無創(chuàng)糞便SDC2甲基化聯(lián)合血清CEA在結(jié)直腸癌早期診斷中的應(yīng)用價值

李 錦，孫 珍

[1.深圳市寶安區(qū)中心醫(yī)院消化內(nèi)科(深圳大學(xué)第五附屬醫(yī)院)，廣東 深圳 518100；2.深圳市寶安中醫(yī)院(集團(tuán))檢驗科，廣東 深圳 518100]

結(jié)直腸癌是臨床上常見的消化道惡性腫瘤，好發(fā)于結(jié)腸和直腸部位，尤其在老年人群發(fā)病較多。近數(shù)十年，結(jié)直腸癌的發(fā)病率在全球呈上升趨勢，其可能與人們生活方式的改變和飲食結(jié)構(gòu)的變化有關(guān)[1]。結(jié)直腸癌早期，患者大多無明顯癥狀，或癥狀略為輕微、不易發(fā)現(xiàn)，具有一定的隱匿性；但其中晚期容易發(fā)生全身遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，常見轉(zhuǎn)移部位有肝臟、肺及其他器官，嚴(yán)重甚至危及生命[2-3]。若臨床上結(jié)腸癌能做到早發(fā)現(xiàn)、早治療，對提高患者的生存率和生活質(zhì)量具有重要意義[4]。目前，結(jié)直腸癌的診斷主要依靠微創(chuàng)結(jié)直腸鏡手術(shù)及病理活檢[5]，同時還配合有血清癌胚抗原CEA檢測；但由于結(jié)腸鏡檢測是侵入性檢查、需繁瑣的腸道準(zhǔn)備、有穿孔的風(fēng)險等，而血清CEA檢測因敏感度和特異性低而存在明顯的局限性，導(dǎo)致結(jié)直腸癌篩查難以普及[6]。有研究[2]表明，糞便DNA檢測其具有無創(chuàng)、方便、診斷效能高等優(yōu)點，檢測糞便樣本中SDC2甲基化水平，有助于準(zhǔn)確預(yù)測評估結(jié)直腸癌患病情況，且標(biāo)本采集方法簡單，操作方便、無侵入性。本研究采用無創(chuàng)糞便SDC2基因甲基化聯(lián)合血清CEA的檢測對結(jié)直腸癌診斷分析，旨在明確其在結(jié)直腸癌診斷中的應(yīng)用及評估價值。

1 資料與方法

1.1一般資料：選取我院2018年1月～2020年1月收治確診的64例結(jié)腸癌患者，58例結(jié)直腸瘤患者及60例健康對照組作為研究對象。納入標(biāo)準(zhǔn)[3]:①均經(jīng)過組織病理確診結(jié)直腸癌，既往未接受過任何抗腫瘤治療；②術(shù)前無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移病灶；③自愿參與實驗，同意糞便 SDC2 基因甲基化檢測及 CEA 檢測。 排除標(biāo)準(zhǔn):①腸鏡檢查發(fā)現(xiàn)其他腸道疾??；②存在全身感染性疾病、精神疾病，以及其他嚴(yán)重器質(zhì)性病變；③近1個月有肉眼血便者。其中結(jié)直腸癌組(n=64)患者男43例，女21例；年齡35～80歲，平均(52.21±10.54)歲；結(jié)直腸瘤組(n=58)患者男38例，女20例；年齡34～78歲，平均(47.85±11.81)歲；健康對照組(n=60)男40例，女20例；年齡30～78歲，平均(48.62±9.71)歲。三組患者年齡、性別比較均差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，所有患者均簽署知情同意書。

1.2方法：①標(biāo)本采集：抽取受試者空腹外周靜脈血4 ml，以3 000 r/min 離心15 min后取血清，化學(xué)發(fā)光免疫分析法，根據(jù)試劑盒說明書，應(yīng)用全自動電化學(xué)發(fā)光分析儀(CDBASE601 型)檢測血清癌胚抗原(carcinoembryonic antigen，CEA) 含量。當(dāng)血清CEA>5 μg/L，檢測結(jié)果為陽性。②糞便 DNA 提取及亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化：根據(jù)試劑盒說明書，利用糞便DNA 提取試劑盒從糞便樣本(180～220 mg)中提取DNA。同時通過PCR 擴(kuò)增驗證DNA提取質(zhì)量。然后采用亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化試劑盒將對基因DNA 進(jìn)行修飾，將未發(fā)生甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)化為尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不變。③實時熒光定量PCR測定SDC2：采用實時熒光定量PCR SDC2甲基化含量，PCR反應(yīng)體系為25 μl，包括：TaKaRa EpiTaq HS(5 U/μl)0.125 μl，10×EpiTaq PCR Buffer(Mg2+free)2.5 μl，25 mmol/L MgCl22.5 μl，dNTP Mixture 3 μl，正向引物 1 μl，反向引物1 μl，模板 DNA 2 μl。反應(yīng)條件：95℃，5 min；95℃，30 s；54～62℃，30 s；72℃，30 s；40個循環(huán)；72℃，10 min。 EpiTect PCR 對照組DNA作為陽性對照。擴(kuò)增產(chǎn)物在3%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳分離，然后進(jìn)行凝膠成像。

1.3觀察指標(biāo)：比較三組患者單獨檢測SDC2、CEA及聯(lián)合檢測的陽性率。同時通過ROC擴(kuò)增曲線分析單獨檢測及聯(lián)合檢測的靈敏度和特異度。

2 結(jié)果

2.1三組患者糞便SDC2、CEA及聯(lián)合檢測陽性率比較:結(jié)直腸癌組、結(jié)直腸瘤組和健康對照組患者SDC2檢測的陽性率分別為67.19%、55.19%和11.67%；CEA檢測的陽性率為39.06%、17.24%和8.33%；聯(lián)合檢測的陽性率則分別是82.81%、58.62%和13.33%，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 三組患者糞便SDC2、CEA及聯(lián)合檢測陽性率比較

2.2糞便SDC2基因、血清CEA、聯(lián)合檢測診斷結(jié)直腸癌ROC曲線分析：ROC曲線分析發(fā)現(xiàn)，SDC2基因檢測診斷結(jié)直腸癌AUC為0.629(95%CI：0.474～0.783)，血清CEA水平診斷結(jié)直腸癌AUC為0.512(95%CI：0.357～0.632)，聯(lián)合檢測診斷結(jié)直腸癌AUC 是0.782(95%CI：0.642～0.856)。聯(lián)合診斷結(jié)直腸癌的AUC值最高，與單獨SDC2、CEA檢測比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。

圖1 糞便SDC2基因、血清CEA、聯(lián)合檢測診斷結(jié)直腸癌ROC曲線分析

3 結(jié)論

結(jié)直腸癌是一種嚴(yán)重威脅人類身體健康及生命安全的惡性腫瘤，常見于中老年人，其發(fā)病率在全球男性腫瘤中居第三位，女性腫瘤中居第二位[4]。近年，隨著人們生活水平的提高和飲食結(jié)構(gòu)的改變，我國直腸癌發(fā)病率和死亡率逐漸升高，并且呈年輕化趨勢；每年死于結(jié)直腸癌患者人數(shù)高達(dá)數(shù)十萬；而歐美發(fā)達(dá)國家結(jié)直腸癌的死亡率較我國明顯降低，主要歸因于大規(guī)模的結(jié)直腸癌普查，對癌前病變進(jìn)行治療干預(yù)，實現(xiàn)了結(jié)直腸癌的早期檢測和一級預(yù)防[6]。結(jié)直腸癌的發(fā)病進(jìn)展較為緩慢，早期多見結(jié)直腸黏膜病變，進(jìn)而演變?yōu)橄倭鲂韵⑷?，最后發(fā)展為惡性腫瘤。若能夠早發(fā)現(xiàn)一級預(yù)防，二級定期篩查和三級治療，可有效促進(jìn)患者預(yù)后。然而，大多數(shù)患者早期無明顯癥狀和臨床體征，同時由于缺少早期診斷，有明顯癥狀時就診已處于中晚期，結(jié)直腸癌患者甚至已有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。因此，早診斷、早發(fā)現(xiàn)、早治療提高患者的生存率，促進(jìn)預(yù)后具有重要意義。

有研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸癌患者糞便/血液中腫瘤相關(guān)基因的改變是組織癌變的重要原因之一，其中DNA甲基化情況在結(jié)直腸癌診斷及預(yù)后具有重要指導(dǎo)意義[5]。學(xué)者們發(fā)現(xiàn)越來越多游離DNA中某些特定基因甲基化可作為結(jié)直腸癌早期診斷、預(yù)后等方面的生物標(biāo)志物，如PCDH10、Septin9、RASSF2、sFPR1、SDC2等，在腫瘤的早期篩選及診斷中應(yīng)用較多。結(jié)直腸癌患者術(shù)后特定基因TAC1 甲基化水平會逐漸下降，但復(fù)發(fā)時DNA 甲基化水平顯著上升，可用來輔助評判結(jié)直腸癌治療效果[6]。無創(chuàng)糞便SDC2基因甲基化也有報道，但聯(lián)合血清CEA在結(jié)直腸癌中的診斷效能如何未見報道，本文就SDC2基因甲基化聯(lián)合血清CEA檢測分析評估對結(jié)直腸癌的診斷價值。本研究結(jié)果顯示，結(jié)直腸癌組、結(jié)直腸瘤組及健康對照組的SDC2基因甲基化陽性檢出率分別為 67.19%、55.17% 及 11.67%，說明結(jié)直腸癌組SDC2基因甲基化的陽性檢出率高于結(jié)直腸瘤組和對照組，提示結(jié)直腸癌患者糞便中SDC2基因甲基化水平明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)直腸癌組、結(jié)直腸瘤組及健康對照組患者的SDC2與CEA聯(lián)合檢測的陽性率分別為82.81%、58.62%及13.33%，聯(lián)合檢測中結(jié)直腸癌陽性檢出率顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，提示提示聯(lián)合檢測對結(jié)直腸癌的診斷效能優(yōu)于單獨檢測?，F(xiàn)階段單一基因檢測結(jié)直腸癌的靈敏度偏低，容易出現(xiàn)誤診或漏診[7]。目前，已有研究證實，SDC2基因甲基化在結(jié)直腸癌診斷中具有較高的靈敏度和特異度[8-9]。本文ROC 曲線分析發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合診斷結(jié)直腸癌的AUC值為0.782，顯著高于單獨SDC2甲基化和血清CEA水平檢測，因此在早期篩查中進(jìn)行聯(lián)合檢測對提高結(jié)直腸癌診斷的靈敏度、特異性，將獲益更大[10]。

綜上所述，無創(chuàng)糞便SDC2基因甲基化聯(lián)合血清CEA可有效提高結(jié)直腸癌的檢出率和診斷準(zhǔn)確性，且具有無創(chuàng)、方便、診斷效能高等優(yōu)點，臨床上值得推廣。