HPLC法測定山楂炮制前后10種有機酸成分的含量

蔣昊

（天津市第一中心醫(yī)院藥學部，天津 300192）

山楂來源于薔薇科山楂屬植物山里紅Cralaegus pinnatifida.Bge.var.major N.E.Br.或山楂Crataegus pinnatifida Bge.的干燥成熟果實。山楂具有消食健脾、行氣散瘀、化濁降脂的功效。山楂主要含有黃酮、有機酸、萜類等多種成分[1-2]。其中有機酸是消食健脾的主要有效成分[3]。現(xiàn)代藥理研究表明，山楂對H2O2誘導的H9C2心肌細胞和血管內(nèi)皮細胞損傷均具有保護作用[4-5]，此外還有抗菌、抗氧化和血脂血糖調(diào)節(jié)作用等[6]。有機酸有一定的刺激性，臨床上多用其炮制品炒山楂和焦山楂來消食導滯，其中焦山楂消食導滯作用較強，常用于肉食積滯，瀉痢不爽。而山楂炭則具有收斂止血、固澀止瀉的功效。有機酸對熱不穩(wěn)定，加熱炮制后總有機酸含量會降低[7-11]，而部分有機酸成分的含量也是隨著溫度升高和加熱時間延長呈現(xiàn)下降趨勢[12-13]，這也是導致不同炮制品藥效作用差異的原因之一。山楂具有藥食同源的特點，山楂的提取和加工常用水作為溶媒，因此本研究針對山楂中水溶性較好的10種有機酸成分，建立了高效液相色譜法（HPLC）同時進行含量測定的方法，旨在為今后研究山楂炮制前后的有機酸成分變化規(guī)律提供條件和參考。

1 材料

1260型高效液相色譜儀，二極管陣列檢測器（美國安捷倫科技有限公司），MSE6.6S-OCE-DM型百萬分之一微量天平（賽多利斯實驗室儀器有限公司），JP-060S型超聲波清洗儀（深圳市潔盟清洗設備有限公司），F(xiàn)W100型高速粉碎機（天津泰斯特儀器有限公司）。

去核山楂飲片（購于安徽亳州藥材市場，產(chǎn)地四川），經(jīng)天津中醫(yī)藥大學李天祥教授鑒定為薔薇科山楂屬植物山楂Crataegus pinnatifida Bge.的干燥成熟果實。草酸、酒石酸、蘋果酸、乳酸、檸檬酸、琥珀酸、沒食子酸、原兒茶酸、香草酸、咖啡酸對照品（上海源葉生物科技有限公司，純度≥98%），水為超純水，甲醇、乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Hypersil ODS2色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相：0.1% 磷酸水溶液（A）∶甲醇（B）梯度洗脫（0～10 min，1%～25%B；10～28 min，25%B；28～30 min，25%～1%B；30～35 min，1%B），檢測波長：210 nm，流速：0.8 mL/min，柱溫 27.5℃，進樣量10 μL。見圖1。

圖1 山楂的HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of CP

2.2 對照品儲備液的制備 精密稱量適量草酸、酒石酸、蘋果酸、乳酸、檸檬酸、琥珀酸、沒食子酸、原兒茶酸、香草酸和咖啡酸對照品，加50%甲醇水溶液配制成濃度分別為 200、900、900、800、5 000、800、50、50、50、50 μg/mL 的混合對照品儲備液，并逐級稀釋配制成一系列濃度的混合對照品溶液，備用。

2.3 供試品溶液的制備 取山楂飲片，粉碎，過80目篩，得到山楂細粉，取該細粉1 g，加適量水，30℃超聲30 min，過濾后定容于25 mL容量瓶中，取適量過0.45 μm濾膜，備用。

2.4 炮制品的制備[8]

2.4.1 炒山楂的制備 取凈制的山楂，將其放在已預熱適宜的炒制容器內(nèi)，用中火（120℃）加熱，并不斷翻炒，炒至顏色變深，取出放涼。

2.4.2 焦山楂的制備 取凈制的山楂，將其放在已預熱適宜的炒制容器內(nèi)，用中火（120℃）加熱炒至表面焦褐色，內(nèi)部為黃褐色，取出放涼。

2.4.3 山楂炭的制備 取凈制的山楂，將其放在已預熱適宜的炒制容器內(nèi)，用武火（180℃）加熱，翻炒至表面黑色，內(nèi)部為焦褐色，取出放涼。

2.5 方法學考察

2.5.1 線性關系考察 精密吸取上述10種對照品的混合溶液適量，加水稀釋后得系列質(zhì)量濃度的混合對照品溶液，分別按2.1項下色譜條件測定，記錄峰面積，以對照品的質(zhì)量濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，得草酸、酒石酸、蘋果酸、乳酸、檸檬酸、琥珀酸、沒食子酸、原兒茶酸、香草酸、咖啡酸的回歸方程、線性范圍、相關系數(shù)見表1。

表1 山楂中10種有機酸成分的回歸分析、線性范圍、相關系數(shù)Tab.1 Regression analysis，linear range and correlation coefficient of ten organic acid components in CP

2.5.2 精密度實驗 精密吸取混合對照品溶液10 μL，按2.1項下色譜條件重復進樣6次，計算草酸、酒石酸、蘋果酸、乳酸、檸檬酸、琥珀酸、沒食子酸、原兒茶酸、香草酸、咖啡酸的峰面積RSD分別為1.26%，1.55%，0.70%，0.81%，0.64%，0.71%，1.20%，0.81%，0.66%，0.90%，表明儀器精密度良好。

2.5.3 穩(wěn)定性實驗 精密吸取同一生山楂供試品溶液，分別在制備后 0、2、4、6、8、12、24 h 按 2.1 項下色譜條件測定，計算草酸、酒石酸、蘋果酸、乳酸、檸檬酸、琥珀酸、沒食子酸、原兒茶酸、香草酸、咖啡酸的峰面積RSD，常溫放置24 h后10種有機酸成分的峰面積 RSD分別為 2.79%、2.55%、2.20%、2.77%、2.06%、2.91%、2.75%、2.68%、2.10%、2.10%；4℃放置24 h后10種有機酸成分的峰面積RSD分別為 1.51%、1.48%、1.92%、1.11%、0.91%、1.77%、1.57%、1.12%，0.97%，1.03%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定，且在4℃低溫保存更穩(wěn)定。

2.5.4 重復性實驗 精密稱取同一批生山楂樣品6份，按2.3項下方法制備供試品溶液，按2.1項下條件測定，計算草酸、酒石酸、蘋果酸、乳酸、檸檬酸、琥珀酸、沒食子酸、原兒茶酸、香草酸、咖啡酸的峰面積RSD分別為1.92%、1.94%、0.89%、0.68%、1.74%、1.95%、2.47%、1.85%、1.91%、1.83%，表明該方法重復性良好。

2.5.5 加樣回收率實驗 取同一批已知各指標成分含量的生山楂樣品1.0 g，平行6份，精密稱定，每份分別精密加入適量的10種有機酸對照品，按2.3項下方法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件測定，計算草酸、酒石酸、蘋果酸、乳酸、檸檬酸、琥珀酸、沒食子酸、原兒茶酸、香草酸、咖啡酸的平均加樣回收率和RSD，見表2。

表2 山楂中10個有機酸成分含量測定的加樣回收率實驗Tab.2 Recovery test of content determination of ten organic acid components in CP

2.6 樣品測定 取生山楂飲片及其炮制品，按2.3項下方法制備供試品溶液，平行3份，按2.1項下色譜條件測定，采用外標法計算各樣品中上述10種有機酸成分的含量。見表3。

表3 山楂中10個有機酸成分炮制前后的含量（±s）Tab.3 Contents of ten organic acid components in CP before and after processing（±s）

表3 山楂中10個有機酸成分炮制前后的含量（±s）Tab.3 Contents of ten organic acid components in CP before and after processing（±s）

注：采用 SPSS 25.0 統(tǒng)計軟件對各炮制品與生品含量比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

有機酸 n草酸 3酒石酸 3蘋果酸 3乳酸 3檸檬酸 3琥珀酸 3沒食子酸 3原兒茶酸 3香草酸 3咖啡酸 3生山楂（mg/g） 炒山楂（mg/g） 焦山楂（mg/g） 山楂炭（mg/g）0.135 7±0.006 9 0.137 5±0.005 5 0.120 3±0.006 8 0.112 4±0.006 9*5.511 6±0.171 2 5.495 9±0.180 3 4.538 2±0.114 8** 1.243 2±0.050 4**6.020 7±0.250 1 5.439 1±0.081 6** 4.179 9±0.054 2** 1.482 0±0.024 7**0.926 9±0.037 0 0.843 4±0.028 4* 0.743 4±0.016 6** 0.560 4±0.026 4**77.982 0±2.593 5 64.145 9±1.534 3** 39.397 5±0.718 5** 5.577 1±0.173 5**1.920 7±0.072 3 1.437 2±0.036 6** 1.979 1±0.060 8 4.073 2±0.167 2**0.022 0±0.001 1 0.009 7±0.000 5** 0.000 0±0.000 0** 0.000 0±0.000 0**0.001 8±0.000 1 0.006 1±0.000 2** 0.004 3±0.000 2** 0.003 6±0.000 2**0.609 2±0.021 6 0.278 5±0.008 3** 0.000 0±0.000 0** 0.000 0±0.000 0**0.160 9±0.006 5 0.148 9±0.007 1* 0.000 0±0.000 0** 0.000 0±0.000 0**

3 討論

3.1 提取方法的選擇 2015版《中國藥典》規(guī)定有機酸的提取方法[14]：取本品細粉約1 g，精密稱定，精密加入水100 mL，室溫下浸泡4 h，時時振搖，濾過。另有研究用水或者不同濃度乙醇作溶劑，采用超聲或回流的方法提取有機酸[15-18]。另有報導用果膠酶預處理后采用浸提法提取中藥山楂中有機酸成分，相比溶劑浸提法得率增加了近一倍[19]。從色譜峰個數(shù)、峰面積及經(jīng)濟角度考慮，提取時間以30 min為佳。本研究采用30℃水超聲30 min的提取方法，由于山楂中部分有機酸成分的含量較低，因此加大了待測藥液的濃度，藥材粉末的重量和提取溶劑的比例設定為 1∶25（g∶mL）。

3.2 色譜條件的優(yōu)化 本研究比較了WelchUltimate AQ-C18和Hypersil ODS2兩種色譜柱，后者對10種有機酸成分的分離效果更好。草酸、蘋果酸、乳酸、檸檬酸、琥珀酸和酒石酸在210 nm附近有最大吸收，沒食子酸、原兒茶酸和香草酸在260和270 nm附近有最大吸收，咖啡酸在290和320 nm附近有最大吸收。通過比較上述5個檢測波長，發(fā)現(xiàn)草酸、蘋果酸、乳酸、檸檬酸和琥珀酸在260、270、290和320 nm處吸收較小或沒有吸收，而沒食子酸、原兒茶酸、香草酸和咖啡酸在210 nm處也有較強吸收，故最終選定210 nm為檢測波長。

流動相的pH值對有機酸的分離度和峰型影響較大，比較了甲醇-甲酸水溶液、甲醇-乙酸水溶液、甲醇-磷酸水溶液、乙腈-甲酸水溶液、乙腈-乙酸水溶液、乙腈-磷酸水溶液6種組合的流動相，甲醇-磷酸水溶液的分離效果最好，而磷酸的濃度越高，峰型越好，但考慮到pH值低于2會對色譜柱和儀器有損害，故采用0.1%磷酸做水相。

柱溫和流速對有機酸的分離度影響較大，柱溫越高，出峰越早、峰型越好，但是各峰之間分離度不好，尤其是極性大的有機酸成分幾乎分不開；而減慢流速可以改善分離度。比較了 25、27.5、30、35、40℃5種柱溫，25℃和27.5℃時分離效果最好，但是25℃易受室溫影響，波動大，故選擇27.5℃。比較了0.3、0.5、0.8和1 mL/min 4種流速，其中0.8 mL/min的分離效果和檢測時間更合適，而0.3和0.5 mL/min流速時每個樣品的檢測時間過長，1 mL/min的流速無法將10種有機酸都分離開。

3.3 炮制前后10種有機酸成分的含量變化 草酸、酒石酸、蘋果酸、乳酸、檸檬酸、沒食子酸、香草酸、咖啡酸，這8種成分隨炮制溫度升高或加熱時間延長，含量下降，這與總有機酸的變化趨勢一致；琥珀酸的含量先下降后升高：炒山楂＜生山楂＜焦山楂＜山楂炭。原兒茶酸的含量先升高后下降：生山楂＜山楂炭＜焦山楂＜炒山楂，這兩種成分與總有機酸的變化趨勢不同。根據(jù)這兩種有機酸含量變化規(guī)律推測炮制過程可能導致山楂中的其他成分在加熱或pH值降低的條件下轉(zhuǎn)化成琥珀酸和原兒茶酸。其中轉(zhuǎn)化成的琥珀酸含量遠遠高于琥珀酸受熱被破壞的含量，山楂炭中琥珀酸含量約為生品的2倍，推測加熱或（和）pH值降低可以促進這種轉(zhuǎn)化的發(fā)生；而山楂中原兒茶酸的含量本身就很微量，轉(zhuǎn)化成的原兒茶酸含量又不足以彌補原兒茶酸受熱被破壞的含量，推測短時間或低溫加熱可以促進這種轉(zhuǎn)化的發(fā)生，而長時間或高溫加熱反而抑制這種轉(zhuǎn)化。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，由于山楂中含有較多糖類和氨基酸成分，在山楂炮制過程中會發(fā)生美拉德反應產(chǎn)生5-羥甲基糠醛（5-HMF），熱加工程度越高，5-HMF的含量越高[20-21]，而琥珀酸正是5-HMF的下游產(chǎn)物之一，因此推測在炮制過程中或在炮制品提取過程中部分5-HMF轉(zhuǎn)化成琥珀酸，從而增加了琥珀酸的含量。

本研究通過HPLC法同時測定山楂炮制前后10種有機酸成分的含量變化，發(fā)現(xiàn)了琥珀酸和原兒茶酸不同的變化規(guī)律，其中的反應機制還有待更深入的研究探索。