腹部推拿對大鼠乙醇性胃黏膜損傷的修復(fù)作用及機(jī)制研究*

海興華，劉芳，駱雄飛，李華南，張瑋，王海騰，孫慶

（天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，天津 300381）

胃黏膜在維持胃的生理功能中起著重要作用，可以保護(hù)深層組織免受胃液成分的破壞和防止黏膜刺激物的攝入[1-2]。胃黏膜損傷是導(dǎo)致胃潰瘍及急慢性胃炎的主要病理生理環(huán)節(jié)[3]。針對胃黏膜損傷的治療，目前西醫(yī)尚無特效手段，而腹部推拿則善于調(diào)理脾胃疾患[4-5]，相關(guān)臨床研究已經(jīng)證實(shí)了腹部推拿治療胃黏膜損傷性疾病具有顯著療效[6-7]。然而，針對腹部推拿促進(jìn)胃黏膜損傷修復(fù)作用的相關(guān)基礎(chǔ)研究還處于初級階段，故本研究以無水乙醇致胃黏膜損傷大鼠作為研究對象，觀察腹部推拿對胃黏膜損傷的修復(fù)作用，并從調(diào)節(jié)胃黏膜攻擊因子和防御因子平衡的角度初步探討其作用機(jī)制。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 選用SPF級健康成年SD大鼠30只，6～8周齡，雌雄不限，體質(zhì)量（200±20）g[北京華阜康生物科技股份有限公司，合格證：SCXK（京）2014-0004]。

1.2 主要試劑與儀器 無水乙醇（科密歐，天津）；4%多聚甲醛（鼎國，北京）；白介素（IL）-6酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）kit（Ebioscience公司，美國）；腫瘤壞死因子（TNF）ELISA kit（Ebioscience公司，美國）；表皮生長因子（EGF）ELISA kit（Ebioscience 公司，美國）；MilliQ超純水系統(tǒng)（Millipore公司，美國）；AL204型分析天平（Mettler-toledo Instruments公司，瑞士）；ST-10組織切片機(jī)[世聯(lián)博研（北京）科技有限公司]；DW-86L628型-80℃立式超低溫保存箱（Haier公司，中國）。

2 方法

2.1 造模方法 采用無水乙醇灌胃法復(fù)制胃黏膜損傷大鼠模型。適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后，除空白對照組外，其余實(shí)驗(yàn)大鼠均禁食不禁水24 h后，按照5 mL/kg的劑量行無水乙醇灌胃1次。模型成功的標(biāo)準(zhǔn)是無水乙醇灌胃后實(shí)驗(yàn)大鼠胃黏膜出現(xiàn)條狀出血壞死，病理切片可見腺體破壞、炎性細(xì)胞浸潤等損傷表現(xiàn)。造模后2 h即進(jìn)行實(shí)驗(yàn)觀察。

2.2 分組與干預(yù)方法 采用隨機(jī)對照研究方法，運(yùn)用隨機(jī)數(shù)字表法將造模成功的胃黏膜損傷大鼠隨機(jī)分為腹部推拿組和模型組，每組各10只。同時設(shè)置10只大鼠作為空白對照組。腹部推拿組干預(yù)操作方法：實(shí)驗(yàn)大鼠取仰臥位，將其束縛于實(shí)驗(yàn)臺上。操作者右手食指、中指伸直并攏，其余3指屈曲放松，以食指、中指指腹于實(shí)驗(yàn)大鼠腹部，利用腕關(guān)節(jié)帶動兩指做回旋揉動，揉動頻率為20～30次/min，操作10 min，連續(xù)治療21 d，每日正常飼食喂水。模型組每天將實(shí)驗(yàn)大鼠束縛于實(shí)驗(yàn)臺10 min，不予任何干預(yù)。空白對照組不予任何干預(yù)。

2.3 觀察指標(biāo)及檢測方法

2.3.1 觀察大鼠行為學(xué)改變 扭體反應(yīng)：觀察實(shí)驗(yàn)大鼠扭體反應(yīng)，記錄15 min內(nèi)每只大鼠扭體反應(yīng)次數(shù)，干預(yù)前后各觀察1次。曠場實(shí)驗(yàn)：本實(shí)驗(yàn)使用曠場箱長、寬、高均為80 cm的定制塑料箱，內(nèi)壁涂黑，并將底面均分為25個小方格。測試時，將大鼠置于曠場箱底面中心，并用視頻裝置錄制其6 min內(nèi)的運(yùn)動行為。觀察指標(biāo)：以大鼠穿越底面的方格數(shù)為水平得分，以后肢站立的次數(shù)為垂直活動得分。記錄各組動物垂直活動得分、水平活動得分[8]。干預(yù)前后各測量1次。

2.3.2 標(biāo)本采集及組織病理學(xué)觀察 實(shí)驗(yàn)大鼠斷頭處死后迅速打開腹腔取胃組織，從幽門部沿胃大彎剪開，肉眼觀察胃黏膜組織損傷情況；取1 cm×1 cm胃組織標(biāo)本，置于4%多聚甲醛中固定，石蠟包埋切片，蘇木精-伊紅（HE）染色后進(jìn)行病理學(xué)觀察；剪取50～100mg胃黏膜組織，放置于2mL凍存管中，收藏于-80℃冰箱待用。

2.3.3 炎性因子和表皮生長因子檢測 將保存的胃黏膜組織以無菌剪刀剪成勻漿；將勻漿放入1.5mL離心管中，離心機(jī)離心半徑75 mm，2 500 r/min離心20 min，仔細(xì)收集上清液，放入另外的1.5 mL離心管中；采用ELISA法檢測胃黏膜組織樣本中TNF-α、IL-6和EGF水平，操作嚴(yán)格按照說明書要求進(jìn)行操作。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 扭體反應(yīng) 空白對照組大鼠行為較正常，造模后模型組和腹部推拿組大鼠扭體反應(yīng)次數(shù)顯著高于空白對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。腹部推拿干預(yù)后腹部推拿組大鼠扭體反應(yīng)次數(shù)明顯降低，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見表1。

表1 3組大鼠扭體反應(yīng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果（±s）Tab.1 Results of twisting reaction of rats in each group（±s） 次

表1 3組大鼠扭體反應(yīng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果（±s）Tab.1 Results of twisting reaction of rats in each group（±s） 次

注：與空白對照組比較，*P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.01。

組別 動物數(shù) 扭體反應(yīng)次數(shù)造模后 干預(yù)后空白對照組 10 0.30±0.48 0.20±0.42模型組 10 35.10±8.14* 26.20±5.55腹部推拿組 10 36.60±6.75* 17.20±5.12#

3.2 曠場實(shí)驗(yàn) 空白對照組大鼠活動正常，造模后模型組和腹部推拿組大鼠在曠場箱中的垂直活動得分和水平活動得分顯著低于空白對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。腹部推拿干預(yù)后腹部推拿組大鼠垂直活動得分和水平活動得分均所提升，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表2 3組大鼠曠場實(shí)驗(yàn)結(jié)果（±s）Tab.2 Results of open-field test of rats in each groups（±s） 分

表2 3組大鼠曠場實(shí)驗(yàn)結(jié)果（±s）Tab.2 Results of open-field test of rats in each groups（±s） 分

注：與空白對照組比較，*P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05。

組別 動物數(shù) 垂直活動得分 水平活動得分造模后 干預(yù)后 造模后 干預(yù)后空白對照組 10 12.20±2.10 11.90±1.66 38.20±2.65 38.60±2.17模型組 10 9.10±1.37* 7.70±1.89 30.40±2.46*27.40±3.75腹部推拿組 10 9.30±1.76* 9.40±1.71#30.60±2.59*30.80±2.20#

3.3 實(shí)驗(yàn)大鼠胃黏膜損傷程度觀察 與空白對照組比較，模型組大鼠胃黏膜出現(xiàn)較嚴(yán)重的肉眼可見的損傷，胃黏膜呈粉紅色，腺區(qū)充血、紅腫，伴有點(diǎn)狀及長短不一的條狀出血壞死，而腹部推拿組大鼠胃黏膜損傷面積和出血面積明顯減小。見圖1。

圖1 胃黏膜損傷程度觀察Fig.1 Observation on the degree of gastric mucosal injury

3.4 實(shí)驗(yàn)大鼠胃黏膜組織病理學(xué)觀察 空白對照組大鼠胃黏膜結(jié)構(gòu)完整，腺體清晰，未見明顯損傷及炎癥反應(yīng)。模型組大鼠胃黏膜損傷明顯，腺體正常結(jié)構(gòu)消失，并可見侵犯黏膜全層的病變，在黏膜下層出現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤。腹部推拿組大鼠胃黏膜上皮細(xì)胞和腺體可見破壞，但部位較淺，炎癥反應(yīng)較少。見圖2。

圖2 胃組織HE染色結(jié)果（×100）Fig.2 HE staining results of gastric tissue(×100)

3.5 腹部推拿對實(shí)驗(yàn)大鼠胃黏膜炎性因子分泌的影響 與空白對照組比較，模型組大鼠胃黏膜TNF-α、IL-6的分泌量顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。與模型組比較，腹部推拿組大鼠胃黏膜TNF-α、IL-6的分泌量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖3。

3.6 腹部推拿對實(shí)驗(yàn)大鼠胃黏膜EGF含量的影響 與空白對照組比較，模型組大鼠胃黏膜中EGF含量顯著降低，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。與模型組比較，腹部推拿組大鼠胃黏膜中EGF含量顯著升高，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見表3。

表3 3組大鼠胃黏膜EGF含量檢測結(jié)果（±s）Tab.3 Results of EGF content in gastric mucosa of rats in each groups（±s）ng/L

表3 3組大鼠胃黏膜EGF含量檢測結(jié)果（±s）Tab.3 Results of EGF content in gastric mucosa of rats in each groups（±s）ng/L

注：與空白對照組比較，*P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.01。

組別 動物數(shù) 胃黏膜EGF含量空白對照組 10 4 507.68±114.44模型組 10 3 495.51±71.85*腹部推拿組 10 4 147.87±124.12#

4 討論

胃黏膜損傷性疾病臨床表現(xiàn)主要以胃脘部疼痛不適，可伴隨噯氣、泛酸、胃脘燒灼感等癥狀，屬中醫(yī)學(xué)中“胃脘痛”的范疇。腹部推拿作為中醫(yī)推拿學(xué)中的一個重要分支，其作用于腹部，通過力學(xué)刺激直接調(diào)理脾胃臟腑及腹部循行經(jīng)脈，在治療以胃腸為主的消化系統(tǒng)疾病中療效顯著?！独逭茨σg(shù)》曰：“胸腹者，五臟六腑之官城，陰陽氣血之發(fā)源，若欲其臟腑如何，則莫如診胸腹。”體現(xiàn)了腹部與五臟六腑的密切關(guān)系。《指壓療法》一書中更是指出“腹為萬病機(jī)”，并認(rèn)為按摩腹部對于治療疾病深有影響。同時胃經(jīng)、脾經(jīng)循行均經(jīng)過腹部，雖然為腹部推拿治療胃黏膜損傷性疾病提供了中醫(yī)理論基礎(chǔ)，但仍缺乏相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究對其療效進(jìn)行驗(yàn)證。

現(xiàn)代研究表明，胃黏膜損傷的發(fā)生是胃黏膜攻擊因子與防御因子失調(diào)所致[8-9]。攻擊因子主要包括胃酸及白介素、TNF、胃蛋白酶等；防御因子主要有胃黏膜EGF、一氧化氮及前列腺素等[10]。調(diào)節(jié)攻擊因子和防御因子的平衡是治療胃黏膜損傷類疾病的關(guān)鍵。無水乙醇灌胃法復(fù)制胃黏膜損傷大鼠模型的病變特點(diǎn)、潰瘍外形、病理組織學(xué)特點(diǎn)、修復(fù)、愈合、復(fù)發(fā)過程與人胃黏膜損傷類似，且制作方便，重復(fù)性高，尤其適用于胃黏膜損傷相關(guān)機(jī)制研究[11]。故本研究采用無水乙醇灌胃法復(fù)制胃黏膜損傷大鼠模型，造模成功后從行為學(xué)、解剖學(xué)、病理學(xué)等方面觀察腹部推拿對胃黏膜損傷的修復(fù)作用，同時檢測胃黏膜炎性因子和EGF含量，進(jìn)一步探討腹部推拿促進(jìn)胃黏膜損傷修復(fù)的作用機(jī)制。

本研究結(jié)果顯示，造模后大鼠出現(xiàn)了明顯的扭體反應(yīng)，并且在曠場實(shí)驗(yàn)中的垂直活動得分和水平活動得分均減少。予腹部推拿干預(yù)后，模型大鼠扭體反應(yīng)及曠場實(shí)驗(yàn)得分均有改善，證明了腹部推拿可以改善胃黏膜損傷大鼠的異常行為學(xué)改變。通過對實(shí)驗(yàn)大鼠胃黏膜組織解剖學(xué)及病理學(xué)觀察，結(jié)果顯示，造模后實(shí)驗(yàn)大鼠胃黏膜出現(xiàn)了較為嚴(yán)重的肉眼可見的損傷，并且從病理學(xué)方面可以觀察到胃黏膜腺體正常結(jié)構(gòu)消失，黏膜下層出現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤等病理改變；而經(jīng)過腹部推拿干預(yù)后，胃黏膜損傷程度均有明顯改善，證明了腹部推拿可以促進(jìn)胃黏膜損傷的修復(fù)。經(jīng)對胃黏膜損傷部位進(jìn)行總蛋白提取，并分析關(guān)鍵攻擊因子TNF-α、IL-6和防御因子EGF的變化，結(jié)果顯示，造模后TNF-α、IL-6的分泌量明顯升高，EGF明顯降低；而腹部推拿干預(yù)后，TNF-α和IL-6分泌量均有所降低，同時EGF明顯升高，初步表明了腹部推拿促進(jìn)胃黏膜修復(fù)的作用機(jī)制可能是通過調(diào)節(jié)胃黏膜攻擊因子和防御因子的平衡來實(shí)現(xiàn)的。但是胃黏膜損傷性疾病在發(fā)病過程中攻擊因子和防御因子種類繁多，且相互作用，而腹部推拿的調(diào)節(jié)機(jī)制，仍有待進(jìn)一步深入研究。