趙進(jìn)喜教授治療2型糖尿病的核心處方挖掘及生物學(xué)機(jī)制探討

孫瑞茜 ，傅強(qiáng) ，王逗逗 ，南赫 ，吳雙 ，趙進(jìn)喜

（1.北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院腎病內(nèi)分泌科，北京 100700；2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院，杭州 310005）

糖尿病及其引發(fā)的一系列并發(fā)癥嚴(yán)重危害著人類健康，糖尿病的防治工作面臨著非常嚴(yán)峻的形勢(shì)。糖尿病相當(dāng)于中醫(yī)學(xué)的消渴病，中醫(yī)藥治療糖尿病具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，越來(lái)越受到人們的關(guān)注與重視。趙進(jìn)喜教授是北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院首席專家，國(guó)家中醫(yī)藥管理局內(nèi)分泌重點(diǎn)學(xué)科帶頭人，國(guó)醫(yī)大師呂仁和教授的學(xué)術(shù)繼承人，在治療糖尿病及其并發(fā)癥方面有豐富的經(jīng)驗(yàn)和確切的療效。本研究收集了趙進(jìn)喜教授325例2型糖尿病醫(yī)案，應(yīng)用數(shù)據(jù)挖掘技術(shù)篩選趙進(jìn)喜教授治療2型糖尿病的核心藥物配伍，針對(duì)中藥具有多成分，多靶點(diǎn)的特點(diǎn)，利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)，篩選核心組方的主要作用成分及靶點(diǎn)，構(gòu)建核心組方治療疾病的靶點(diǎn)基因網(wǎng)絡(luò)。對(duì)基因網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行模塊劃分，并進(jìn)行基因富集分析，以探索其作用機(jī)制，為進(jìn)一步研究提供思路。

1 研究方法

1.1 核心處方挖掘

1.1.1 研究對(duì)象 本研究納入趙進(jìn)喜教授2017—2019年門診及病房診治的2型糖尿病患者病案，共納入病案325例。

1.1.2 納入及排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：1）年齡18～85歲，性別不限。2）符合2型糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)。3）醫(yī)案記錄完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：1）嚴(yán)重肝腎疾病。2）合并心肌梗死、心力衰竭、腦血管意外等危急重癥。3）腫瘤。

1.1.3 數(shù)據(jù)處理 對(duì)藥物及癥狀進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，采用Microsoft office Excel 2016進(jìn)行數(shù)據(jù)錄入，建立病案數(shù)據(jù)庫(kù)，為了方便數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析，采用二值量化法進(jìn)行變量統(tǒng)計(jì)，“1”為“有”，“0”為“無(wú)”。

1.1.4 關(guān)聯(lián)規(guī)則分析 應(yīng)用Weka3.8進(jìn)行藥物和關(guān)聯(lián)規(guī)則分析，其中支持度表示項(xiàng)目A和項(xiàng)目B同時(shí)出現(xiàn)的比例，置信度表示包含項(xiàng)目A的事物同時(shí)包含項(xiàng)目B的比例，提升度表示項(xiàng)目A和項(xiàng)目B的相關(guān)性。設(shè)定最小支持度為0.05，最小置信度為0.8，得到藥物組合，篩選出支持度＞0.3的組合，并對(duì)藥物核心組合進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)可視化。

1.2 核心處方靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析

1.2.1 核心處方化學(xué)成分收集和篩選 使用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)（TCMSP）篩選核心處方的化學(xué)成分。借助TCMSP平臺(tái)的參數(shù)篩選活性成分，設(shè)定藥物成分口服生物利用度（OB）≥30%，類藥性（DL）≥0.18[1]。

1.2.2 核心處方及2型糖尿病相關(guān)靶點(diǎn)獲取 應(yīng)用TCMSP平臺(tái)，獲取活性成分相應(yīng)的靶點(diǎn)；應(yīng)用蛋白-化合物相互作用數(shù)據(jù)庫(kù)STITCH 5.0[2]，選擇置信度≥0.7的靶點(diǎn)。取靶點(diǎn)的交集，建立藥物靶點(diǎn)數(shù)據(jù)集。基于TTD數(shù)據(jù)庫(kù)、DrugBank數(shù)據(jù)庫(kù)、GAD數(shù)據(jù)庫(kù)和DisGeNET數(shù)據(jù)庫(kù)，以“Type2 Diabetes Mellitus”為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索，篩選2型糖尿病相關(guān)靶點(diǎn)。

1.2.3 藥物-化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將核心處方靶點(diǎn)基因和2型糖尿病相關(guān)靶標(biāo)基因匹配，獲得核心處方治療2型糖尿病的潛在靶點(diǎn)。將靶點(diǎn)信息導(dǎo)入STRING 11.0數(shù)據(jù)庫(kù)，獲得靶點(diǎn)蛋白相互作用關(guān)系，使用 Cytoscape[3]（Version3.5.1）構(gòu)建藥物-化合物-靶點(diǎn)”關(guān)系網(wǎng)絡(luò)及靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)。

1.2.4 模塊劃分及功能分析 將靶點(diǎn)導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫(kù)獲取蛋白相互作用關(guān)系，采用Cytoscape中的MCODE插件對(duì)靶點(diǎn)蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行聚類分析，即對(duì)網(wǎng)絡(luò)中緊密連接的靶點(diǎn)所形成的模塊進(jìn)行識(shí)別。應(yīng)用Cytoscape的ClueGO插件進(jìn)行富集分析（P＜0.01）。

2 研究結(jié)果

2.1 基于關(guān)聯(lián)規(guī)則的核心藥物組合分析 本研究共納入325例醫(yī)案，其中男159例，占48.9%，女166例，占50.9%。對(duì)325個(gè)處方進(jìn)行藥物頻數(shù)統(tǒng)計(jì)，共涉及藥物261味，其中使用頻率最高的藥物為丹參、黃芩、葛根、白芍和荔枝核。應(yīng)用Weka3.8進(jìn)行關(guān)聯(lián)規(guī)則分析，設(shè)定最小支持度為0.05，最小置信度為0.8。在結(jié)果中篩選支持度≥0.3的組合，得到16味核心藥物，為赤芍、鬼箭羽、夏枯草、白芍、半夏、陳皮、黃連、柴胡、甘草、茯苓、丹參、黃芩、葛根、地骨皮、荔枝核和仙鶴草，見(jiàn)圖1。提升度表明關(guān)聯(lián)中藥之間的相關(guān)性，按提升度大小排序，得到位于前3位藥物組合均為六藥組合，組成為黃芩、葛根、仙鶴草、丹參、荔枝核、地骨皮，視為此次研究得到的核心藥物組合，見(jiàn)表1。

圖1 核心藥物組合網(wǎng)絡(luò)圖Fig.1 Network of core drugs

表1 核心藥物組合關(guān)聯(lián)規(guī)則分析表Tab.1 Association rules of core drug combinations

2.2 活性成分篩選及相關(guān)靶點(diǎn)獲得 通過(guò)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)檢索藥物化學(xué)成分，并通過(guò)OB≥30%和DL≥0.18進(jìn)一步篩選出潛在活性成分，得到丹參活性成分65個(gè)，黃芩活性成分36個(gè)，葛根活性成分4個(gè)，荔枝核活性成分8個(gè)，地骨皮活性成分13個(gè)，仙鶴草活性成分5個(gè)。通過(guò)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)及STICH數(shù)據(jù)庫(kù)獲得活性成分的相關(guān)靶點(diǎn)，刪除重復(fù)靶點(diǎn)，得到丹參靶點(diǎn)201個(gè)，黃芩靶點(diǎn)184個(gè)，荔枝核靶點(diǎn)292個(gè)，地骨皮靶點(diǎn)205個(gè)，仙鶴草靶點(diǎn)74個(gè)，葛根靶點(diǎn)59個(gè)。

2.3 藥物-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 通過(guò)DrugBank數(shù)據(jù)庫(kù)、TTD數(shù)據(jù)庫(kù)和DisGeNET數(shù)據(jù)庫(kù)，共收集到350個(gè)2型糖尿病相關(guān)靶點(diǎn)。將2型糖尿病相關(guān)靶點(diǎn)和藥物靶點(diǎn)相匹配，獲得58個(gè)共同靶點(diǎn)。將中藥、活性成分、靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape軟件進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及可視化，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 核心處方-活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖Fig.2 Core prescription-active ingredients-target network

2.4 模塊劃分及靶點(diǎn)蛋白網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將靶點(diǎn)導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫(kù)獲取蛋白相互作用關(guān)系，得到靶點(diǎn)蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)，見(jiàn)圖3，應(yīng)用Cytoscape中的MCODE插件對(duì)靶點(diǎn)蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行模塊識(shí)別，MCODE可以在蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)中檢測(cè)密集連接區(qū)域，將每一個(gè)區(qū)域劃分為一個(gè)功能模塊，一共劃分出5個(gè)模塊，見(jiàn)圖4。根據(jù)MCODE評(píng)分（密度×節(jié)點(diǎn)數(shù)）排序，評(píng)分最大為10，最小為2。

圖3 靶點(diǎn)蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)Fig.3 Network diagram of target spot-protein interaction

圖4 MCODE算法劃分的靶點(diǎn)蛋白網(wǎng)絡(luò)模塊Fig.4 Target protein network module identified by MCODE algorithm

應(yīng)用Cytoscape將蛋白相互作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò)可視化，靶點(diǎn)蛋白網(wǎng)絡(luò)共包括58個(gè)節(jié)點(diǎn)，以Degree（連接度）數(shù)值反映節(jié)點(diǎn)的大小，Degree指與該節(jié)點(diǎn)相關(guān)聯(lián)的“邊”的條數(shù)。Degree數(shù)值越大，節(jié)點(diǎn)越大，表明這些靶點(diǎn)參與可更多的生物功能，在網(wǎng)絡(luò)中具有重要地位。將Degree值排名為前30的靶點(diǎn)作為核心靶點(diǎn)，和MCOEE劃分出的功能模塊相匹配，發(fā)現(xiàn)核心靶點(diǎn)集中在模塊1、模塊2、模塊3和模塊5中，見(jiàn)表2。

表2 核心藥物組合治療T2DM的靶點(diǎn)蛋白（Degree值排名前30位）Tab.2 Target protein of T2DM treated by core drug combination（Degree value ranked top 30）

2.5 核心靶點(diǎn)KEGG通路分析 應(yīng)用Cytoscape中的ClueGO插件，對(duì)核心靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG通路分析，其中節(jié)點(diǎn)越大，表明富集的靶點(diǎn)越多，顏色相近表示功能相近，見(jiàn)圖5、6。結(jié)果顯示，核心靶點(diǎn)SLC2A2、SLC2A4和TNF富集在2型糖尿病通路（TypeⅡdiabetes mellitus）上，與其相連接的化合物為 wogonin（黃芩素）、quercetin（槲皮素）、luteolin（葉黃素）、kaempferol（山奈酚）、cryptotanshinone（隱丹參酮），可能為核心處方治療疾病的重要活性成分。其他核心靶點(diǎn)主要富集在PPAR signaling pathway[LPL，PPARA，PPARG，RXRA]、Adipocytokine signaling pathway[PPARA，RXRA，SLC2A4，TNF]、Bile secretion[ABCB1，ABCB11，ABCG2，HMGCR，RXRA，SLCO1B1]、Chemicalcarcinogenesis[CYP1A1，CYP1A2，CYP2C8，CYP2C9，PTGS2，UGT1A1，UGT1A3，UGT1A9]等相關(guān)通路上。

圖5 核心靶點(diǎn)KEGG通路富集分析網(wǎng)絡(luò)圖Fig.5 KEGG pathway enrichment analysis for core targets

圖6 核心靶點(diǎn)KEGG通路富集分析表Fig.6 KEGG pathway enrichment analysis for core targets table

3 討論

應(yīng)用關(guān)聯(lián)規(guī)則算法對(duì)325個(gè)臨床醫(yī)案進(jìn)行分析后，得到16味核心藥物，包括赤芍、鬼箭羽、夏枯草、白芍、半夏、陳皮、黃連、柴胡、甘草、茯苓、丹參、黃芩、葛根、地骨皮、荔枝核和仙鶴草。篩選其中提升度最大的藥物組合，最終得到黃芩、葛根、丹參、仙鶴草、荔枝核、地骨皮等6味藥物的核心組合。趙進(jìn)喜教授強(qiáng)調(diào)消渴病“病由熱生”，其基本病機(jī)為“熱傷氣陰”，火熱熾盛，蘊(yùn)結(jié)日久，日久則絡(luò)脈多瘀，變生百癥。因此臨床在益氣養(yǎng)陰的同時(shí)，特別強(qiáng)調(diào)清熱治法，久病則強(qiáng)調(diào)化瘀通絡(luò)治法，且注重解決發(fā)病過(guò)程中變生的瘀血、痰濕、氣滯等病理要素[4-6]。此核心藥物組合中，黃芩可清熱解毒，葛根生津止渴，丹參活血祛瘀，地骨皮清肺降火，荔枝核行氣止痛，仙鶴草可益氣增力而不助熱。既可清熱、益氣、生津，又可活血、行氣，因此是治療2型糖尿病的重要藥物組成。在現(xiàn)代研究中，丹參具有抗氧化、抗心肌缺血、抗血栓、抗炎等作用機(jī)制，能夠降血糖，提高胰島素敏感性，改善胰島素抵抗[7-9]。葛根能夠抗氧化、增加胰島素敏感性，改善糖脂代謝[10]。黃芩具有抗炎、抗病毒、抗菌、抗氧化、心血管保護(hù)、抗高血糖的作用[11]。地骨皮、荔枝核、仙鶴草也均有抗炎、抗氧化、降血糖的作用[12-14]。

中藥具有多靶點(diǎn)、多途徑、多環(huán)節(jié)、化學(xué)成分復(fù)雜的特點(diǎn)，因此其作用機(jī)制的研究常常十分困難，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)利用大數(shù)據(jù)分析來(lái)進(jìn)行藥物研究，可以從復(fù)雜生物網(wǎng)絡(luò)角度，對(duì)疾病機(jī)制和藥物作用機(jī)制開展系統(tǒng)性研究[15]，因此十分適用于中藥尤其是中藥復(fù)方的機(jī)制探索和研究。研究發(fā)現(xiàn)，核心組方藥物中的黃芩素、槲皮素、葉黃素、山奈酚和隱丹參酮等成分，可能為核心處方的重要活性成分，其作用的重要靶點(diǎn)包括SLC2A2、SLC2A4和TNF，富集在2型糖尿病通路上。SLC2A2、SLC2A4等葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白介導(dǎo)血糖的內(nèi)流，高血糖發(fā)生時(shí)，血糖通過(guò)SLC2A2進(jìn)入肝細(xì)胞。而脂肪組織和肌肉對(duì)葡萄糖的攝取主要由SLC2A4介導(dǎo)，在葡萄糖的利用中起重要作用[16]，TNF-α可以通過(guò)調(diào)節(jié)胰島素信號(hào)通路中關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子的表達(dá)，促進(jìn)外周組織的胰島素抵抗，同時(shí)可作為一種獨(dú)立的細(xì)胞毒素，直接作用于胰島β細(xì)胞，導(dǎo)致胰島素分不足[17-18]，因此均是糖尿病藥物研發(fā)的重要靶標(biāo)。此外，本次研究發(fā)現(xiàn)，核心組方治療2型糖尿病的機(jī)制與脂肪因子信號(hào)通路和PPAR信號(hào)通路密切相關(guān)，相關(guān)靶點(diǎn)包括PPARA，PPARG等。PPAR可調(diào)控脂肪酸代謝相關(guān)基因的表達(dá)[19]，PPARA可以調(diào)節(jié)脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)和氧化以及脂蛋白循環(huán)和膽固醇代謝，與動(dòng)脈粥樣硬化、非酒精性脂肪肝、糖尿病等疾病的發(fā)生發(fā)展近密切相關(guān)。PPARG信號(hào)通路是調(diào)控脂肪代謝的主要信號(hào)通路，參與脂肪代謝、葡萄糖代謝、胰島素敏感等重要生物過(guò)程。

本研究通過(guò)數(shù)據(jù)挖掘歸納了趙進(jìn)喜教授治療2型糖尿病的核心處方，組成為黃芩、葛根、丹參、仙鶴草、荔枝核和地骨皮，其化學(xué)成分復(fù)雜，因此需通過(guò)多靶點(diǎn)、多途徑、多環(huán)節(jié)發(fā)揮作用。黃芩素、槲皮素、葉黃素、山奈酚和隱丹參酮可能為核心處方治療疾病的重要活性成分，其作用的重要靶點(diǎn)包括SLC2A2、SLC2A4、TNF，PPARA 和 PPARG 等。本研究以數(shù)據(jù)挖掘和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)相結(jié)合的方式，從臨床醫(yī)案中挖掘出有效核心處方，又對(duì)其重要活性成分、作用機(jī)制等進(jìn)行探索，可以為進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究提供重要依據(jù)。