江西省蓮花縣百合病毒病分子鑒定

葉曉夢(mèng)，曾 帥，石緒根，崔汝強(qiáng)

江西省蓮花縣百合病毒病分子鑒定

葉曉夢(mèng)，曾 帥，石緒根，崔汝強(qiáng)*

（江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，江西 南昌 330045）

【目的】為了檢測(cè)和鑒定采自江西省蓮花縣百合樣品?！痉椒ā坷靡褕?bào)道侵染百合的3種主要病毒黃瓜花葉病毒（cucumber mosaic virus，CMV）、百合斑駁病毒（lily mottle virus，LMoV）、百合無(wú)癥病毒（lily syptomless virus，LSV）的特異性引物對(duì)樣品進(jìn)行RT-PCR分子檢測(cè)與鑒定?！窘Y(jié)果】擴(kuò)增得到657 bp和428 bp 2條片段與CMV和LMoV預(yù)期片段大小一致，未檢測(cè)到LSV。測(cè)序結(jié)果表明，擴(kuò)增序列片段與GenBank的CMV、LMoV同源性分別為99.08%和98.56%?！窘Y(jié)論】該地百合受黃瓜花葉病毒及百合斑駁病毒復(fù)合侵染。

百合；百合病毒??；多重RT-PCR

【研究意義】百合（var.）是百合科（Liliaceae）百合屬（）多年生草本植物，喜涼耐寒。百合原產(chǎn)于中國(guó)，現(xiàn)主要分布在歐、亞和北美洲等北半球溫帶地區(qū)。百合具有重要的藥用、食用和觀賞價(jià)值，現(xiàn)已成為我國(guó)一種重要的經(jīng)濟(jì)作物。由于鱗片扦插是目前百合無(wú)性繁殖的主要技術(shù)，也導(dǎo)致了百合病毒的傳播與擴(kuò)散，嚴(yán)重降低了百合的觀賞和經(jīng)濟(jì)價(jià)值[1-2]。【前人研究進(jìn)展】我國(guó)栽培百合普遍受病毒侵染，病原和田間癥狀較為復(fù)雜。目前為害嚴(yán)重的病毒主要有3種，黃瓜花葉病毒（cucumber mosaic virus，CMV）、百合無(wú)癥病毒（lily symptomless virus，LSV）和百合斑駁病毒（lily mottle virus，LMoV），其它病毒為局部地區(qū)發(fā)生，為害較輕[3]。黃瓜花葉病毒百合株系（cucumber mosaic virus Lily strain）主要為害百合，可引起百合花葉病[4-5]，多為局部侵染。侵染百合后癥狀表現(xiàn)為輕型花葉、斑駁和扭曲，病葉最后脫水變褐；花畸形，花瓣開(kāi)裂呈現(xiàn)長(zhǎng)條紋狀。重病株矮化，鱗片短不開(kāi)花。百合斑駁病毒為馬鈴薯Y病毒屬（Potyvirus）成員，侵染百合后一般無(wú)癥狀表現(xiàn)或產(chǎn)生褪綠斑，與黃瓜花葉病毒復(fù)合侵染時(shí)產(chǎn)生花葉和壞死斑[5-8]。百合無(wú)癥病毒單獨(dú)侵染百合時(shí)一般無(wú)明顯癥狀出現(xiàn)，但在一定溫度下，某些品種會(huì)出現(xiàn)特異癥狀。如在15 ℃下侵染麝香百合幼苗一定時(shí)間，幼苗出現(xiàn)卷曲條紋（白色斑紋和葉片扭曲狀）[8]。在自然侵染狀態(tài)下，百合無(wú)癥病毒和黃瓜花葉病毒復(fù)合侵染引起百合壞死斑病[4]。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究對(duì)江西省蓮花縣坊樓鎮(zhèn)東邊村百合谷的疑似病毒病花葉、卷曲等癥狀的百合病株，進(jìn)行室內(nèi)分子檢測(cè)鑒定，采用多重RT-PCR技術(shù)實(shí)現(xiàn)了百合病毒病毒源檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

百合病株于2019年采自江西省蓮花縣坊樓鎮(zhèn)東邊村百合谷。大腸桿菌DH5α為江西農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理實(shí)驗(yàn)室保存。

克隆載體pMD18-T購(gòu)自大連TaKaRa公司，RNA提取試劑Trizol、RNA反轉(zhuǎn)錄試劑、DNA聚合酶購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，2×RapidMaster Mix試劑盒、Clone Express? II One step cloning Kit購(gòu)于南京諾維贊公司，DNA凝膠回收試劑盒購(gòu)于美國(guó)Axygen公司，參照王沖[9]和徐榕雪[10]合成3對(duì)特異性引物，引物合成及克隆測(cè)序由北京新業(yè)擎科公司完成，引物序列見(jiàn)表1[9-10]。

表1 PCR擴(kuò)增引物

1.2 總RNA的提取

使用Trizol法提取健康百合葉片以及感染病毒百合葉片總RNA。取0.1 g百合葉片于預(yù)冷的研缽中，加液氮充分研磨，將樣品粉末轉(zhuǎn)入2 mL預(yù)冷離心管；向樣品離心管加入1 mL Trizol試劑，充分混勻后于室溫放置5 min；加入200 μL氯仿，充分混勻后于室溫放置2～3 min，4 ℃，12 000 r/min離心15 min；吸取上清置于新的預(yù)冷處理的1.5 mL離心管，加入500 μL預(yù)冷的異丙醇，輕輕混勻，室溫放置10 min后低溫高速離心10 min；棄上清，加入1 mL 體積分?jǐn)?shù)為75%預(yù)冷的乙醇洗滌RNA，混勻，低溫低速離心5 min，棄上清；干燥沉淀，然后用20 μL DEPC水溶解RNA。提取的總RNA于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?，并? μL用凝膠電泳來(lái)檢測(cè)提取的RNA質(zhì)量[11]。

1.3 RT-PCR擴(kuò)增

以提取的總RNA為模板，在M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶作用下，用隨機(jī)引物合成cDNA[12]。再以cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，使用50 μL快速PCR反應(yīng)體系：2×RapidMaster Mix 25 μL、引物CMV-F（10 mmol/L）2 μL、引物CMV-R（10 mmol/ L）2 μL、ddH2O 14 μL、cDNA 2 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)?5 ℃，3 min；95 ℃，30 s；57 ℃，15 s；72 ℃，30 s；共35個(gè)循環(huán)；72 ℃，5 min。除擴(kuò)增引物及退火溫度有所變化，下文PCR擴(kuò)增體系均參照上述體系進(jìn)行[13]。PCR產(chǎn)物于10 g/L瓊脂糖凝膠中電泳檢測(cè)觀察后，參照DNA凝膠回收試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行回收純化。

將PCR純化回收產(chǎn)物連接至載體pMD18-T，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α，以通用引物M13F/R進(jìn)行菌落PCR鑒定，鑒定得到的陽(yáng)性克隆菌液送北京新業(yè)擎科公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)已登錄的序列進(jìn)行BLAST比對(duì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 田間發(fā)病百合癥狀

發(fā)病百合癥狀如圖1所示，發(fā)病植株表現(xiàn)為生長(zhǎng)不良，萎縮矮小，葉片變黃、畸形、產(chǎn)生黃色斑點(diǎn)及褐色條斑。

圖1 田間發(fā)病百合

2.2 多重RT-PCR檢測(cè)

以cDNA為模板，用3對(duì)特異性引物CMV-F/R、LMoV-F/R和LSV-F/R進(jìn)行單重及多重PCR，如圖2所示。電泳結(jié)果顯示，百合病葉分別擴(kuò)增出657 bp和428 bp 2條片段分別與黃瓜花葉病毒和百合斑駁病毒的片段大小相一致，百合健康葉片cDNA無(wú)任何擴(kuò)增產(chǎn)物。將PCR產(chǎn)物克隆測(cè)序后分析表明，克隆得到的CMV CP基因片段與Genbank已登錄的CMV CP基因序列（登錄號(hào)：AAM81374.1）片段同源性為99.08%，LMoV CP基因片段與Genbank已登錄的LMoV CP基因序列（登錄號(hào)：ADO34171.1）片段同源性為98.56%。

3 結(jié)論與討論

目前，在侵染百合的病毒中，CMV、LSV及LMoV為主要流行病毒，我國(guó)百合種植基地普遍存在幾種病毒復(fù)合侵染現(xiàn)象。由于我國(guó)百合切花的生產(chǎn)主要依靠進(jìn)口百合無(wú)毒種球，經(jīng)過(guò)二代種球繁育，種植二代種球帶毒率高，嚴(yán)重影響百合鮮切花的觀賞品質(zhì)及經(jīng)濟(jì)價(jià)值。因此，建立并使用多重RT-PCR檢測(cè)方法十分重要，即便在病毒含量較低時(shí)，也能快速準(zhǔn)確檢測(cè)出百合帶毒種類(lèi)。王繼華等[1]建立了LMoV與LSV的多重PCR檢測(cè)技術(shù)，整個(gè)過(guò)程可在6～7 h內(nèi)完成，相較于常規(guī)PCR，大大節(jié)約了檢測(cè)時(shí)間。黎昊雁等[7]建立的百合X病毒（LVX）、LSV及LMoV的單一、雙重及三重PCR體系檢測(cè)靈敏度達(dá)到了ng級(jí)，其中雙重PCR大部分可達(dá)到pg級(jí)，能滿(mǎn)足組織內(nèi)病毒含量不高時(shí)病毒檢測(cè)及盡早檢測(cè)百合植株是否帶毒的需要。徐榕雪等[10]建立了同步檢測(cè)CMV、LMoV和LSV的多重RT-PCR體系，擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果表明，這3種病毒的CP基因序列地域差異不明顯，為高度保守序列。RT-PCR技術(shù)檢測(cè)的特異性及靈敏度均優(yōu)于免疫學(xué)方法，相比于檢測(cè)方法，這種方法安全可靠、簡(jiǎn)便迅速。因此，建立多重RT-PCR的病毒檢測(cè)體系對(duì)百合種植基地十分重要。

本試驗(yàn)應(yīng)用單重及多重RT-PCR方法，參照王沖[9]和徐榕雪[10]合成的3對(duì)病毒CP基因特異性引物，對(duì)侵染江西省蓮花縣坊樓鎮(zhèn)東邊村百合谷的百合的病原進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示該地百合受黃瓜花葉病毒和百合斑駁病毒復(fù)合侵染，為當(dāng)?shù)厥状螆?bào)道。此次檢測(cè)結(jié)果可為江西省蓮花縣百合種植區(qū)病毒流行檢測(cè)提供技術(shù)支持。

[1] 王繼華, 王麗花, 元明, 等. 應(yīng)用多重RT-PCR檢測(cè)百合無(wú)癥病毒和百合斑駁病毒[J]. 園藝學(xué)報(bào), 2005, 44(2): 284-287.

[2] 劉艷妮, 佘奎軍. 百合脫毒技術(shù)研究進(jìn)展[J]. 寧夏農(nóng)林科技, 2014, 55(8): 10-11.

[3] 劉文洪. 百合病毒的分子鑒定與重要病毒的檢測(cè)研究[D]. 杭州: 浙江大學(xué), 2003.

[4] 沈淑琳. 百合病毒病及其檢驗(yàn)[J]. 植物檢疫, 1996, 18(4): 32-35.

[5] 劉博. 百合、水仙病毒分子檢測(cè)及脫毒技術(shù)研究[D]. 北京: 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院, 2009.

[6] 徐秉良, 梁巧蘭, 徐瓊. 百合病毒病的發(fā)生與癥狀類(lèi)型[J]. 植物保護(hù), 2004, 42(5): 62-65.

[7] 黎昊雁, 吳姍, 張曉峰, 等. 復(fù)合RT-PCR方法同步檢測(cè)百合X病毒、百合無(wú)癥病毒及百合斑駁病毒[J]. 植物保護(hù), 2006, 44(6): 42-45.

[8] 白松, 丁元明. 百合病毒病及其檢測(cè)防治方法[J]. 植物醫(yī)生, 1996, 11(1): 4-7.

[9] 王沖, 陳集雙, 洪健, 等. 以18S rRNA為內(nèi)參照的多重RT-PCR檢測(cè)3種百合病毒[J]. 植物病理學(xué)報(bào), 2006, 20(3): 204-211.

[10] 徐榕雪. 百合主要病毒的分子檢測(cè)及脫毒技術(shù)研究[D]. 南京: 南京林業(yè)大學(xué), 2007.

[11] 張怡, 李豪, 楊松. 一種安全快速提取植物RNA的方法[J]. 生物學(xué)教學(xué), 2012, 37(5): 44-45.

[12] 孫曉棠, 崔汝強(qiáng), 賀浩華, 等. 雙重RT-PCR法同時(shí)快速檢測(cè)南方水稻黑條矮縮病毒和水稻黑條矮縮病毒[J]. 江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2012, 34(5): 914-917.

[13] 張磊, 孫曉棠, 唐子清, 等. 水稻基因表達(dá)載體及RNAi載體構(gòu)建[J]. 江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2018, 40(1): 10-14.

Molecular Identification of Lily Viruses in Lianhua County, Jiangxi Province

YE Xiaomeng,ZENG Shuai, SHI Xugen, CUI Ruqiang*

(School of Agronomy, Jiangxi Agricultural University, Nanchang 330045, China)

This study was conducted to detect and identify the viral causing agents that infected lily in Lianhua County, Jiangxi Province.Total RNA were subjected to detect the viruses by using the reported specific primers of 3 main viruses-cucumber mosaic virus (CMV), lily mottle virus (LMoV), and lily syptomless virus (LSV), which were demonstrated by the reverse transcription-PCR (RT-PCR).The primers could be amplified to obtain CMV (657 bp) and LMoV (428 bp) expected for fragments with the same fragment size, but no LSV was detected. Cloning, sequencing and analyses showed that the amplified sequences had 99.08% and 98.56% identities with CMV and LMoV, respectively.In this study, the results suggested that lily was infected by CMV and LMoV.

lily; lily virus disease; multiplex RT-PCR

S432.1

A

2095-3704（2021）02-0146-04

2021-04-20

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31860494）

葉曉夢(mèng)（1997—），碩士生，主要從事植物病理學(xué)研究，xiaomeng_ye@stu.jxau.edu.cn；*通信作者：崔汝強(qiáng)，教授，博士，cuiruqiang@qq.com。

葉曉夢(mèng), 曾帥, 石緒根, 等. 江西省蓮花縣百合病毒病分子鑒定[J]. 生物災(zāi)害科學(xué), 2021, 44(2): 146-149.