丹參通絡(luò)解毒湯對缺氧/復氧大鼠心肌微血管內(nèi)皮細胞自噬及血管生成的影響

劉仕成，李鑫輝，陳欣

丹參通絡(luò)解毒湯對缺氧/復氧大鼠心肌微血管內(nèi)皮細胞自噬及血管生成的影響

劉仕成，李鑫輝，陳欣

湖南中醫(yī)藥大學，湖南 長沙 410208

觀察丹參通絡(luò)解毒湯藥物血清對缺氧/復氧大鼠心肌微血管內(nèi)皮細胞（CMECs）自噬及血管生成的影響，探討其作用機制。建立CMECs缺氧/復氧損傷模型，將CMECs隨機分為空白組、模型組、丹參通絡(luò)解毒湯藥物血清組、3-MA自噬抑制劑組，除空白組外其余各組均置于低糖無血清DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，同時置于37 ℃、94%N2、1%O2、5%CO2培養(yǎng)箱中缺氧2 h，換正常DMEM培養(yǎng)基，給氧3 h，再給予相應藥物干預。倒置顯微鏡觀察CMECs細胞生長及形態(tài)，檢測試劑盒測定培養(yǎng)液中乳酸脫氫酶（LDH）活性，Western blot檢測自噬相關(guān)蛋白Beclin 1、p62及血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）表達，免疫熒光檢測CMECs細胞特征性表面標志物蛋白CD34表達。與空白組比較，模型組CMECs細胞壞死程度增加，培養(yǎng)液中LDH含量明顯增加（＜0.01），Beclin 1、VEGF蛋白表達明顯升高（＜0.01，＜0.05），p62蛋白表達明顯降低（＜0.01），CD34蛋白紅色熒光明顯減弱；與模型組比較，丹參通絡(luò)解毒湯藥物血清組和3-MA自噬抑制劑組CMECs細胞壞死程度減輕，培養(yǎng)液中LDH含量明顯減少（＜0.01），Beclin 1蛋白表達明顯降低（＜0.01），p62、VEGF蛋白表達明顯升高（＜0.01，＜0.05），CD34蛋白紅色熒光明顯增強。丹參通絡(luò)解毒湯能適度抑制缺氧/復氧CMECs細胞自噬，從而促進血管生成，達到保護CMECs細胞的目的。

丹參通絡(luò)解毒湯；心肌缺血再灌注損傷；心肌微血管內(nèi)皮細胞；自噬；血管生成；大鼠

急性心肌損傷（acute myocardial injury，AMI）后缺血組織血管驟然再通與血液復流，將進一步加重病理損傷，即心肌缺血再灌注損傷（myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI）。目前，再灌注引起血管內(nèi)皮細胞結(jié)構(gòu)損傷和功能異常、炎癥因子激活及自噬性死亡等MIRI已成為心血管領(lǐng)域研究熱點[1-2]。研究發(fā)現(xiàn)，再灌注可誘發(fā)心肌細胞過度自噬，使凋亡抑制基因Bcl-2表達下調(diào)，增加細胞凋亡，擴大梗死面積，降低左室射血分數(shù)，影響左室重構(gòu)[3]。研究表明，心肌缺血早期，自噬被激活，促進血管生成；再灌注期，自噬進一步加劇反而抑制血管生成，心肌損傷加重[4]。目前，如何運用中醫(yī)藥達到治療性血管生成作用，促進藥物建立側(cè)支循環(huán)即實現(xiàn)“藥物搭橋”已成為治療心肌缺血的新方向。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，丹參通絡(luò)解毒湯能適度抑制MIRI引起的過度自噬以減輕心肌損傷，并可聯(lián)合內(nèi)皮祖細胞上調(diào)血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、堿性成纖維生長因子（bEGF），促進血管生成以保護受損心肌[5-6]。本實驗在前期研究基礎(chǔ)上，觀察丹參通絡(luò)解毒湯藥物血清對缺氧/復氧心肌微血管內(nèi)皮細胞（CMECs）自噬及血管生成相關(guān)因子的影響，探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 細胞株和動物

大鼠CMECs購于武漢普諾賽生命科技有限公司。SPF級雄性SD大鼠30只，體質(zhì)量220～260 g，購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，動物許可證號SYXK（湘）2016-0002。常規(guī)飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學動物實驗中心SPF級動物房。

1.2 藥物

丹參通絡(luò)解毒湯（丹參15 g，生地黃15 g，金銀花10 g，連翹10 g，玄參15 g，麥冬12 g，黃連6 g，梔子15 g，檀香10 g，黃芪30 g，當歸10 g，川芎10 g，紅花10 g，水蛭6 g），飲片購于湖南中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院中藥房，常規(guī)煎煮2次，合并2次藥液，濃縮為含原藥材4 g/mL，置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 主要試劑與儀器

大鼠CMECs完全培養(yǎng)基（普諾賽，貨號CM-R135），0.25%胰酶-EDTA（Gibco，貨號25200056），CCK8試劑盒（Biosharp，貨號BS350B），PBS（Solarbio，貨號blz-0099），乳酸脫氫酶（LDH）試劑盒（上海聯(lián)邁生物工程有限公司，貨號GWB-4F1107），RIPA裂解液（武漢皮諾飛生物科技有限公司，貨號P2002），3-甲基腺嘌呤（3-MA，HyClone，貨號S24823-1g），胎牛血清（FBS，HyClone，貨號SH30109.03），青鏈霉素混合液（上海吉至生化有限公司，貨號AP1400-100），VEGF抗體（Sino Biological，貨號101465-MM02），Beclin 1抗體（Sino Biological，貨號201473-T38），p62抗體（Fine Test，貨號FNab06087），HRP goat anti-mouse IgG（Proteintech，貨號SA00001-1），HRP goat anti-rabbit IgG（Proteintech，貨號SA00001-2）。CO2飽和濕度細胞培養(yǎng)箱（美國Thermo），倒置顯微鏡（日本Olympus公司，CKX53），-70 ℃低溫冰箱（美國Thermo Fisher），低溫高速離心機（德國Eppendorf，5427R），恒溫水浴箱（上海精宏，DK-SD），酶標儀（Molecular Devices，HBS- 1096A），倒置熒光顯微鏡（日本Nikon）。

1.4 藥物血清制備

將30只大鼠隨機分為對照血清組和藥物血清組，各15只。藥物劑量按人（60 kg）與動物體表面積換算，灌胃丹參通絡(luò)解毒湯藥液3.9 mL/（kg?d）[相當于原藥材15.6 g/（kg?d）]，對照血清組給予等體積蒸餾水灌胃，2次/d，連續(xù)7 d。末次給藥2 h后，大鼠腹腔注射水合氯醛麻醉，腹主動脈插管，用無菌不抗凝管采血，室溫靜置2 h，3000 r/min離心15 min，取上清液，0.22 μm濾膜過濾，再56 ℃滅活30 min，分裝，-20 ℃冰箱中保存，用DMEM培養(yǎng)基稀釋成相應體積分數(shù)的藥物血清備用。

1.5 缺氧/復氧細胞模型建立

將CMECs加入含1%青鏈素雙抗混合液及10%FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基，置于37 ℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待細胞生長80%～90%，棄去原培養(yǎng)液，PBS沖洗3次，替換成無血清低糖DMEM培養(yǎng)基，置于37 ℃，氣體體積分數(shù)為94%N2、1%O2、5%CO2培養(yǎng)箱中缺氧2 h，再復氧并換正常DMEM培養(yǎng)基，置于37 ℃、95%O2、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)3 h。

1.6 CCK8法篩選藥物血清最佳實驗濃度

取對數(shù)生長期CMECs，加胰酶消化，加培養(yǎng)液終止消化并離心，棄上清液，PBS重懸，制成密度為5×104個/mL細胞懸液，接種于96孔板，貼壁后配制體積分數(shù)為5%、10%、15%、20%、25%藥物血清，空白組加等量含正常大鼠血清的DMEM培養(yǎng)基，每孔加100 μL完全培養(yǎng)基和CCK8溶液10 μL，避光37 ℃孵育2 h，于酶標儀波長450 nm處檢測吸光度（OD值），計算最佳藥物血清濃度。

1.7 分組及給藥

采用隨機數(shù)字表法將處于對數(shù)生長期的CMECs隨機分為空白組、模型組、丹參通絡(luò)解毒湯藥物血清組（藥物血清組）、3-MA自噬抑制劑組（3-MA組）?？瞻捉M用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于37 ℃、95%空氣、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)28 h；模型組用低糖無血清DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于37 ℃、94%N2、1%O2、5%CO2培養(yǎng)箱中缺氧2 h，換正常DMEM培養(yǎng)基再給氧3 h；藥物血清組按模型組方法造模后，加最佳藥物血清濃度培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h；3-MA組加3-MA（10 mmol/L）預培養(yǎng)30 min后造模。

1.8 細胞形態(tài)觀察

倒置顯微鏡觀察CMECs生長及形態(tài)變化。

1.9 比色光度法檢測乳酸脫氫酶含量

實驗結(jié)束后收集細胞上清液，胰酶消化，離心后取上清液，按照試劑盒說明書進行操作，測定LDH含量。

1.10 Western blot檢測Beclin 1、p62及血管內(nèi)皮生長因子蛋白表達

PBS洗滌細胞，加入RIPA裂解液，冰上裂解30 min，4 ℃、12 000 r/min離心5 min，收集上清液，BCA法測定蛋白濃度并定量；蛋白樣品上樣，10%SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)移至PVDF膜，迅速置于TBS液，室溫含5%脫脂奶粉TBST中封閉1 h；洗滌后用一抗、二抗按相應比例稀釋后孵育，TBST洗3次，每次10 min，用ECL-Plus試劑發(fā)光，Image J 6.0分析蛋白表達條帶。

1.11 免疫熒光檢測CD34蛋白表達

細胞胰酶消化制成細胞懸液，1×105個/孔接種于6孔板，按“1.7”項下方法培養(yǎng)。PBS洗3次，每次4 min；4%多聚甲醛固定20 min；PBS洗3次，每次5 min；常溫滴加200 μL FBS，室溫孵育封閉1 h；滴加50～100 μL一抗，室溫避光孵育過夜，PBS洗3次，每次4 min；滴加50～100 μL二抗，室溫避光孵育1 h；最后滴加50～100 μL DAPI染核，室溫避光孵育10 min。同時做同型對照，不加一抗，步驟同前，熒光顯微鏡觀察并拍照。

1.12 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 細胞形態(tài)

空白組細胞形態(tài)規(guī)則，呈梭形或多角形，貼壁生長良好，折光性強，懸浮細胞極少；模型組細胞形態(tài)不規(guī)則，并有大量懸浮細胞，細胞間隙增大，折光性減弱，胞質(zhì)中有空泡和顆粒；藥物血清組及3-MA組細胞大部分形態(tài)規(guī)則，細胞間隙不明顯，折光性良好，細胞質(zhì)可見少量零散顆粒，有少量懸浮細胞。

2.2 藥物血清最佳實驗濃度篩選結(jié)果

丹參通絡(luò)解毒湯藥物血清干預后，與空白組比較，不同濃度藥物血清對CMECs細胞活力有明顯影響（＜0.05），其中15%藥物血清效果最佳，見表1。因此，后續(xù)實驗選用15%藥物血清。

表1 不同濃度丹參通絡(luò)解毒湯藥物血清對大鼠CMECs細胞活力的影響（±s）

注：與空白組比較，*＜0.05，**＜0.01

2.3 丹參通絡(luò)解毒湯對模型細胞乳酸脫氫酶含量的影響

與空白組比較，模型組、藥物血清組、3-MA組CMECs LDH含量明顯增加（＜0.01）；與模型組比較，藥物血清組和3-MA組LDH含量明顯減少（＜0.01）。結(jié)果見圖1。

2.4 丹參通絡(luò)解毒湯對模型細胞Beclin 1、p62、血管內(nèi)皮生長因子表達的影響

與空白組比較，模型組CMECs Beclin 1、VEGF蛋白表達明顯升高，p62蛋白表達明顯降低（＜0.01）；與模型組比較，藥物血清組、3-MA組CMECs Beclin 1蛋白表達明顯降低，p62、VEGF蛋白表達明顯升高（＜0.01，＜0.05）。結(jié)果見圖2。

2.5 丹參通絡(luò)解毒湯對模型細胞CD34表達的影響

免疫熒光染色顯示，細胞核染成藍色熒光，CD34著色于細胞質(zhì)，CD34陽性表達為紅色熒光。與空白組比較，模型組CMECs熒光強度減弱，CD34蛋白表達降低；與模型組比較，藥物血清組和3-MA組CMECs紅色熒光明顯增強，CD34蛋白表達明顯升高。結(jié)果見圖3。

注：A.空白組；B.模型組；C.藥物血清組；D. 3-MA組；與空白組比較，**P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01

注：A.空白組；B.模型組；C.藥物血清組；D. 3-MA組；與空白組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

圖3 各組大鼠CMECs CD34蛋白陽性表達（免疫熒光，×200）

3 討論

MIRI屬中醫(yī)學“胸痹”范疇，總體呈氣陰虧虛、熱毒血瘀、心脈受損之本虛標實之證。本研究針對復雜病機，發(fā)揮中藥多靶點、多向調(diào)節(jié)的優(yōu)勢，取《溫病條辨》清營湯與《時方歌括》丹參飲合方加減組成丹參通絡(luò)解毒湯，該方損益結(jié)合、標本兼治，主以治標，共奏涼營解毒、活血通絡(luò)、益氣養(yǎng)陰之效[7]。

心肌細胞受損或壞死時，LDH從受損細胞中釋放進入血液，作為檢測心肌細胞損傷的常規(guī)指標，LDH具有較強的特異性。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組CMECs明顯受損，丹參通絡(luò)解毒湯藥物血清組缺氧/復氧后CMECs LDH含量明顯減少，提示本方可改善缺氧/復氧后的CMECs損傷。

自噬是維持真核細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)的重要機制之一，常態(tài)下，自噬保持正常或稍高水平，呈適度狀態(tài)，以調(diào)節(jié)、穩(wěn)定細胞結(jié)構(gòu)與功能[8]。應激狀態(tài)下，自噬能將功能異常的蛋白質(zhì)和受損或老化細胞器降解成氨基酸、核苷酸等[9]。在感染、炎癥反應、氧化應激、缺血缺氧等情況下，誘發(fā)細胞過度自噬進而損傷細胞或誘導細胞自噬性死亡[10-11]。自噬啟動因子Beclin 1與Bcl-2/Bcl-XL解離并激活Ⅲ型PI3K是啟動自噬的關(guān)鍵。相較于心肌缺血期，Beclin l蛋白在MIRI期大量增加，阻礙自噬體的清除，加重心肌細胞的凋亡[12]。一般情況下，p62蛋白水平高低與自噬活性成反比，即自噬減弱而p62表達升高，p62蛋白增多表明自噬/溶酶體降解途徑受到抑制[13]。Western blot檢測結(jié)果顯示，藥物血清組和3-MA組較模型組均能下調(diào)自噬蛋白Beclin 1的表達，上調(diào)自噬蛋白p62的表達，在一定程度上可抑制CMECs自噬。

血管生成是在促血管生成因子和抑制因子協(xié)調(diào)作用下，使血管內(nèi)皮細胞激活、增殖、遷移形成新的血管網(wǎng)絡(luò)的復雜過程。缺血缺氧時，機體應激性地通過促血管生成因子建立側(cè)支循環(huán)以改善心肌損傷[14]。研究表明，中藥能加速代償循環(huán)血液供應，增加微血管密度數(shù)量，改善梗死區(qū)缺血缺氧，減少心肌細胞損傷與凋亡，縮小梗死面積，改善心功能[15-16]。VEGF是一種高度特異性的促血管內(nèi)皮細胞生長因子。在低氧環(huán)境下，VEGF與內(nèi)皮細胞膜上的受體結(jié)合，引起受體的自身磷酸化，從而激活有絲分裂原活化蛋白激酶，實現(xiàn)VEGF的有絲分裂原特性，誘導內(nèi)皮細胞增生。同時VEGF明顯促進血管內(nèi)皮再生，提高血管通透性，促進血管內(nèi)皮細胞遷移、增殖和血管形成等。CD34是主要表達在人或鼠的血管內(nèi)皮細胞和造血干細胞表面的跨膜糖蛋白，是內(nèi)皮細胞表面特征性標記物之一，其表達水平能較好地反映內(nèi)皮細胞狀態(tài)，又能反映新生血管程度。Western blot檢測結(jié)果顯示，藥物血清組和3-MA組較模型組VEGF表達升高，且藥物血清組優(yōu)于3-MA組；免疫熒光染色顯示，藥物血清組和3-MA組較模型組CD34蛋白表達升高。

綜上，本研究結(jié)果表明，丹參通絡(luò)解毒湯能適度抑制缺氧/復氧CMECs自噬，進而更好地促進血管生成，達到保護CMECs的作用。

[1] DONG Q, LI J, WU Q F, et al. Blockage of transient receptor potential vanilloid 4 alleviates myocardial ischemia/reperfusion injury in mice[J]. Sci Rep,2017,7：42678.

[2] LU S, ZHANG Y, ZHONG S, et al. N-n-butyl haloperidol iodide protects against hypoxia/reoxygenation injury in cardiac microvascular endothelial cells by regulating the ROS/MAPK/Egr-1 pathway[J]. Front Pharmacol,2016,7：520.

[3] HAUSENLOY D J, YELLON D M. Myocardial ischemia-reperfusion injury：a neglected therapeutic target[J]. J Clin Invest,2013, 23(1)：92-100.

[4] FANG B, LI X Q, BAO N R, et al. Role of autophagy in the bimodal stage after spinal cord ischemia reperfusion injury in rats[J]. Neuro Science,2016,328：107-116.

[5] 王靜雯.丹參通絡(luò)解毒湯對心肌缺血再灌注損傷大鼠自噬的實驗研究[D].長沙：湖南中醫(yī)藥大學,2019.

[6] 肖青.丹參通絡(luò)解毒湯聯(lián)合內(nèi)皮祖細胞移植對心肌缺血再灌注損傷大鼠促血管生成機制研究[D].長沙：湖南中醫(yī)藥大學,2018.

[7] 李鑫輝,王靜雯,肖青,等.丹參通絡(luò)解毒湯對冠心病不穩(wěn)定型心絞痛患者黏附分子的影響[J].湖南中醫(yī)藥大學學報,2018,38(2)：136-140.

[8] SALAZAR M, CARRACEDO A, LORENTE M, et al. Cannabinoid action induces autophagy-mediated cell death through stimulation of ER stress in human glioma cells[J]. Journal of Clinical Investigation,2009,119(5)：1359-1372.

[9] 伍思霖,黃玉瑩,丁海林,等.自噬、自噬性細胞死亡與腫瘤的研究進展[J].生命科學,2017,29(8)：763-768.

[10] ZHANG D Y, QIU W, WANG P, et al. Autophagy can alleviate severe burn-induced damage to the intestinal tract in mice[J]. Surgery, 2017,162(2)：408-417.

[11] SHENG R, QIN Z H. The divergent roles of autophagy in ischemia and preconditioning[J]. Acta Pharmacol Sin,2015,36(4)：411-420.

[12] MA X, LIU H, FOYIL S R, et al. Impaired autophagosome clearance contributes to cardiomyocyte death in ischemia/reperfusion injury[J]. Circulation,2012,125(25)：3170-3181.

[13] BEN Y A, TAJEDDINE N, TAILLER M, et al. A fluorescence microscopic and cytofluorometric system for monitoring the turnover of the autophagic substrate p62/SQSTM1[J]. Autophagy, 2011,7(8)：883-891.

[14] LIBERIS A, STANULOV G, CHAFOUZ A E, et al. Pre-eclampsia and the vascular endothelial growth factor：a new aspect[J]. Clinical and Experimental Obstetrics and Gynecology,2016,43(1)：9-13.

[15] 黃明艷,劉超,王階.活血化瘀中藥促內(nèi)皮祖細胞血管修復和新生研究進展[J].中國中醫(yī)藥信息雜志,2019,26(7)：141-144.

[16] 曾曉,閆喜明,趙倩.單味中藥對血管新生的促進作用研究進展[J].山東醫(yī)藥,2019,59(20)：110-112.

Effects ofDecoction on Autophagy and Angiogenesis of Cardiac Microvascular Endothelial Cells in Rats with Hypoxia/Reoxygenation

LIU Shicheng, LI Xinhui, CHEN Xin

To investigate the effects ofDecoction containing serum on autophagy and angiogenesis of cardiac microvascular endothelial cells (CMECs) in rats with hypoxia/reoxygenation (H/R); To explore the mechanism of action.H/R injury model of CMECs was established. CMECs were randomly divided into blank group, model group,Decoction containing serum group, and 3-MA autophagy inhibitor group. Except the blank group, all the other groups were cultured in low-sugar and serum-free DMEM medium, and placed in a 37 ℃, 94% N2, 1% O2, 5% CO2incubator under hypoxia for 2 h, and then replaced with normal DMEM medium. Oxygen was given for 3 hours, and then the corresponding drugs were given. The cell growth and morphology of CMECs were observed with an inverted microscope, and the activity of lactate dehydrogenase (LDH) in the culture medium was detected with the detection kit. Western blot was used to detect the expressions of autophagy-related proteins Beclin 1, p62 and VEGF, and immunofluorescence was used to detect the expression of CD34, a characteristic surface marker of CMECs.Compared with the blank group, the degree of cell necrosis, the LDH content in the cultrue medium, Beclin 1 and VEGF protein expressions in the model group increased (<0.01,<0.05), while p62 protein expression decreased (<0.01), and the red fluorescence of CD34 protein was significantly reduced in the model group. Compared with the model group, the degree of cell necrosis of CMECs, the LDH content in the culture medium, Beclin 1 protein expression were significantly reduced (<0.01), while p62 and VEGF protein expression significantly increased (<0.01,<0.05), and the red fluorescence of CD34 protein was significantly increased in theDecoction containing serum group and 3-MA autophagy inhibitor group.Decoction can moderately inhibit the autophagy of H/R CMECs, so as to better promote angiogenesis and protect CMECs.

Decoction; myocardial ischemia reperfusion injury; cardiac microvascular endothelial cells; autophagy; angiogenesis; rats

R285.5

A

1005-5304(2021)06-0065-05

10.19879/j.cnki.1005-5304.202010121

國家自然科學基金（82074392）；湖南省自然科學基金（2019JJ40210）；湖南省教育廳科學研究項目（15A143）；湖南省中醫(yī)藥科研計劃（201559、201790）；長沙市科技計劃（kq1706058）；全國名老中醫(yī)藥專家傳承工作室建設(shè)項目（2019年）

李鑫輝，E-mail：2208637467@qq.com

（2020-10-12）

（2020-12-16；編輯：華強）