外周血HDAC2、IL-17A在重癥哮喘患者中的表達及意義研究

涂容芳，何振華，譚小武，陳 哲，羅 卿，陳 林，陳 偉，謝 莉，楊艷霞

(南華大學附屬第二醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學科，湖南 衡陽 421001)

支氣管哮喘(以下簡稱哮喘)是一種全球常見、多發(fā)的慢性氣道炎性反應性疾病，絕大部分哮喘患者可經(jīng)吸入性糖皮質(zhì)激素治療得到控制，但仍有部分哮喘患者需大劑量吸入甚至口服糖皮質(zhì)激素才能控制或仍未獲控制，稱之為重癥哮喘(Severe asthma,SA)。最新流行病學調(diào)查研究表明全球約有3 億成年哮喘患者[1-2],重癥哮喘發(fā)生率高達5%～10%，其產(chǎn)生的醫(yī)療負擔已超過哮喘總費用的 50%，給人們造成了極大的痛苦及經(jīng)濟負擔。因此，探討一種能早期預測SA 的簡便指標，以盡早識別 SA 患者并予以準確干預治療，對改善患者預后具有重要意義。本研究擬通過研究重癥哮喘患者、普通哮喘患者及健康對照人群外周血組蛋白去乙?；?(HDAC2)、白細胞介素-17A(IL-17A)表達水平的差異及重癥哮喘患者中兩者的相關性，探討其對重癥哮喘早期診斷及激素治療是否敏感的預測價值。

1 資料與方法

1.1一般資料：選擇2018年1月～2019年1月在我院治療、隨訪的哮喘患者60例為研究對象，其中重癥哮喘患者30例設為重癥哮喘組，普通哮喘患者30例設為普通哮喘組。重癥哮喘組中男16例，女14例，年齡22～63歲，平均(40.1±8.52)歲；普通哮喘組中男13例，女17例，年齡20～60歲，平均(39.2±7.68)歲。選取同期在本院進行健康體檢的30例健康志愿者作為對照組，其中男18例，女12例，年齡18～60歲，平均(40.3±7.56)歲。三組研究對象的性別構成比、年齡比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，具有可比性。本研究已獲南華大學附屬第二醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準實施，全部研究對象均知情同意。病例組納入標準：①哮喘診斷明確，診斷標準參照中華醫(yī)學會呼吸病學分會哮喘學組《支氣管哮喘防治指南》和 GINA 2015；②年齡 18～65歲，性別不限。對照組納入標準：①年齡18～65歲，性別不限；②無變態(tài)反應性疾病，無吸煙史，無哮喘病史、癥狀及體征，近2周內(nèi)無呼吸道感染史。排除標準：①認知能力低影響自評量表填寫者；②有嚴重心、肝、腎功能障礙，或其他感染性疾??；③有嚴重氣胸不能進行肺功能檢測者。

1.2方法

1.2.1受試者血清HDAC2、IL-17A水平檢測：于清晨空腹時采集肘靜脈全血4 ml置于未加抗凝劑的試管中，標本采集后在室溫下靜置2 h，離心機離心后(3 000 r/min)取上清分裝，并將標本放于-20℃冰箱儲存待測。采用ELLSA法測定血清HDAC2(試劑盒購自武漢艾美捷科技有限公司)及IL-17A(試劑盒購自欣博盛生物科技有限公司)水平，具體步驟嚴格按照說明書操作。

1.2.2肺功能檢測最大呼氣峰流速(PEF)值、1 s用力呼氣容積(FEV1)及最大呼氣中期流量(MMEF )：患者靜息20 min后抬頭挺胸，手持儀器，口含咬嘴。囑患者深吸氣，然后用爆發(fā)力吹氣，吹氣時儀器右側指示燈會快速閃爍，保持穩(wěn)定吹氣6 s至燈滅則吹氣完成。采用德國Master Screen肺功能測試系統(tǒng)連續(xù)檢測3次肺通氣功能，所檢測到的結果中若用力肺活量(FVC)和FEV1的變異度均<5%則判定為合格，最終結果取3次結果中的最佳值記錄。

2 結果

2.1三組受試者血清HDAC2表達對比：重癥哮喘組患者外周血血清中HDAC2的水平低于普通哮喘組及對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，普通哮喘組和對照組外周血血清中HDAC2表達水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

2.2三組受試者外周血血清中IL-17A表達對比：重癥哮喘患者外周血血清中IL-17A的水平高于普通哮喘組及對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，普通哮喘組和對照組外周血血清中IL-17A表達水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 三組受試者外周血中HDAC2、IL-17A表達水平對比

2.3三組受試者PEF、FEV1及MMEF表達對比：重癥哮喘組和普通哮喘組患者PEF、FEV1及MMEF水平均低于對照組，以重癥哮喘組最明顯，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 三組受試者PEF、FEV1及MMEF水平對比

2.4重癥哮喘組患者肺功能、HDAC 2、IL-17A之間相關性分析：重癥哮喘患者肺功能PEF、FEV1及MMEF與其外周血中HDAC2表達呈正相關(r=0.750、0.782、0.708，P<0.05)，與IL-17A表達呈負相關(r= -0.719、-0.748、-0.711，P<0.05)，HDAC2與IL-17A之間呈負相關(r=-0.892，P<0.05)。見表3。

表3 重癥哮喘組患者肺功能與HDAC2、IL-17A之間相關性分析

3 討論

支氣管哮喘特別是重癥哮喘發(fā)病機制復雜，既往研究認為哮喘的主要發(fā)病機制是TH1/TH2細胞免疫失衡[3]，即抗原經(jīng)過樹突狀細胞等呈遞后誘導T細胞分化成為TH2細胞，分泌TH2型炎性細胞因子如IL-4、IL-5和IL-13，這些炎性因子導致嗜酸性粒細胞、T淋巴細胞和肥大細胞募集，從而誘導哮喘氣道高反應性和黏液高分泌。然而，最近的臨床研究發(fā)現(xiàn)40%以上的哮喘以中性粒細胞炎性反應浸潤為主[4-5]，同時約有10%～15%重度哮喘患者對吸入糖皮質(zhì)激素治療不敏感，存在激素抵抗(GC 抵抗)[6]，激素抵抗機制成為近年來研究的熱點和難點。近年來已有研究表明：GR SNPs、GR 修飾(磷酸化、亞硝基化、泛素化、巰基化、氧化還原應激等)、GR-α基因表達減少、GR-β表達增加、GCs 細胞外排增加、促炎轉(zhuǎn)錄如JNK/AP-1、JAK3/STAT5、NF-κB、HDAC2、IL-17A等過度激活及促炎轉(zhuǎn)錄因子過度表達都可能影響糖皮質(zhì)激素的生物學效應，引起 SA 對激素抵抗[7-10]。本研究擬通過研究重癥哮喘患者、普通哮喘患者及健康對照人群外周血HDAC2、IL-17A表達水平的差異及重癥哮喘患者中兩者的相關性，探討它們對重癥哮喘早期診斷及激素治療是否敏感的預測價值。

組蛋白去乙?；?histone deacetylase，HDAC)最初是由 Taunton 等[11]人1996 年發(fā)現(xiàn)的一類蛋白酶，其在修飾染色體結構和調(diào)控遺傳基因轉(zhuǎn)錄表達等方面發(fā)揮了重要的作用，HDACs 共有四大類，組蛋白去乙?；?2(HDAC2) 是第 I 類組蛋白去乙酰化酶，含有一個保守的、約 400 個氨基酸殘基的催化結構域，由 1 個底物結合位點、1 個鋅離子結合位點和 2 個金屬離子結合位點構成胞核內(nèi)的一種對染色體的結構修飾和基因表達調(diào)控發(fā)揮著重要作用的蛋白酶。Trevor 等[12]報告糖皮質(zhì)激素可通過募集HDAC2使GR去乙?；?，GC 與核因子κB(NF-κB)結合并激活 AP-1形成 GC-NFκB/AP-1 復合體，抑制促炎因子轉(zhuǎn)錄，促炎因子合成減少，炎性反應減輕或受抑；此外，HDAC2 可使組蛋白去乙?；M蛋白與帶負電荷的促炎性反應因子 DNA結合更緊密，促炎性反應轉(zhuǎn)錄因子不能與 DNA 特異位點結合，轉(zhuǎn)錄受到抑制，表達下調(diào)，從而發(fā)揮抗炎作用。當 HDAC2 表達下調(diào)時，可能引起激素抵抗，抗炎作用減弱。Hao M等在6周齡BALB/c小鼠哮喘模型的研究中發(fā)現(xiàn)，暴露于吸煙組(SEA)小鼠肺組織活檢標本中 HDAC2 表達較卵清蛋白(OVA)激發(fā)哮喘組小鼠低[13]。Ito等在40名受試者的支氣管黏膜活檢組織中也發(fā)現(xiàn) HDAC2 表達水平與重癥哮喘患者的激素療效有關[14]。白細胞介素-17(IL-17)是 Th17 細胞分泌的一種炎性反應介質(zhì)[15]，Semlali 等發(fā)現(xiàn) IL-17A 可促進GR-β 在外周血單核細胞中表達增多，使 GR-β/GR-α 的比例倒置，最終產(chǎn)生激素抵抗[16]。以中性粒細胞浸潤為主的哮喘，對糖皮質(zhì)激素治療的反應差，而在募集中性粒細胞的過程中，IL-17 起著至關重要的作用[17-18]。 高水平的 IL-17 與中性粒細胞氣道炎性反應的嚴重程度呈正相關，且這類哮喘患者在糖皮質(zhì)激素治療后中性粒細胞的數(shù)量并不降低，因此IL-17不僅可誘導杯狀細胞增生及黏液分泌造成氣道重塑，還在重癥哮喘激素抵抗中起了重要作用[19]。SA嚴重程度常規(guī)采用肺功能評估，其中PEF表示最大呼氣流速率是判斷哮喘嚴重度最簡便可靠的客觀手段，當PEF<0.2 L/min提示氣道存在嚴重阻塞；而FEV1、MMEF是反映氣道阻力最常用的指標，當FEV1<1.0 L時提示病情嚴重，當FEV1<0.5 L時則有發(fā)生窒息的可能。但肺功能檢查操作復雜還對患者要求較高，如遇SA急性發(fā)作時不僅會因患者病情重配合不佳而無法準確反映病情，還存在病情加重甚至窒息、死亡風險，因此尋求簡單、無創(chuàng)、高特異性檢查指標或方法意義重大。本研究表明：重癥哮喘患者血清HDAC2水平顯著低于普通哮喘患者和對照組人群，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，且與其PEF、FEV1及MMEF呈正相關，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。重癥哮喘患者血清IL-17A水平顯著高于普通哮喘患者(P<0.05)和對照組人群(P<0.05)，且與其PEF、FEV1及MMEF呈負相關(P<0.05)。而普通哮喘與對照組外周血血清中HDAC2、IL-17A水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，進一步提示外周血 HDAC2、IL-17A水平作為評估哮喘表型的生物標志是可行的，因其簡單、方便和安全，在預測激素治療效果和識別“真”“假”重癥哮喘患者方面有較好的臨床運用前景。

綜上所述，重癥哮喘患者的外周血中存在HDAC2、IL-17A表達增加，并且HDAC2、IL-17A表達水平與患者的肺功能密切相關，但具體機制尚不清楚。最近的一項研究表明，敲除 HDAC2 基因后，能使屋塵螨誘導的氣道炎性反應及黏液分泌進一步加重，并能調(diào)控 Th17 細胞分化促進 IL-17A的分泌，而敲除 IL-17 基因或使用 IL-17A 中和抗體后能使由 HDAC2 基因缺失誘導的氣道炎性反應得到緩解[20]，顯示 HDAC2 可以通過抑制氣道上皮細胞產(chǎn)生IL-17A 的表達來減弱氣道炎性反應。另外，有文獻報道IL-17A 可在氣道上皮中誘導糖皮質(zhì)激素不敏感，其機制可能與 PI3K 信號通路激活導致 HDAC2 活性降低有關[9]。本研究發(fā)現(xiàn)重癥哮喘患者中HDAC2、IL-17A表達水平呈負相關，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，由此推測HDAC2、IL-17A參與重癥哮喘的機制可能與下調(diào)HDAC2、上調(diào)IL-17A參與激素抵抗有關。