìn) 行qRTPCR反應(yīng)，每個反應(yīng)重復(fù)3次，最后利用2?ΔΔCT方法分析結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 86份辣椒種質(zhì)資源的CMV抗性鑒定

對來源廣泛的86份辣椒材料進(jìn)行苗期CMV抗性鑒定，材料間表現(xiàn)出明顯的抗性差異（表1）。其中，發(fā)病最嚴(yán)重的材料為茄門，病情指數(shù)為79.47，植株呈現(xiàn)明顯矮化的癥狀，個別植株甚至死亡。而發(fā)病最輕的材料為JJ101，病情指數(shù)為18.67，接種CMV后僅輕微出現(xiàn)明脈和花葉的癥狀。在86份辣椒材料中，2份材料對CMV表現(xiàn)高感（DI ＞75），42份材料表現(xiàn)感?。?0 ＜DI ≤75），37份材料表現(xiàn)中抗（30 ＜DI ≤50），5份材料表現(xiàn)抗病（10 ＜DI ≤30），未篩選出對CMV表現(xiàn)免疫（DI=0）及高抗（0 ＜DI ≤10）的材料。在5份抗病材料中，JJ101的抗性最好，甚至優(yōu)于曾用于抗CMV遺傳定位的法國材料Perennial，因此選用JJ101作為抗病材料進(jìn)行后續(xù)試驗。

表1 辣椒種質(zhì)資源CMV抗性鑒定

2.2 轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)質(zhì)量檢測

4份材料葉片轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計和質(zhì)量檢測結(jié)果如表2所示。本次測序共獲得堿基總數(shù)為27.60 Gb，其中樣品JJ101-72h獲得總堿基數(shù)最多，為7.43 Gb，樣品QIEMEN-72h獲得總堿基數(shù)最少，為6.31 Gb。在4個樣品中，質(zhì)量值≥30的堿基（Q30）最少的為樣品QIEMEN-72h，為5.78 Gb，4個樣品Q30百分比均在90%以上。GC含量在45.15%～46.64%的范圍內(nèi)。檢測結(jié)果表明轉(zhuǎn)錄組測序具有較高的可信度，未出現(xiàn)異常數(shù)據(jù)，可保證后續(xù)分析結(jié)果的準(zhǔn)確性。經(jīng)過FastQC對原數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量篩控，QIEMEN-0h、QIEMEN-72h、JJ101-0h、JJ101-72h樣本數(shù)據(jù)量在一定程度上均有所減少，但高質(zhì)量序列百分比最低的樣品JJ101-0h也在96.49%以上，4個樣本的質(zhì)量分?jǐn)?shù)均未低于Q20。

表2 測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計

利用Tophat/Tophat2軟件將有效數(shù)據(jù)與辣椒基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行比對，QIEMEN-0h、QIEMEN-72h、JJ101-0h、JJ101-72h樣品與參考基因組匹配的序列占比分別為79.95%、78.81%、85.06%和84.73%（表3）。對文庫的基因飽和度進(jìn)行測試發(fā)現(xiàn)，隨著測序數(shù)據(jù)量的增加，基因數(shù)量未見明顯增多，說明測序數(shù)據(jù)量接近飽和。這些結(jié)果都表明，這4個樣本可以進(jìn)一步用于差異表達(dá)基因的分析。

表3 Clean reads與辣椒基因組比對基本信息

2.3 茄門和JJ101接種CMV的差異表達(dá)基因分析

采用 DESeq（version 2.11.0）軟件對茄門和JJ101接種CMV 0 h和72 h后的基因表達(dá)進(jìn)行差異分析，將接種CMV 0 h設(shè)為對照，可以消除基因型特異性和病毒轉(zhuǎn)錄組造成的背景干擾，從而獲得與抗病和感病相關(guān)的更多數(shù)據(jù)。以表達(dá)倍數(shù)差異|log2fold-change|＞1，顯著性P值＜0.05為條件篩選差異基因。首先對CMV侵染茄門前后的兩組材料QIEMEN-72h和QIEMEN-0h進(jìn)行差異比較，共得到1 633個顯著差異表達(dá)基因，其中上調(diào)基因為657個，下調(diào)基因為976個。然后再對CMV侵染JJ101前后的兩組材料JJ101-72h和JJ101-0h進(jìn)行差異分析，共得到1 895個顯著差異表達(dá)基因，其中上調(diào)基因為831個，下調(diào)基因為1 064個。

2.4 差異基因功能顯著性富集分析

利用基因本體論（gene ontology，GO）富集分析JJ101和茄門在接種CMV后的顯著差異基因的功能。結(jié)果顯示，JJ101與茄門的1 158個差異基因中，有643個差異表達(dá)基因被富集。通過前20的GO子類可以看出（圖1），大部分差異基因涉及分子功能和生化過程，而屬于細(xì)胞組成的很少。在分子功能類別中，55個基因涉及碳氧裂解酶活性，53個基因涉及氧化還原酶活性，46個基因涉及過氧化物酶活性，38個基因涉及肽鏈內(nèi)切酶活性，31個基因涉及萜烯合成酶活性，28個基因涉及催化活性，16個基因富集在了蛋白酶負(fù)調(diào)節(jié)活性，9個基因涉及裂解酶活性，8個基因涉及單氧酶活性；而生化功能類別中，37個基因富集在了代謝過程逆境反應(yīng)，22個基因涉及氧化還原過程，20個基因涉及小分子代謝過程，17個基因涉及代謝過程，12個基因涉及防御反應(yīng)。以上結(jié)果可以說明，JJ101和茄門的差異基因在兩者體內(nèi)調(diào)節(jié)了不同的酶類活性、產(chǎn)生了不同的代謝過程和造成了差異的防御反應(yīng)，從而形成了兩者對CMV的抗性差異。

圖1 基因中前20的GO功能類別分析

在植物體內(nèi)，不同基因相互協(xié)調(diào)作用共同行使生物學(xué)功能，為了研究JJ101在接種CMV前后有哪些生物學(xué)過程發(fā)生改變，將JJ101與茄門的1 158個差異基因與KEGG數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)進(jìn)行對比，結(jié)果表明（圖2），共有287個差異基因歸入KEGG通路。在這些通路中，有42個基因富集在了泛素介導(dǎo)的蛋白水解作用通路，34個基因涉及植物激素信號傳導(dǎo)通路，32個基因涉及RNA退化通路，22個基因富集在了氧化磷酸化通路，17個基因涉及cAMP信號通路，14個基因涉及氨基酸的生物合成通路，11個基因富集在了淀粉和蔗糖代謝通路，10個基因歸類于mRNA監(jiān)測通路，同時還有基因歸類到了糖酵解通路、氨基糖和核苷酸糖代謝通路、VEGF信號通路、磷脂酶D信號通路、磷脂酰肌醇信號系統(tǒng)通路、黏液通路、MAPK信號通路、泛酸酯和CoA生物合成通路、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白處理通路、氯烷烴和氯烯烴降解通路、RNA轉(zhuǎn)運通路。值得關(guān)注的是植物-病原互作的相關(guān)基因發(fā)生了顯著變化，共有10個差異基因歸類到了這一途徑，揭示該代謝通道相關(guān)基因發(fā)生了顯著變化。在這10個基因中，Capana02g001851和Capana06g000269兩個基因為類病原相關(guān)分子模式所觸發(fā)的免疫反應(yīng)蛋白基因5（pathogenesis-related genes transcriptional activator 5-like，PTI5）；Capana02g002076為 一氧化氮合酶基因（nitric-oxide synthase，NOS）；Capana05g001792為促分裂原活化蛋白激酶激酶激酶1（mitogen-activated protein kinase kinase kinase 1，MAPKKK1）；Capana02g000687為類促分裂原活化蛋白激酶激酶激酶1（mitogen-activated protein kinase kinase kinase 1-like）；Capana03g002879為促分裂原活化蛋白激酶4（mitogen-activated protein kinase 4，MAPK4）；Capana06g002562為類促分裂原活化蛋白激酶3（mitogen-activated protein kinase 3-like）；Capana07g002392和Capana06g000196兩個基因為抗病蛋白基因（disease resistance protein，RPM1）；Capana03g003522為抗性蛋白RGA1基因（表4）。

表4 植物-病原互作通路下差異基因的KEGG功能注釋

圖2 差異基因前20的KEGG通路功能分析

對基因本體論和KEGG的富集結(jié)果綜合分析可發(fā)現(xiàn)，JJ101和茄門對CMV不同的抗性主要表現(xiàn)為逆境響應(yīng)過程、酶類活性上的差異，同時蛋白代謝途徑、植物激素調(diào)節(jié)等過程也與抗性差異相關(guān)，而在這些通路中植物-病原互作通路起著尤為重要的作用。

2.5 利用qRT-PCR熒光定量驗證差異表達(dá)基因

為了驗證轉(zhuǎn)錄組測序分析的差異基因的準(zhǔn)確性和可靠性，利用實時熒光定量 PCR對植物-病原互作通路下的10個基因（表4）在JJ101接種CMV前后表達(dá)變化進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)qRT-PCR結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組結(jié)果顯著相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為 0.773 3（圖3），由此證明轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)結(jié)果是準(zhǔn)確和可靠的。

圖3 10個轉(zhuǎn)錄因子基因的qRT-PCR及轉(zhuǎn)錄組表達(dá)量的相關(guān)性分析

3 結(jié)論與討論

植物具有獨特的免疫系統(tǒng)響應(yīng)病原物的侵染，其中基礎(chǔ)防御通路為病原相關(guān)分子模式（pathogen associated molecular pattern，PAMP）觸發(fā)的免疫反應(yīng)（PTI）（Zatta et al.，2017），更深層的防御方式為病原效應(yīng)物觸發(fā)的免疫效應(yīng)（effector-triggered immuntiy，ETI）。ETI途徑往往通過抗病蛋白（resistance proteins）識別病原物的特異效應(yīng)因子（effectors），當(dāng)抗病蛋白識別到效應(yīng)因子后會進(jìn)入激活態(tài)，進(jìn)而啟動病原微生物感染位點的細(xì)胞的程序性死亡，有效隔絕病原物的傳播。目前研究較多的編碼抗病蛋白的基因，主要有在擬南芥上發(fā)現(xiàn)的RPM1和RGA1基因，其同源序列在其他植物的基因組中也有報道（Lee et al.，2015；Borgen et al.，2017；Kasmi et al.，2017；王嬌 等，2019；Janda et al.，2019）。促分裂原活化蛋白激酶（mitogen actived protein kinase，MAPK）可 將ATP上的磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移到底物氨基酸殘基上，使其催化磷酸化，而MAPKKK是激活這一過程的關(guān)鍵蛋白。MAPKKK主導(dǎo)的級聯(lián)反應(yīng)一方面可以參與激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)以及植物的生長發(fā)育進(jìn)程，同時也是植物抗病反應(yīng)中的重要組成部分（張振才 等，2014）。

本試驗中KEGG通路富集結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相比于茄門，JJ101在接種CMV后，有10個差異基因表現(xiàn)為植物-病原互作功能。其中4個基因為MAPK級聯(lián)途徑的基因，包括2個分裂原活化蛋白激酶MAPK基因和2個促分裂原活化蛋白激酶MAPKKK；2個為類病原相關(guān)分子模式所觸發(fā)的免疫反應(yīng)蛋白基因PTI；3個基因為抗病蛋白基因，包含2個RPM1和1個RGA1。表明JJ101相比于茄門，在CMV侵染過程中PTI途徑、ETI途徑和MAPK級聯(lián)途徑異常活躍，綜合調(diào)動了植物體內(nèi)免疫系統(tǒng)響應(yīng)，從而有效地抵抗了病原菌的入侵。這些差異基因的表達(dá)與JJ101的抗病性顯著相關(guān)，這一結(jié)果也再次證實了RPM1、RGA1、PTI5、PTI6、MAPK3、MAPK4、MAPKKK1等基因在植物免疫反應(yīng)中起著十分重要的作用。

研究發(fā)現(xiàn)，過氧化物酶可以通過抑制真菌生長和去除H2O2來達(dá)到抵抗病原侵染，減輕病害發(fā)生的作用。Alcázar等（2010）發(fā)現(xiàn)辣椒受到辣椒疫霉侵染后，過氧化物酶活性顯著增加，且與辣椒品種的抗病性呈正相關(guān)。多酚氧化酶是ETI途徑的重要功能蛋白，可將酚氧化為單寧類物質(zhì)，造成病原菌侵入點細(xì)胞的程序性死亡，從而達(dá)到阻礙病原擴(kuò)展的目的（Rosalía et al.，2011）。植物激素信號途徑是重要的植物免疫信號系統(tǒng)，目前報道最多的有茉莉酸、乙烯和水楊酸等通路（王妮妍和蔣德安，2002；Birch et al.，2009；Sorokan et al.，2011；Boevink et al.，2016；Kang et al.，2017）。其 中，茉莉酸信號途徑在植物抗病反應(yīng)中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，茉莉酸可誘導(dǎo)過氧化物酶、多酚氧化酶等防御性酶的合成，與酶活性調(diào)節(jié)途徑串聯(lián)，從而激活整個植物防御系統(tǒng)（Balaji et al.，2011）。本試驗中GO和KEGG通路富集結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相比于茄門，CMV侵染后JJ101有46個差異基因歸類為過氧化物酶基因，22個差異基因歸類為氧化磷酸化過程，34個差異基因歸類為植物激素信號傳導(dǎo)通路，說明這些基因在JJ101抵抗CMV侵染的過程中都有重要的表現(xiàn)，是JJ101表現(xiàn)抗病的重要基因。這與前人的研究結(jié)果相契合，由此可見JJ101對CMV的免疫是多途徑共同作用的過程。除了起主要作用的植物與病原互作的相關(guān)通路，還包括多種酶活性調(diào)節(jié)通路、植物激素抗病信號傳導(dǎo)途徑在其中貢獻(xiàn)力量。這些通路在調(diào)控JJ101對CMV的抗性過程中一方面可以獨立行使其功能，另一方面還可以互相調(diào)動，從而參與到其他途徑中共同行使功能。說明JJ101對CMV的抗性并非是由單一基因引起的，而是一個需要大量不同類別、不同途徑的基因參與其中的系統(tǒng)性調(diào)節(jié)過程，這與本試驗的轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果相一致。

本試驗通過高通量轉(zhuǎn)錄組測序，對茄門和JJ101在接種CMV前后進(jìn)行了比較深入的轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究，其結(jié)果可為在轉(zhuǎn)錄水平上全面了解茄門和JJ101對CMV抗性的分子基礎(chǔ)提供有價值的見解。通過研究發(fā)現(xiàn)，JJ101和茄門抗CMV是一個高度復(fù)雜、多途徑協(xié)同的過程：PTI途徑、ETI途徑和MAPK級聯(lián)途徑等防御反應(yīng)在其中起主要作用，酶活性調(diào)節(jié)、植物激素調(diào)節(jié)等通路協(xié)同作戰(zhàn)。研究結(jié)果為后期更深入研究辣椒抗病分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)，為抗病育種提供了理論依據(jù)。