基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接分析芪參益氣滴丸治療急性冠脈綜合征的作用機(jī)制*

王朔 ，杜雪晨 ，趙佳 ，周伽 ，李春潔

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 301617；2.天津市胸科醫(yī)院，天津 300222）

《中國(guó)心血管健康與疾病報(bào)告2019》指出，中國(guó)心血管患病率仍呈持續(xù)上升態(tài)勢(shì)，推算冠心病患者約占心血管患病總數(shù)的3.33%，且心血管病死率仍占首位，而急性冠脈綜合征（ACS）是導(dǎo)致心血管病死率居高不下的重要原因[1]。ACS是以冠狀動(dòng)脈粥樣硬化斑塊破裂、侵襲，繼發(fā)完全或不完全閉塞性血栓形成為病例基礎(chǔ)的一組臨床征象，主要包括急性ST段抬高性心肌梗死（AMI），急性非ST段抬高性心肌梗死以及不穩(wěn)定型心絞痛（UA）[2]。

對(duì)于ACS的治療以經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療（PCI）為常見(jiàn)方案，但PCI術(shù)后易造成血管機(jī)械性損傷及再狹窄等事件，導(dǎo)致繼發(fā)性心絞痛[3]。目前，臨床對(duì)于PCI術(shù)后藥物治療以抗血小板聚集、降脂類藥物為主，但治療效果相對(duì)有限。

中醫(yī)學(xué)將ACS歸屬于胸痹、心痛范疇?！夺t(yī)林改錯(cuò)》有云“元?dú)饧忍摚夭荒苓_(dá)于血管，血管無(wú)氣，必停留而瘀”，認(rèn)為其病位在于心，基本病機(jī)為瘀血內(nèi)停、日久氣虛，病性總屬本虛標(biāo)實(shí)，以氣虛為本，血瘀為標(biāo)，治當(dāng)扶正祛邪，益氣活血[4]。芪參益氣滴丸（QSYQ）是中醫(yī)臨床上常見(jiàn)的治療氣虛血瘀型胸痹的推薦中成藥，具有益氣通脈，活血止痛的功效。臨床研究表明，QSYQ可有效改善AMI患者PCI術(shù)后血清炎癥水平，減輕心梗面積，改善心功能及內(nèi)皮功能[5-6]。此外，QSYQ聯(lián)合西藥可有效緩解UA患者的癥狀，降低心絞痛發(fā)作頻率，減少主要心血管不良事件發(fā)生率[7-8]。

然而，中藥復(fù)方具有化學(xué)成分復(fù)雜、作用機(jī)制多樣的特點(diǎn)，QSYQ治療ACS的物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制尚不明確。因此，利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接的方法對(duì)QSYQ治療ACS的活性成分和作用靶點(diǎn)進(jìn)行分析，對(duì)于解釋其治療ACS的作用機(jī)制并拓寬臨床思路有重要意義。

1 材料與方法

1.1 QSYQ有效成分及核心作用靶點(diǎn)篩選的方法分別以QSYQ的藥物組成黃芪、丹參、三七、降香為關(guān)鍵詞，按照口服生物利用度（OB）≥30%和類藥性（DL）≥0.18為篩選標(biāo)準(zhǔn)，在 TCMSP（http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）及 Batman（http：//bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm/）平臺(tái)分別檢索有效成分，并提取對(duì)應(yīng)作用靶點(diǎn)。

1.2 AMI和UA靶點(diǎn)的收集的方法 通過(guò)Gene Cards （https：//www.genecards.org/），OMIM（https：//omim.org/），drugbank（https：//go.drugbank.com/），pharmGKB（https：//www.pharmgkb.org/），TTD（http：//db.idrblab.net/ttd/），CTD（http：//ctdbase.org/）平臺(tái)，分別以“Acute myocardial infarction”、“Unstable angina pectoris”為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索，明確疾病相關(guān)靶點(diǎn)。

1.3 QSYQ治療AMI和UA的潛在作用靶點(diǎn)確定的方法 將QSYQ與AMI和UA疾病靶點(diǎn)取交集，得到二者的交集靶點(diǎn)，即QSYQ治療AMI和UA的潛在作用靶點(diǎn)。

1.4 “藥物-有效成分-作用靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建的方法 將藥物、有效成分、作用靶點(diǎn)、疾病的相關(guān)數(shù)據(jù)信息導(dǎo)入Cytoscape3.7.2軟件并建立網(wǎng)絡(luò)圖。

1.5 PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及分析的方法 將作用靶點(diǎn)上傳至STRING數(shù)據(jù)庫(kù)，導(dǎo)入Cytoscape3.7.2軟件，繪制PPI網(wǎng)絡(luò)圖，以≥2倍DC中位數(shù)21，再取≥2倍BC中位21.3數(shù)作為篩選標(biāo)準(zhǔn)，得到關(guān)鍵靶點(diǎn)。

1.6 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析的方法 將作用靶點(diǎn)上傳至DAVID平臺(tái)，對(duì)潛在有效靶點(diǎn)進(jìn)行GO和KEGG注釋分析。

1.7 關(guān)鍵活性成分-關(guān)鍵靶點(diǎn)分子對(duì)接的方法 下載小分子配體文件2D結(jié)構(gòu)，下載核心靶點(diǎn)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，除去水分子，分離原配體，加氫、格式化后保存大分子受體，利用Autodock Tools 1.5.6確定受體和配體結(jié)合的可能區(qū)域。進(jìn)行分子對(duì)接，以結(jié)合能≤-5.0 kJ/mol作為篩選標(biāo)準(zhǔn)，建立對(duì)接相互作用模式圖。

2 結(jié)果

2.1 QSYQ有效成分及核心作用靶點(diǎn)篩選 利用TCMSP及Batman平臺(tái)，分別以黃芪、丹參、三七、降香為關(guān)鍵詞，檢索有效成分，共得到有效成分130個(gè)，其中黃芪20個(gè)、丹參65個(gè)、三七8個(gè)、降香37個(gè)。利用TCMSP平臺(tái)檢索有效成分對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)，其中黃芪943個(gè)、丹參2 652個(gè)、三七709個(gè)、降香965個(gè)，經(jīng)去重后得到作用靶點(diǎn)2 022個(gè)，以O(shè)B值大小排序，列出前10位有效化學(xué)成分，見(jiàn)表1。

表1 QSYQ有效成分信息表Tab.1 Active ingredient information of QSYQ

2.2 AMI和UA的相關(guān)靶點(diǎn) 分別以“Acute myocardial infarction”“Unstable angina pectoris”為關(guān)鍵詞檢索，分別得到相關(guān)靶點(diǎn)747個(gè)、155個(gè)。

2.3 QSYQ治療AMI和UA的潛在作用靶點(diǎn) 將QSYQ作用靶點(diǎn)分別與AMI和UA相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行交集，得到共同作用靶點(diǎn)36個(gè)，見(jiàn)圖1。

圖1 “藥物-有效成分-作用靶點(diǎn)-疾病”互作網(wǎng)絡(luò)圖Fig.1 Interaction network diagram of“drug-active ingredient-target-disease”

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建及分析 將共同作用靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING平臺(tái)，得到蛋白互作信息，見(jiàn)圖2。建立PPI網(wǎng)絡(luò)圖，見(jiàn)圖3。篩選出關(guān)鍵靶點(diǎn)7個(gè)：IL-6、SERPINE1、IL-1B、TP53、NOS3、FOS、F3。

圖2 蛋白質(zhì)相互作用圖Fig.2 Protein interaction diagram

圖3 PPI網(wǎng)絡(luò)圖Fig.3 PPI network diagram

2.5 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析GO功能富集分析經(jīng)篩選共得到217條，其中生物過(guò)程180條，分子功能18條，細(xì)胞組分19條，見(jiàn)圖4。KEGG通路富集分析經(jīng)篩選共得到69條，見(jiàn)圖5。

圖4 GO功能富集分析Fig.4 GO function enrichment analysis

圖5 KEGG通路富集分析Fig.5 KEGG pathway enrichment analysis

2.6 關(guān)鍵活性成分-關(guān)鍵靶點(diǎn)分子對(duì)接 以PPI蛋白互作網(wǎng)絡(luò)選取7個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)與相應(yīng)關(guān)鍵活性成分進(jìn)行分子對(duì)接，見(jiàn)表2。建立分子對(duì)接互作模式圖，結(jié)果顯示所有關(guān)鍵靶點(diǎn)與關(guān)鍵活性成分均可自發(fā)結(jié)合，形成較為穩(wěn)定的構(gòu)象，說(shuō)明QSYQ關(guān)鍵活性成分與治療AMI、UA的關(guān)鍵作用靶點(diǎn)具有較好的結(jié)合活性，見(jiàn)圖6。

圖6 QSYQ關(guān)鍵活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)分子對(duì)接互作模式圖Fig.6 Interaction diagram of QSYQ key active ingredients and key target molecules

表2 QSYQ關(guān)鍵活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)結(jié)合能Tab.2 Binding energy of QSYQ key active ingredients and key target

3 討論

本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選得到QSYQ的成分主要有槲皮素、木犀草素、β-谷甾醇、芒柄花素、丹參酮ⅡA、人參皂苷rh2等。研究顯示，槲皮素可通過(guò)上調(diào)SIRT1降低心肌梗死的微血管通透性[9]。木犀草素發(fā)揮抗心肌損傷的作用可能與NF-κB通路相關(guān)[10]。β-谷甾醇通過(guò)ERKI/2信號(hào)通路發(fā)揮抗心肌氧化應(yīng)激和炎癥損傷，減輕心肌細(xì)胞凋亡[11]。芒柄花素可調(diào)節(jié)TNF-α、IL-1β水平，發(fā)揮抗心肌缺血的作用[12]。丹參酮ⅡA通過(guò)調(diào)節(jié)AngⅡ-（AT-1R）-Cx43信號(hào)通路，發(fā)揮抗冠心病血瘀證再灌注損傷的作用[13]。人參皂苷rh2可明顯改善氧化應(yīng)激及炎癥水平，增加心肌缺血再灌注后血EPCs[14]。

通過(guò)“藥物-有效成分-作用靶點(diǎn)-疾病”的網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn) PTGS2、NOS2、CASP3、TNF、CCND1、ICAM1、IFNG、MMP9、TP53、CD40LG 等核心靶點(diǎn)而達(dá)到治療ACS的作用。PTGS2（COX2）是NF-κB的下游因子，NF-κB活化后，啟動(dòng)COX2的轉(zhuǎn)錄，上調(diào)TNF-α，IL-1β，IL-6，ICAM1 的表達(dá)，在機(jī)體免疫、炎癥中發(fā)揮作用，并且可升高Caspase3水平，誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡[15]。CD40L是活化的CD40細(xì)胞，在心臟功能異常情況下大量分泌，與炎細(xì)胞水平呈正相關(guān)[16]。NOS2通過(guò)cGMP途徑對(duì)下游靶蛋白進(jìn)行磷酸化等多種翻譯及修飾，引起心肌損傷[17]。TP53INP1介導(dǎo)p53的抗氧化活性，表達(dá)升高易導(dǎo)致心肌細(xì)胞自噬小體的破裂，加重心肌損傷[18]。

GO富集分析發(fā)現(xiàn)，QSYQ治療ACS的生物學(xué)功能主要體現(xiàn)在一氧化氮生物合成過(guò)程的正調(diào)控、對(duì)缺氧的反應(yīng)、細(xì)胞對(duì)脂多糖的反應(yīng)、細(xì)胞外間隙等方面。KEGG通路顯示，QSYQ各關(guān)鍵靶點(diǎn)主要涉及TNF信號(hào)通路、NF-κB信號(hào)通路、NOD樣受體信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路等。缺血時(shí)HIF-1α的表達(dá)是內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制的始動(dòng)因子和共同途徑，此時(shí)HIF-1α表達(dá)降低，加重心肌損傷程度，降低心功能[19]。NOD樣受體蛋白3調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞焦亡，而由其介導(dǎo)的心肌損傷可能與調(diào)控NLRP3相關(guān)，同時(shí)研究表明改善NF-κB信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路相關(guān)的IL-6，IL-1β，Caspase1等炎癥因子水平，有利于減輕心肌細(xì)胞損傷[20]。

綜上，本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)聯(lián)合分子對(duì)接的方法，發(fā)現(xiàn)槲皮素、木犀草素、β-谷甾醇、芒柄花素、丹參酮ⅡA、人參皂苷rh2等為QSYQ的主要活性成分，PTGS2、NOS2、CASP3、TNF、CCND1、ICAM1、IFNG、MMP9、TP53、CD40LG為主要作用靶標(biāo)，主要與TNF信號(hào)通路、NF-κB信號(hào)通路、NOD樣受體信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路等通路相關(guān)，分子對(duì)接驗(yàn)證了木犀草素、槲皮素、人參皂苷rh2、丹參酮ⅡA的化合物與 IL-6、SERPINE1、IL-1B、TP53、NOS3、FOS、F3 的核心靶點(diǎn)。鑒于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接的局限性，后期需對(duì)本研究結(jié)果進(jìn)行，為QSYQ治療ACS提供實(shí)驗(yàn)和臨床依據(jù)。