快速鑒定草莓枯萎病的LAMP檢測(cè)技術(shù)

韓富慶，史芳芳

快速鑒定草莓枯萎病的LAMP檢測(cè)技術(shù)

韓富慶，史芳芳*

（新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)第十二師農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，新疆 烏魯木齊 830063）

【目的】建立草莓枯萎病的鐮刀菌快速檢測(cè)方法。【方法】利用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（LAMP）針對(duì)鐮刀菌保守區(qū)域ITS設(shè)計(jì)一套LAMP擴(kuò)增引物，利用Bst DNA聚合酶完成LAMP擴(kuò)增反應(yīng)，對(duì)7種常見(jiàn)病原菌進(jìn)行檢測(cè)，分析LAMP引物的特異性；比較LAMP與傳統(tǒng)PCR方法的敏感性?！窘Y(jié)果】建立的LAMP法能夠特異性的檢測(cè)尖孢鐮刀菌和腐皮鐮刀菌，并且檢測(cè)靈敏度為1.0×10-4ng/μL，是普通PCR檢測(cè)靈敏度的1 000倍?！疽饬x】試驗(yàn)所建立的草莓枯萎病快速LAMP檢測(cè)方法，具有靈敏度高、快速及簡(jiǎn)便的優(yōu)點(diǎn)，可以向基層單位推廣使用。

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增；鐮刀菌；炭疽菌

【研究意義】草莓(Duch.)屬薔薇科草莓屬多年生草本植物，果肉鮮美多汁，堪稱“水果皇后”。近年來(lái)，草莓種植面積逐年增大，品種不斷更新，頻繁地調(diào)種、引種以及連作，導(dǎo)致草莓病害發(fā)生較為普遍。目前，影響草莓生產(chǎn)的主要病害是草莓枯萎病[1-2]，鑒定和檢測(cè)草莓病害的主要方法是形態(tài)學(xué)觀察和分子生物學(xué)PCR擴(kuò)增法，這兩種方法中，形態(tài)學(xué)鑒定方法耗時(shí)長(zhǎng)，需要具備專業(yè)知識(shí)，且有時(shí)對(duì)于不常見(jiàn)病原菌會(huì)判定不準(zhǔn)確，而分子生物學(xué)檢測(cè)方法需要昂貴的儀器設(shè)備，且對(duì)檢測(cè)產(chǎn)物需要測(cè)序才能判定為是何種病原菌感染[3]，因此，亟需一種能夠在發(fā)病初期或者土壤中進(jìn)行早期快速檢測(cè)的技術(shù)，以便及時(shí)采用有針對(duì)性的有效防治措施來(lái)控制病害的發(fā)生和傳播?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】LAMP（環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)）作為一種新的核酸擴(kuò)增方法，具有檢測(cè)速度快、操作簡(jiǎn)單和靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)[4]。該項(xiàng)技術(shù)是在60～65 ℃恒溫下擴(kuò)增，只要恒溫水浴鍋即可，無(wú)需特殊儀器，所以操作方便，對(duì)設(shè)備要求低；且可用肉眼即可觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果，檢測(cè)周期非常短，適合于基層農(nóng)業(yè)單位對(duì)田間草莓病害進(jìn)行快速鑒定。目前，國(guó)內(nèi)僅有對(duì)草莓炭疽病鑒定的LAMP檢測(cè)技術(shù)的研究[5]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】傳統(tǒng)的病原菌檢測(cè)技術(shù)、免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)已經(jīng)很難明確地鑒定病原菌且耗時(shí)長(zhǎng)、靈敏度低，而目前大多數(shù)分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)費(fèi)時(shí)、費(fèi)力、準(zhǔn)確性低，且不能在病害潛伏期和初期作出診斷，很難對(duì)病害發(fā)生進(jìn)行及時(shí)的監(jiān)測(cè)和有效控制[6-7]?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本文首次對(duì)鐮刀菌引起的草莓枯萎病病害進(jìn)行LAMP快速檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 供試菌株 本研究供試菌株為茶樹(shù)炭疽、膠孢炭疽、草莓?；图怄哏牭毒ⅠR鈴薯鏈格孢菌、尖孢鐮刀菌、腐皮鐮刀菌、惡疫霉菌。種名、來(lái)源及數(shù)量見(jiàn)表1。

表1 試驗(yàn)所用菌株及來(lái)源

1.1.2 儀器與試劑 Bst DNA聚合酶、DNA提取試劑盒和恒溫水浴鍋均購(gòu)自上海生工生物公司；SYBR熒光顯色劑購(gòu)自索萊寶生物公司；PCR擴(kuò)增儀和凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)伯樂(lè)儀器；電泳儀購(gòu)自北京市六一儀器廠。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 病原菌基因組DNA的提取 挑取平板培養(yǎng)的適量病原菌菌絲，采用DNA-EA Reagents V ALL-DNA-FAST-Out裂解液（上海生工生物）提取病原真菌基因組DNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 土壤基因組DNA 提取采用馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基培養(yǎng)病原真菌，在搖床上震蕩5 d后產(chǎn)生孢子，利用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行計(jì)數(shù)，使其達(dá)到1×107個(gè)分生孢子后與2 g左右滅菌營(yíng)養(yǎng)土充分混合，采用土壤真菌基因組DNA快速抽提試劑盒（上海生工生物）提取含病原菌分生孢子的土壤基因組DNA，未接真菌病原菌孢子的滅菌營(yíng)養(yǎng)土提取的DNA作為空白對(duì)照。

1.2.3 患病草莓植株組織DNA的提取 將消毒后質(zhì)量約1 g左右的草莓病株根莖部，置于液氮預(yù)冷的研缽中，將其迅速研磨成粉末狀后轉(zhuǎn)移至1.5 mL的滅菌離心管中，用（上海生工生物）植物基因組DNA提取試劑盒提取患病植株真菌基因組DNA，同時(shí)提取健康草莓植株組織DNA作為空白對(duì)照，以接種膠孢炭疽菌和茶樹(shù)炭疽菌引起的炭疽病草莓病株作為陰性對(duì)照。

1.2.4 鐮刀菌屬特異性LAMP引物設(shè)計(jì)及擴(kuò)增 在GenBank中將鐮刀菌ITS區(qū)域與炭疽菌進(jìn)行比對(duì)，選擇具有特異性的區(qū)域，采用在線的PrimerExplorer V5 LAMP引物專用設(shè)計(jì)軟件，針對(duì)鐮刀菌ITS基因片段設(shè)計(jì)一套特異性LAMP引物，如表2所示。

1.2.5 LAMP擴(kuò)增反應(yīng)體系的建立及反應(yīng)條件的優(yōu)化 LAMP反應(yīng)體系（25 μL）包括：內(nèi)引物FIP和BIP、外引物F3和B3、環(huán)引物L(fēng)oop、dNTPs、MgSO4、Betain、10×Buffer緩沖液、DNA聚合酶、DNA模板、滅菌水補(bǔ)足體系。選擇對(duì)LAMP體系中的關(guān)鍵因素進(jìn)行優(yōu)化，包括鎂離子濃度（4，6，8，10 mmol/L）、dNTP濃度（1.0，1.2，1.4，1.6 mmol/L）、環(huán)引物濃度比（0.4，0.8，1.2，1.6 μmol/L）、甜菜堿濃度（0.4，0.8，1.2，1.6 mol/L）、Bst DNA聚合酶（4，6，8，12 U/μL），根據(jù)反應(yīng)后的條帶有無(wú)和染料顏色變化選擇最合適的條件，建立最佳的LAMP反應(yīng)擴(kuò)增體系。

表2 鐮刀菌ITS基因LAMP引物序列

建立最佳LAMP擴(kuò)增反應(yīng)體系后，將該體系分別在60～68 ℃條件下進(jìn)行梯度PCR擴(kuò)增反應(yīng)，確定其最適反應(yīng)溫度，并在篩選出的最適反應(yīng)溫度下，進(jìn)行 LAMP擴(kuò)增反應(yīng)，擴(kuò)增時(shí)間分別為15，30，45，60 min 4個(gè)時(shí)間，反應(yīng)完后加入SYBR熒光染料，觀察顏色變化，同時(shí)用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)反應(yīng)產(chǎn)物，確定LAMP反應(yīng)的最優(yōu)反應(yīng)條件。

1.2.6 LAMP檢測(cè)鐮刀菌屬特異性 按照1.2中不同真菌DNA提取方法，提取待測(cè)菌株的DNA，分別作為L(zhǎng)AMP等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)的模板，篩選出最佳DNA模板的濃度，將其擴(kuò)增產(chǎn)物加入熒光染料進(jìn)行顯色反應(yīng)，顯色完后進(jìn)行10 g/L瓊脂糖凝膠電泳分析，觀察其實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.2.7 LAMP及PCR擴(kuò)增方法檢測(cè)鐮刀菌靈敏度的比較 將病原菌DNA進(jìn)行10倍梯度逐級(jí)稀釋，分別獲得DNA原液、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6不同濃度稀釋液作為模板，利用所建立的LAMP反應(yīng)體系和條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增和LAMP擴(kuò)增靈敏度對(duì)比。分別取5 μL反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行10 g/L瓊脂糖凝膠電泳，觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

建立PCR法檢測(cè)鐮刀菌的反應(yīng)體系為25 μL：PCR Master混合物12.5 μL，上下游引物（ITS1/ITS4引物）各1 μL，1.0 μL模板DNA，用滅菌水補(bǔ)足體系至25 μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min。取10 μL PCR擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物，在10 g/L瓊脂糖凝膠上電泳，凝膠成像系統(tǒng)觀察擴(kuò)增條帶大小。

2 結(jié)果與分析

2.1 草莓植株枯萎病患病癥狀

枯萎病在草莓植株上的主要表現(xiàn)癥狀為：早期草莓側(cè)枝及老葉呈現(xiàn)萎焉狀態(tài)，中心葉片無(wú)變化，根及根莖維管束內(nèi)部為褐色；而地上部分明顯呈現(xiàn)矮化萎縮狀，并出現(xiàn)大小葉不對(duì)稱，有的葉柄變紅色，葉片邊緣變的焦黃或萎焉，逐漸發(fā)展到后期整個(gè)植株倒在栽培壟上，最終整株萎焉而枯死。

2.2 LAMP反應(yīng)體系的建立及反應(yīng)條件的優(yōu)化

不同方法提取的DNA均可以作為反應(yīng)模板，通過(guò)優(yōu)化LAMP反應(yīng)體系，確立了最終LAMP反應(yīng)體系為：F3及B3的濃度分別為0.2 μmol/L，F(xiàn)IP和BIP的濃度分別為1.6 μmol/L，環(huán)引物L(fēng)oop的濃度為0.8 μmol/L，MgSO4的濃度為8 mmol/L，dNTPs的濃度為1.4 mmol/L，Betain的濃度為0.8 mol/L，DNA聚合酶（8U）的濃度為1.0 μL，10×Buffer的濃度為2.5 μL及1 μL的DNA模板。最優(yōu)反應(yīng)條件為：在65 ℃恒溫水浴條件下,采用優(yōu)化的LAMP體系擴(kuò)增45 min。

采用上述最優(yōu)反應(yīng)體系進(jìn)行最適反應(yīng)溫度的篩選，其結(jié)果表明，在68.0，67.6，67.0，66.1，65.5，65.0，64.1和63.0 ℃ 8個(gè)不同的反應(yīng)溫度下進(jìn)行擴(kuò)增，當(dāng)加入熒光染色劑SYBR后反應(yīng)液由橙色變?yōu)闊晒饩G色，且產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，只有在65 ℃條件下可見(jiàn)瀑布狀梯形條帶，故確定LAMP反應(yīng)溫度為65 ℃（圖1）。在上述最優(yōu)反應(yīng)體系下，進(jìn)行最適擴(kuò)增時(shí)間的篩選，結(jié)果表明，當(dāng)反應(yīng)45 min時(shí)，產(chǎn)物溶液呈現(xiàn)明顯的熒光綠色，對(duì)應(yīng)的凝膠電泳條帶呈現(xiàn)瀑布狀條帶，故確定LAMP反應(yīng)時(shí)間為45 min（圖2）。

A：基于SYBR Green I 顯色的不同溫度LAMP產(chǎn)物檢測(cè)；B：LAMP產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳1～8：68.0 ℃，67.6 ℃，67.0 ℃，66.1℃，65.5℃，65.0 ℃，64.1 ℃，63.0 ℃

A：基于SYBR Green I顯色的LAMP產(chǎn)物檢測(cè)；B：LAMP產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳1：15 min；2：30 min；3：45 min；4：60 min

2.3 LAMP檢測(cè)鐮刀菌的特異性

尖孢鐮刀菌、草莓專化型尖孢鐮刀菌和腐皮鐮刀菌為模板的待測(cè)病原菌呈現(xiàn)出LAMP產(chǎn)物所特有的熒光綠色（圖3）和梯型條帶（圖4），以滅菌水為模板的空白組以及其它病原菌陰性組，則未出現(xiàn)梯型條帶且顏色反應(yīng)呈橙黃色。

1～8分別為鏈格孢菌、惡疫霉菌、草莓?；图怄哏牭毒?、尖孢鐮刀菌、茶樹(shù)炭疽菌、腐皮鐮刀菌、膠孢炭疽菌、空白對(duì)照顯色結(jié)果

2.4 LAMP及PCR法檢測(cè)鐮刀菌靈敏度的比較

將DNA原液（10 ng/μL）、不同DNA濃度稀釋液進(jìn)行PCR和LAMP擴(kuò)增反應(yīng)后，其中DNA原液，10-1和10-2稀釋液3個(gè)濃度進(jìn)行PCR反應(yīng)后，可以檢測(cè)到清晰的目的條帶，10-3和10-4稀釋液PCR產(chǎn)物為非特異性條帶，10-5和10-6則沒(méi)有擴(kuò)增出條帶（圖5A）。DNA原液、10-1、10-2、10-3、10-4和10-5稀釋液6個(gè)濃度作為L(zhǎng)AMP反應(yīng)模板時(shí)，均可以看到明顯的熒光綠色，只有10-6稀釋液作為DNA模板的LAMP產(chǎn)物的顯色反應(yīng)呈現(xiàn)橙色（圖5B）。因此，LAMP檢測(cè)草莓樣本中鐮刀菌靈敏度可以達(dá)到皮克（pg）級(jí)以上，非常有利于草莓枯萎病的快速檢測(cè)應(yīng)用。

M：DNA marker；1～7分別為鏈格孢菌、惡疫霉菌、草莓?；图怄哏牭毒⒓怄哏牭毒?、茶樹(shù)炭疽菌、腐皮鐮刀菌、膠孢炭疽菌LAMP擴(kuò)增結(jié)果

A：M，DNA marker；1～7，原液稀釋液106、105、104、103、102、101、DNA原液；B：1～7，原液稀釋液106、105、104、103、102、101、DNA原液

3 討 論

3.1 LAMP檢測(cè)靈敏度高

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法（LAMP）[8-12]所需DNA模板濃度比普通PCR方法所需DNA模板濃度還要低，相比PCR擴(kuò)增方法，本研究對(duì)于培養(yǎng)病原菌基因組DNA采用5 min快速提取法，獲得的DNA濃度低于10 ng/uL，微量分光光度計(jì)對(duì)于濃度低于10 ng/uL的DNA不能檢測(cè)出其濃度，但利用該方法提取的DNA稀釋至10×10-5ng/μL濃度（即達(dá)到0.1 pg級(jí)）進(jìn)行LAMP技術(shù)擴(kuò)增，其產(chǎn)物在凝膠電泳中呈現(xiàn)清晰的梯狀條帶；但是普通PCR最低檢測(cè)濃度為10×10-2ng/μL。近幾年有關(guān)于實(shí)時(shí)熒光LAMP技術(shù)檢測(cè)病原菌的報(bào)道，該技術(shù)是對(duì)LAMP技術(shù)的改良，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)系統(tǒng)記錄熒光信號(hào)，監(jiān)測(cè)整個(gè)反應(yīng)進(jìn)度，進(jìn)而分析反應(yīng)結(jié)果。但是該技術(shù)需要昂貴的科研儀器和試劑，不適用于基層單位開(kāi)展科研工作，其優(yōu)勢(shì)只在于可以定量實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)反應(yīng)過(guò)程，且靈敏度只是普通LAMP技術(shù)的10倍，靈敏度上的優(yōu)勢(shì)不明顯。本研究中添加熒光染料，實(shí)現(xiàn)了觀測(cè)結(jié)果的可視化，便于基層人員對(duì)結(jié)果進(jìn)行判讀，操作簡(jiǎn)單方便[13]。

3.2 檢測(cè)模板范圍廣

有研究顯示，利用3種模板，即發(fā)病植株組織、分離培養(yǎng)物菌絲、含有病原菌土壤分別提取DNA進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，均獲得良好效果[14]。不同科研單位可根據(jù)條件選擇不同模板進(jìn)行擴(kuò)增，基層單位的實(shí)驗(yàn)條件有限，可以直接從發(fā)病植株根際土壤和發(fā)病植株中提取的病原菌DNA進(jìn)行LAMP擴(kuò)增鑒定，對(duì)于草莓病原菌實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)和前期預(yù)警具有重要作用。本研究直接鑒定草莓植株不同部位的鐮刀菌，鑒定周期不超過(guò)1 h，非專業(yè)人員均可操作，鑒定方法適應(yīng)性強(qiáng)；其中DNA快速檢測(cè)試劑盒價(jià)格低廉、方法簡(jiǎn)單，平均提取單個(gè)樣品DNA大約需要花費(fèi)2元左右，適合向基層推廣。

3.3 首次利用LAMP技術(shù)檢測(cè)草莓枯萎病菌

傳統(tǒng)病原菌形態(tài)學(xué)鑒定耗時(shí)費(fèi)力，近年來(lái)的分子生物學(xué)技術(shù)為病原菌檢測(cè)和鑒定提供了新的方法，但是需要專業(yè)技術(shù)人員和昂貴的科研儀器。目前在檢測(cè)草莓病害和病毒方面采用的大多數(shù)是分子生物學(xué)PCR擴(kuò)增法，用到LAMP擴(kuò)增技術(shù)的較少[5,7,15]，尖孢鐮刀菌和腐皮鐮刀菌是草莓種植過(guò)程中常見(jiàn)導(dǎo)致枯萎病的病原菌，本研究利用基于ITS基因設(shè)計(jì)的LAMP引物，可快速、特異檢測(cè)鐮刀菌屬病原真菌在草莓植株體內(nèi)是否存在，含有鐮刀菌的菌株呈現(xiàn)可視化的綠色熒光，屬內(nèi)其他菌則顯示橘黃色。本文首次利用LAMP技術(shù)檢測(cè)草莓枯萎病，可為草莓病害檢測(cè)領(lǐng)域的科研工作者和基層技術(shù)人員提供簡(jiǎn)便、快速的檢測(cè)方法。已有研究報(bào)道尖孢鐮刀菌的LAMP檢測(cè)技術(shù)，但均為其它作物的專化型尖孢鐮刀菌檢測(cè)，引起枯萎病的不只有尖孢鐮刀菌，還有鐮刀菌屬的其它鐮刀菌種，因此，本文的研究擴(kuò)大了檢測(cè)范圍。

4 結(jié) 論

本研究以SYBR GreenⅠ為指示劑，根據(jù)草莓鐮刀菌特異的ITS序列設(shè)計(jì)了1組LAMP引物，并對(duì)反應(yīng)體系和反應(yīng)條件進(jìn)行了優(yōu)化；特異性實(shí)驗(yàn)證實(shí)該體系僅對(duì)鐮刀菌呈現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)，靈敏度實(shí)驗(yàn)顯示最低檢測(cè)限為10×10-5ng/uL。本研究所建立的草莓枯萎病LAMP可視化快速檢測(cè)方法，具有特異性強(qiáng)、耗時(shí)短、靈敏度高的特點(diǎn)，為在生產(chǎn)上早期快速診斷草莓枯萎病提供技術(shù)支持。

[1] 于紅梅, 趙密珍, 王靜, 等. 草莓枯萎病菌的分離、鑒定及生物學(xué)特性[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué), 2013, 41(11): 124-127.

[2] 寧志怨, 董玲, 廖華俊, 等. 草莓枯萎病的遺傳與育種研究進(jìn)展[J]. 分子植物育種, 2015, 13(1): 235-240.

[3] 張如勝, 魏泉德. LAMP技術(shù)在病原微生物檢測(cè)中的應(yīng)用[J]. 華南預(yù)防醫(yī)學(xué), 2007, 33(5): 45-49.

[4] 初亞男, 封利穎, 張婕妤, 等. 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)改進(jìn)的研究進(jìn)展[J]. 微生物學(xué)通報(bào), 2015, 42(4): 729-735.

[5] 胡曉然. 草莓主要抗藥性病害的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)檢測(cè)[D]. 杭州: 浙江農(nóng)林大學(xué), 2018.

[6] 趙玥明, 滿朝新, 曲艷艷, 等. 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)快速檢測(cè)肉中金黃色葡萄球菌[J]. 中國(guó)食物與營(yíng)養(yǎng), 2016, 22(1): 57-61.

[7] 陳柳, 尚巧霞, 陳笑瑜, 等. 草莓輕型黃邊病毒RT-LAMP檢測(cè)方法的建立[J]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué), 2015, 48(3): 613-620.

[8] 楊帆, 胡章薇, 嚴(yán)浩浩, 等. 青稞黑穗病菌LAMP檢測(cè)體系的建立[J]. 西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào), 2021(9): 1-10.

[9] 崔林開(kāi), 和志華, 康業(yè)斌, 等. 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)快速檢測(cè)麥根腐平臍蠕孢[J]. 植物病理學(xué)報(bào), 2021, 49(9): 1-9.

[10] 劉旺, 靳晶豪, 陳孝仁. 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的應(yīng)用進(jìn)展[J]. 生物技術(shù)進(jìn)展, 2021, 11(2): 128-135.

[11] 田瑤, 李佳昕, 楊瑩, 等. 豬圓環(huán)病毒I型LAMP檢測(cè)方法的建立及初步應(yīng)用[J]. 山東農(nóng)業(yè)科學(xué), 2021, 53(3): 1-9.

[12] 龔建森, 徐敬瀟, 付立霞, 等. 印第安納沙門菌環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)方法的建立[J]. 畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào), 2021, 52(2): 1-8.

[13] 許苗, 葉文武, 王淑琛, 等. 快速檢測(cè)馬鈴薯干腐病病原接骨木鐮孢的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)[J]. 植物病理學(xué)報(bào), 2018, 48(1): 55-60.

[14] 伍文憲, 劉勇, 黃小琴, 等. 尖孢鐮刀菌分子檢測(cè)技術(shù)的建立與應(yīng)用[J]. 草葉學(xué)報(bào), 2016, 25(5): 109-115.

[15] 張吉紅, 余澍瓊, 徐瑛, 等. 逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測(cè)草莓潛隱環(huán)斑病毒的研究[J]. 植物保護(hù), 2013, 39(6): 74-77.

Rapid Identification ofWilt in Strawberries Using LAMP Detection Technique

HAN Fuqing, SHI Fangfang*

(The Institute of Agricultural Sciences of the 12th Division, Xinjiang Production and Construction Corps, Urumchi 830063, China)

A rapid detection method forwilt in strawberries was established.A set of LAMP amplification primers were designed for the conserved region of ITS inspp. to detect seven common pathogens by using loop-mediated isothermal amplification (LAMP), and LAMP amplification reaction was completed by using Bst DNA polymerase. Also, the specificity of LAMP primer was analyzed, and the sensitivity between LAMP and PCR was compared.The results showed that LAMP method could detectand, with the detection sensitivity of 1.0×10-4ng/μL, which was 1 000 times that of conventional PCR.The rapid detection method LAMP forwilt in strawberries developed in this experiment had the advantages of high sensitivity, rapidity and simplicity, and could be popularized to grass-root units.

loop-mediated isothermal amplification;;

S668.4

A

2095-3704（2021）02-0153-06

2021-04-27

2021-06-03

兵團(tuán)中青年科技創(chuàng)新領(lǐng)軍人才計(jì)劃項(xiàng)目（2018CB030)

韓富慶（1974—），男，農(nóng)藝師，主要從事植物栽培研究；*通信作者：史芳芳，高級(jí)農(nóng)藝師，451784039@qq.com。

韓富慶, 史芳芳. 快速鑒定草莓枯萎病的LAMP檢測(cè)技術(shù)[J]. 生物災(zāi)害科學(xué), 2021, 44(2): 153-158.