基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接的乾坤丹Ⅵ號治療糖尿病腎臟疾病的機制研究*

陳志勇 ，張金平 ，李連瑞 ，劉靜 ，李天祥

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 301617；2.天津市北辰區(qū)中醫(yī)醫(yī)院，天津 300400）

糖尿病腎臟疾病（DKD）以持續(xù)性白蛋白尿、血壓升高、腎小球濾過率下降等為主要臨床表現(xiàn)，是糖尿病最常見的微血管并發(fā)癥[1]，約30%的1型糖尿病（T1DM）和40%的2型糖尿?。═2DM）患者在10～20年內(nèi)會進展為DKD[2]，是導(dǎo)致終末期腎臟病疾病（ESRD）的主要原因[3]。DKD的病死率呈逐年上升趨勢。有研究發(fā)現(xiàn)，到2040年全球?qū)⒂?.4億人口罹患糖尿病[4]，與糖尿病相關(guān)的腎臟疾病將是導(dǎo)致糖尿病患者死亡的重要原因。

乾坤丹Ⅵ號為天津市北辰區(qū)中醫(yī)醫(yī)院治療DKD的常用院內(nèi)中藥復(fù)方制劑[批準文號：津藥制字（2001）Z 第 0792號]，以黃芪、山藥、蒼術(shù)、續(xù)斷、瓜蔞、枸杞子6味中藥為核心藥組，具有健脾補腎、祛濕化痰之效。通過近三十年的臨床實踐表明，乾坤丹Ⅵ號在改善DKD患者的臨床癥狀，降低DKD患者尿蛋白的排泄，延緩DKD腎功能進展方面療效顯著[5-6]。然而目前關(guān)于乾坤丹Ⅵ號的作用機制研究相對較少，乾坤丹Ⅵ號防治DKD的機制尚未明確。

中藥網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究方法是以高通量組學(xué)數(shù)據(jù)分析、計算機虛擬計算及網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫檢索為基礎(chǔ)，從系統(tǒng)生物學(xué)和生物網(wǎng)絡(luò)平衡角度預(yù)測中藥組方中化合物的靶點特征和藥理作用，并闡述中藥復(fù)方組合規(guī)則和對疾病網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)效果的分析方法[7]。因此，本研究擬基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析方法從系統(tǒng)層面揭示和挖掘乾坤丹Ⅵ號防治糖尿病腎病的有效成分、作用靶點和作用信號通路，以全面闡釋乾坤丹Ⅵ號治療DKD的可能機制，以期為乾坤丹Ⅵ號的臨床應(yīng)用和研究開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料 中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺（TCMSP，http：//tcmspw.com/tcmsp.php），Pubchem 數(shù)據(jù) 庫（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov），GeneCards數(shù)據(jù)庫（https：//www.genecards.org），人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫（OMIM，https：//www.omim.org），String數(shù)據(jù)庫（http：//stringdb.org），Cytoscape（Version 3.7.0）軟件 ，RCSB PDB 數(shù) 據(jù) 庫（http：//www.rcsb.org），autodock（Version1.5.6）軟件。

1.2 乾坤丹Ⅵ號有效化學(xué)成分及對應(yīng)靶點的篩選 基于TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索乾坤丹Ⅵ號中6味核心藥組中藥的活性成分，并保留口服利用度（OB）≥30%和類藥性（DL）≥0.18的活性成分，利用TCMSP數(shù)據(jù)庫查找所得到的活性成分對應(yīng)的靶點。通過Pubchem數(shù)據(jù)庫查找乾坤丹Ⅵ號活性成分的3D結(jié)構(gòu)，并進行能量最小化處理。

1.3 收集糖尿病腎病的疾病靶點 以“diabetic kidney disease”“diabetic nephropathy”為關(guān)鍵詞，分別在GeneCards數(shù)據(jù)庫和OMIM數(shù)據(jù)庫檢索與DKD相關(guān)的疾病靶點，剔除各數(shù)據(jù)庫重復(fù)的疾病相關(guān)靶點。

1.4 蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及關(guān)鍵靶點的分子對接 將得到的乾坤丹Ⅵ號中藥活性成分預(yù)測的靶點和DKD相關(guān)疾病靶點的交集作為關(guān)鍵靶點，基于String數(shù)據(jù)庫對關(guān)鍵靶點進行蛋白-蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)分析，基于Cytoscape軟件的MCODE插件對PPI網(wǎng)絡(luò)進行聚類分析，構(gòu)建功能模塊，設(shè)置K-Core為2。同時基于Cytoscape軟件的cytNCA插件對PPI網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)進行拓撲分析，限定物種為人，選取度中心性（DC）、中介中心性（BC）、接近中心性（CC）和特征向量中心性（EC）均大于均值的節(jié)點作為核心靶點，利用RCSB PDB數(shù)據(jù)庫檢索核心靶點的蛋白晶體結(jié)構(gòu)，并進行去水、去氫處理?；赼utodock軟件對乾坤丹Ⅵ號活性成分和關(guān)鍵靶點蛋白進行模擬分子對接，并計算分子對接的最低結(jié)合，最低結(jié)合能的絕對值越大，說明活性成分與靶點蛋白結(jié)合的活性越高[8]。

1.5 基因功能和信號通路富集分析 基因本體（GO）功能分析是生物學(xué)領(lǐng)域廣泛用于基因功能分類的系統(tǒng)，主要用于描述基因產(chǎn)物的生物過程（BP）、分子功能（MF）和細胞組分（CC）?；贑ytoscape軟件的clueGO插件對關(guān)鍵靶點進行GO功能富集分析和京都基因與基因組百科全書（KEGG）信號通路富集分析，設(shè)置篩選閾值為 P＜0.05，Q＜0.05，分析乾坤丹Ⅵ號防治DKD的靶標基因、蛋白質(zhì)分子功能、細胞內(nèi)定位及其所參與的生物學(xué)反應(yīng)和通路。借助Cytoscape軟件構(gòu)建乾坤丹Ⅵ號防治DKD的“藥物-活性成分-關(guān)鍵靶點-關(guān)鍵通路”的多層次關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)，對乾坤丹Ⅵ號通過多成分、多靶點、多信號途徑協(xié)同防治DKD的機制進行可視化分析。

2 結(jié)果

2.1 乾坤丹Ⅵ號有效化學(xué)成分及對應(yīng)的靶點 通過TCMSP數(shù)據(jù)庫共收集到符合篩選條件的乾坤丹Ⅵ號中藥活性成分109種，其中黃芪20種，山藥16種，枸杞子45種，蒼術(shù)9種，瓜蔞11種，續(xù)斷8種，剔重后得到乾坤丹Ⅵ號活性成分103種。共得到對應(yīng)的預(yù)測靶點1 165個，剔重后得到預(yù)測靶點137個，其中預(yù)測靶點高于25個的化合物有12種，見表1。

2.2 DKD疾病相關(guān)靶點 在GeneCards數(shù)據(jù)庫和OMIM數(shù)據(jù)庫以關(guān)鍵詞“diabetic kidney disease”“diabetic nephropathy”進行檢索，共收集到DKD相關(guān)疾病靶點12 003個，其中11 345個來自Genecard數(shù)據(jù)庫，658個來自O(shè)MIM數(shù)據(jù)庫，剔重后共得到疾病相關(guān)靶點11 809個。

2.3 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及關(guān)鍵靶點的分子對接 對乾坤丹Ⅵ號的化學(xué)成分靶點和DKD調(diào)控的靶點蛋白進行映射并取交集作為關(guān)鍵靶點，共得到乾坤丹Ⅵ號防治DKD的關(guān)鍵靶點128個，說明乾坤丹Ⅵ號的潛在活性成分中存在防治DKD的作用靶點?；赟tring數(shù)據(jù)庫進行PPI網(wǎng)絡(luò)分析，共得到128個節(jié)點，1273條邊，各節(jié)點的平均度值為19.9?；贑ytoscape軟件的MCODE插件對PPI網(wǎng)絡(luò)進行聚類分析，共得到6個功能模塊，模塊中每個節(jié)點的顏色深淺代表靶點的受調(diào)控度值，見圖1。根據(jù)平均DC、BC、CC和EC值對PPI網(wǎng)絡(luò)進行拓撲分析，共得到核心靶點14個，包括白細胞介素-6（IL-6）、血管內(nèi)皮生長因子（VEGFA）、轉(zhuǎn)錄因子（JUN）、表皮生長因子（EGF）、表皮生長因子受體（EGFR）等，見表2?；赼utodock軟件對乾坤丹Ⅵ號活性成分和核心靶點蛋白進行分子對接，結(jié)果顯示乾坤丹Ⅵ號的12個活性成分和前10個核心靶點蛋白的平均結(jié)合能為-6.43kcal/mol，提示乾坤丹Ⅵ號對DKD有直接的治療作用，見圖2，其中槲皮素和前列腺素內(nèi)過氧化物合酶-2（PSGT2）的結(jié)合能最高，分子對接模式展示見圖3。

圖2 乾坤丹Ⅵ號化學(xué)成分與核心靶點對接結(jié)合能熱圖Fig.2 Heat diagram of docking binding energy between chemical composition and core target of QiankundanⅥ

圖3 槲皮素與PSGT2分子對接模式圖Fig.3 Molecular docking pattern of quercetin and PSGT2

表2 乾坤丹Ⅵ號防治DKD的核心靶點信息Tab.2 Core target information of DKD prevention and control with QiankundanⅥ

2.4 富集分析 基于Cytoscape軟件中的ClueGO插件對乾坤丹Ⅵ號治療DKD的128個潛在作用靶點進行GO和KEGG信號通路富集分析，共得到2 140個GO富集結(jié)果，包括1 919個BP，96個CC，125個MF，主要的生物過程包括：細胞對藥物的反應(yīng)、對金屬離子的響應(yīng)、對營養(yǎng)水平的反應(yīng)、管徑調(diào)節(jié)、血管大小的調(diào)節(jié)等，見圖4。共得到KEGG信號通路132條，其中與DKD特異性相關(guān)的信號通路主要包括：糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路、Th17細胞分化、IL-17信號通路、鈣信號通路、雌激素信號途徑、內(nèi)分析抵抗等，見表3。核心靶點與信號通路間的相互聯(lián)系網(wǎng)絡(luò)，見圖5，6?？梢娗さあ鎏柗乐蜠KD涉及多種成分、多個靶標和多條通路，乾坤丹Ⅵ號防治DKD的“藥物-活性成分-關(guān)鍵靶點-關(guān)鍵通路”網(wǎng)絡(luò)圖，見圖7。

圖4 乾坤丹Ⅵ號防治DKD關(guān)鍵靶點的GO富集分析Fig.4 GO enrichment analysis of key targets of DKD prevention and control with QiankundanⅥ

圖5 乾坤丹Ⅵ號防治DKD的信號通路相互聯(lián)系圖Fig.5 Interaction of signal pathways of DKD prevention and control with QiankundanⅥ

圖6 乾坤丹Ⅵ號防治DKD關(guān)鍵靶點與信號通路網(wǎng)絡(luò)圖Fig.6 Key targets and signal pathways network of DKD prevention and control with QiankundanⅥ

圖7 乾坤丹Ⅵ號防治DKD的“藥物-活性成分-關(guān)鍵靶點-關(guān)鍵通路”網(wǎng)絡(luò)圖Fig.7 Network diagram of“drug-active component-key target-key pathway” of DKD prevention and control with QiankundanⅥ

表3 參與乾坤丹Ⅵ號防止DKD信號通路信息Tab.3 Information of signal pathways involved in DKD prevention and control with QiankundanⅥ

3 討論

DKD是DM晚期較為常見的微血管并發(fā)癥之一，DM導(dǎo)致的腎臟血流動力學(xué)變化，機體缺氧、氧化應(yīng)激反應(yīng)和炎癥反應(yīng)激活等協(xié)同參與了DKD的發(fā)生和發(fā)展[9]。研究發(fā)現(xiàn)，DKD的早期診斷和有效的管理心血管危險因素對延緩DKD進展具有重要意義[10]。然而，當前的臨床治療方法仍不能完全有效地防止DKD演變?yōu)镋SRD。多數(shù)研究證明，中醫(yī)藥復(fù)方在減少DKD炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激反應(yīng)，改善腎臟纖維化等方面具有較好的療效和安全性[11]。DKD屬于中醫(yī)“消渴”“尿濁”“腎勞”等病的范疇，其病機復(fù)雜，屬虛實夾雜，本虛標實之證，涉及本虛、痰濁、濕熱、腎絡(luò)虛損、三焦失司等多個角度及層次[12-13]。乾坤丹Ⅵ號以黃芪、山藥、續(xù)斷、枸杞子、蒼術(shù)、瓜蔞為核心藥組，方中黃芪、山藥健脾益氣，蒼術(shù)、瓜蔞燥濕化痰，續(xù)斷、枸杞子滋陰補腎，諸藥合伍共奏健脾補腎，祛濕化痰之功。

本研究共檢索出乾坤丹Ⅵ號中藥有效成分103種，得到預(yù)測靶點137個，其中預(yù)測靶點數(shù)目較多的乾坤丹Ⅵ號活性成分有槲皮素、山奈酚、β-谷甾醇等，藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素可以抑制腎臟細胞的增殖和活性氧（ROS）的過度生成，并減輕炎性小體的激活以及防止高糖環(huán)境對腎纖維化相關(guān)蛋白表達細胞的刺激，從而實現(xiàn)對腎臟的保護作用，減少尿液微量白蛋白的排泄[14]；山奈酚可以抑制糖尿病高血糖環(huán)境誘導(dǎo)的腎臟氧化應(yīng)激反應(yīng)和相關(guān)炎癥信號傳導(dǎo)的級聯(lián)反應(yīng)，從而改善腎臟組織的損傷[15]。與乾坤丹Ⅵ號防治DKD相關(guān)的關(guān)鍵靶點有128 個，包括 IL-6、VEGFA、JUN、EGF、EGFR、MAPK1、PTGS2等，說明乾坤丹Ⅵ號基于多成分、多靶點的特點實現(xiàn)對DKD的防治作用。分子對接結(jié)果顯示，乾坤丹Ⅵ號有效活性成分和DKD疾病相關(guān)靶點蛋白對接良好，其中槲皮素與PTGS2的結(jié)合能最高，說明槲皮素可以作用于PTGS2靶點蛋白。PTGS2是糖尿病足細胞損傷的重要介質(zhì)，高糖導(dǎo)致PTGS2在腎臟中高表達可引起血管收縮和腎臟炎癥，從而介導(dǎo)腎小球屏障受損，形成糖尿病的腎臟損傷[16]。

GO和KEGG信號通路富集分析結(jié)果顯示，細胞對藥物的反應(yīng)、對金屬離子的響應(yīng)、對營養(yǎng)水平的反應(yīng)、管徑調(diào)節(jié)、血管大小的調(diào)節(jié)等生物過程和糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路、Th17細胞分化、IL-17信號通路、鈣信號通路、TNF信號通路、HIF-1信號通路等相關(guān)作用信號通路參與了乾坤丹Ⅵ號防治DKD的作用過程。晚期糖基化終產(chǎn)物受體（RAGE）在DKD的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用[17]。有研究發(fā)現(xiàn)，在因高糖而導(dǎo)致的各類病變的腎組織細胞中均發(fā)現(xiàn)RAGE的高表達效應(yīng)[17]。DM的高糖環(huán)境誘導(dǎo)晚期糖基化終末產(chǎn)物（AGEs）的大量生成，AGEs可與RAGE特異性結(jié)合[18]，使RAGE的表達顯著性上調(diào)，導(dǎo)致RAGE下游的IL-17信號通路、鈣信號通路、TNF信號通路等復(fù)雜的炎癥信號通路激活[19]，介導(dǎo)了轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）[20]和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）[21]等炎癥因子在腎臟組織的級聯(lián)化效應(yīng)，從而介導(dǎo)了糖尿病的腎小球基膜增厚、系膜細胞增殖、腎組織纖維化等腎臟病理改變。糖尿病腎臟組織的缺氧是導(dǎo)致DKD的重要途徑[22]。糖尿病的高糖水平誘導(dǎo)低氧誘導(dǎo)因子（HIFs）活性，導(dǎo)致機體氧穩(wěn)態(tài)破壞，HIF-1信號通路激活，腎小球細胞中HIFs活性升高會促進腎小球硬化和蛋白尿[23]。

綜上所述，乾坤丹Ⅵ號調(diào)控DKD的作用機制涉及多種活性成分、多個靶點和多條信號通路，各活性成分、靶點和信號通路間協(xié)同作用，突出了乾坤丹Ⅵ號防治DKD標本兼治、多向調(diào)節(jié)的特點，揭示了乾坤丹Ⅵ號多靶點多通路綜合干預(yù)DKD的治療特色，為后續(xù)進一步臨床和實驗研究等提供了重要的科學(xué)依據(jù)，也為DKD的治療指明了新的方向。后續(xù)研究將結(jié)合上述結(jié)果和前期研究數(shù)據(jù)對關(guān)鍵靶點和信號通路進行更深一步的研究及臨床驗證。