熱休克蛋白HSPA1A促進腫瘤細胞增殖的研究

戚毓敏， 單 鍇， 崔 靜， 渠宏雁， 王 榮， 陳永泉*

（1.江南大學 無錫醫(yī)學院，江蘇 無錫214122；2.江南大學 食品學院，江蘇 無錫214122）

熱休克蛋白（HSP）[1]通常可以在機體遭受應激時大量表達[2]，可以幫助細胞耐受外界環(huán)境壓力，也稱為熱應激蛋白，具有高度保守性[3]。熱休克蛋白通常根據(jù)相對分子質量大小進行分類，HSP70指的是相對分子質量在7×104左右的熱休克蛋白，主要有HSPA1A、HSPA5、HSPA8、HSPA9。HSP70是熱休克蛋白家族被研究較多的蛋白質之一[4]，也是其中表達量較高的熱休克蛋白之一。HSP70主要起到分子伴侶作用，主要幫助蛋白質正確折疊，清除老舊或者受損的細胞[5]。HSP70主要存在于細胞質中，在細胞質中發(fā)揮保護細胞的作用[6]，如HSPA5定位于內(nèi)質網(wǎng)，HSPA9則位于線粒體上起到細胞保護的作用。同時也有研究表明，氧化應激時HSP70，如HSPA8會進入細胞核中，發(fā)生核位移，在細胞核中起到保護細胞的作用。誘導型HSP70（HSPA1A），也稱為HSP72[7]，在正常生理條件下表達量較低，在發(fā)生應激時，則會大量表達，HSPA1A主要通過應激誘導大量表達從而發(fā)揮作用。HSPA1A誘導后具有保護細胞的作用。例如，HSPA1A基因通過抑制核因子-κB（NF-κB）激活來抑制促炎細胞因子基因轉錄[8]，促炎細胞因子的下調保護細胞免受應激反應，防止細胞損傷或死亡從而保護機體免受應激傷害[9]。

惡性腫瘤是當下發(fā)病死亡率較高的疾病之一。惡性腫瘤的治療是醫(yī)學和生命科學的研究重點也是難點。腫瘤的主要特點就是腫瘤細胞無限制增殖，這種增殖是不受控的，因此抑制腫瘤細胞增殖是行之有效的腫瘤治療方案之一。研究表明，在大多數(shù)腫瘤細胞中均可觀察到HSPA1A蛋白水平的增加[10]，Sampson等[11]認為癌細胞擁有額外擴增的中心體，作者確定了一種新的途徑，通過NIMA相關激酶6（NEK6）和HSPA1A促進中心體聚類。NEK6及其上游激活劑可以將HSPA1A靶向到具有擴增中心體的細胞極，因此NEK6-HSPA1A可以用于靶向具有擴增中心體的癌細胞，促進細胞增殖。Wan等[12]發(fā)現(xiàn)在體外建立非小細胞肺癌NCI-H1650的亞系，即用54℃熱處理使其具有較高的耐熱性，發(fā)現(xiàn)其比原來的細胞活力和增殖速率明顯加快，通過Western Blot發(fā)現(xiàn)其HSPA1A表達量上調且用抑制劑VER155008（HSPA1A的抑制劑）能夠抑制這種細胞的活力和增殖速率。這些說明HSPA1A與癌細胞增殖相關，因此推測HSPA1A可能在腫瘤細胞的生存和增殖中扮演著重要角色。

細胞增殖周期，是細胞從上一個有絲分裂結束到下一個有絲分裂結束的過程。有絲分裂包括分裂間期和分裂期，而分裂間期包括G1期、S期、G2期。G1期主要為DNA復制提供相關物質，G1期決定了細胞是否會發(fā)生分裂，若不發(fā)生分裂則走向G0期，因此G1期也被稱為細胞周期的限制點。S期主要復制染色體，G2期主要為有絲分裂期。調節(jié)細胞周期的蛋白質主要有兩類，它們相互配合，包括細胞周期蛋白，即cyclins；細胞周期蛋白依賴激酶，即CDKs，它們的相互作用能夠共同調節(jié)細胞周期。如cyclin D1能夠與CDK4/CDK6發(fā)生相互作用，從而使G1期的周期抑制蛋白——抑癌基因成視網(wǎng)膜瘤蛋白（Rb）發(fā)生磷酸化并從E2F轉錄因子上解離，E2F可以加速細胞的G1期，cyclin D1起到促進基因轉錄的功能；cyclin E1對應的周期蛋白激酶是CDK2，其可以與CDK2結合，起到作用與cyclin D1-CDK4/CDK6這條途徑相同。研究表明cyclin通常在腫瘤發(fā)生中失調，如cyclin D1是一種原癌基因，推測其過度表達是細胞過度增殖并產(chǎn)生腫瘤的原因之一，目前已經(jīng)在膀胱癌、淋巴癌、肺癌等多種癌癥細胞中發(fā)現(xiàn)cyclin D1的過表達。cyclin E1同樣也與腫瘤細胞的惡性增殖有關，如食管癌、胃癌、肝癌等多種癌癥中發(fā)現(xiàn)cyclin E1增多，也有研究表明cyclin E1的持續(xù)過表達會導致G1期縮短。目前HSPA1A與周期相關蛋白以及激酶的關系尚不清楚。

作者主要探索HSPA1A對4種腫瘤細胞增殖的影響，并探究HSPA1A發(fā)揮作用的亞細胞定位以及對周期的影響。在此基礎上，HSPA1A有望成為一個新的腫瘤治療靶點。

1 材料與方法

1.1 材料

Forma371 CO2細胞培養(yǎng)箱、1300系列A2型生物安全柜、Attune NxT流式細胞儀、1510 Multican GO全波長酶標儀：購自Thermo（美國）有限公司；T-SAM倒置熒光顯微鏡：購自Nikon（日本）有限公司。

PRMI 1640完全培養(yǎng)基、DMEM高糖培養(yǎng)基、體積分數(shù)10%胎牛血清：購自Gibco（美國）有限公司；PI染色試劑盒：購自上海生工（上海）有限公司；轉染試劑Lipofectamine 3000：購自Thermo（美國）有限公司。

HSPA1A、cyclin D1、CDK4、CDK6、cyclin E1、CDK2：購自Protein tech（中國）有限公司。

人結腸癌細胞系HT29、人非小細胞肺癌細胞A549、人宮頸癌上皮細胞HeLa、人前列腺上皮細胞PC3：購自中國科學院上海分院。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)與傳代 輕輕吸去舊培養(yǎng)液，使用磷酸鹽緩沖液（Phosphate buffer saline，PBS）洗1遍后，加入胰酶消化，然后加入完全培養(yǎng)基，吹打5次將細胞懸液移至新離心管中，200g離心5 min，棄去上清液。重新加入新鮮完全培養(yǎng)基，輕吹混勻，將細胞懸液根據(jù)所需密度分配在培養(yǎng)皿或多孔板中，補足新鮮完全培養(yǎng)基，將細胞放回細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d后傳代。

1.2.2 細胞轉染 細胞種板，約1 000個/孔。種板完成后12～24 h內(nèi)完成細胞轉染。準備無菌無酶EP管，配置轉染體系，以96孔板為例，每孔加入5μL轉染體系。轉染體系配置：無血清培養(yǎng)基中加入質粒，按96孔板每個孔0.1μg加入質粒輕輕混勻，按每個孔0.3μL加入轉染試劑，靜置10 min。將配置的轉染體系溶液加入孔板中，4 h后更換成完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，通過觀察熒光判斷轉染效率，進行后續(xù)實驗。

1.2.3 MTT 配置MTT儲存液，質量濃度為5 mg/mL，溶液為PBS，避光溶解至無沉淀，用0.22μm無菌水系濾膜過濾除菌，避光保存。使用時，用無血清的培養(yǎng)基稀釋至終質量濃度0.5 mg/mL，吸去孔板中原有的培養(yǎng)基，每孔加入100μL稀釋的MTT工作液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，此時底部會有紫色結晶。小心吸出孔內(nèi)的MTT。每孔加入150μL二甲基亞砜，在酶聯(lián)免疫檢測儀上低速振蕩20 min，使結晶物充分溶解，在OD570nm處測量各孔的吸光度。

1.2.4 PI單染色法測細胞周期 轉染過后培養(yǎng)48 h的細胞，用胰酶消化，200g離心5 min收集細胞。加入2 mL PBS重懸細胞，200g離心5 min進行清洗，加入70%（體積分數(shù)）的乙醇（PBS），4℃固定過夜。400g離心10 min，收集細胞去廢液，PBS清洗。加入1 mL PI染液重懸細胞進行染色，冰上避光孵育45 min。流式細胞儀檢測，通道為FL2。

1.2.5 Western Blot 配制SDS-PAGE膠，上樣，每孔25μg蛋白質，設置90 V電壓進行電泳，當條帶分開至需要的位置，開始轉膜，設置300 mA，冰上進行轉膜（NC膜，GE）120 min；轉膜結束，將膜放入含5 g/dL脫脂乳粉的TBST中，室溫搖床封閉1 h。TBST洗膜3次，5 min/次，加入一抗4℃孵育過夜。吸出一抗，TBST清洗3次，5 min/次。加入相應二抗10 mL室溫孵育1 h，TBST洗膜3次，5 min/次。配制發(fā)光液，凝膠成像儀顯影成像。

1.2.6 免疫熒光 在12孔板中將處理結束的細胞爬片用預冷的PBS清洗，用4%（體積分數(shù)）的多聚甲醛在37℃培養(yǎng)箱中避光固定45 min，TBST清洗玻片5次，1 min/次，用含0.5%（體積分數(shù)）Triton X-100、5%（體積分數(shù)）FBS（PBS配制）的封閉液進行封閉打孔，室溫避光封閉打孔45 min，棄去封閉液，將爬片從孔板中取出，放在載玻片上，滴加稀釋好的一抗，完全覆蓋爬片并放入濕盒，4℃過夜。棄去一抗，PBST清洗爬片5次，1 min/次。加熒光二抗至完全覆蓋爬片，濕盒中室溫避光孵育45 min，PBST清洗爬片5次，1 min/次，滴加DAPI避光孵育30 min，PBST清洗爬片5次，1 min/次。吸干爬片上的液體，用含抗淬滅劑的封片液封片，激光共聚焦觀察。

2 結果與分析

2.1 過表達HSPA1A對癌細胞增殖的影響

采用作者所在實驗室構建成功的HSPA1A大腸桿菌重組載體（含有GFP標簽（非融合表達）的pEB），將質粒轉染HeLa、HT29、PC3細胞，48 h后收集pEB細胞蛋白質，通過Western Blot驗證能否在這3個細胞中表達成功，Western Blot顯示HSPA1A在轉染重組質粒的細胞中表達成功。

將驗證過的質粒分別再次轉染HeLa、HT29、PC3，轉染24 h后拍攝細胞圖片，48 h后進行MTT實驗。24 h后通過細胞圖片（見圖1~圖3）可以明顯觀察到瞬時轉入HSPA1A質粒后癌細胞密度增加，細胞增殖加快。48 h后通過MTT實驗可知轉染后活細胞數(shù)目增多（見圖4），進一步證明了HSPA1A能夠加快腫瘤細胞的增殖。

圖1 HeLa轉染pEB空載（a）與HSPA1A（b）后的細胞形態(tài)Fig.1 Cell morphology after pEB (left)and HSPA1A(right)transferred into HeLa

圖3 PC3轉染pEB空載（a）與HSPA1A（b）后的細胞形態(tài)Fig.3 Cell morphology after pEB (left)and HSPA1A(right)transferred into PC3

圖4 HeLa、HT29、PC3轉染pEB空載與HSPA1A后48 h的細胞存活率Fig.4 Cell viability of HeLa,HT29,PC3 transfected pEB at no load(left)and HSPA1A(right)for 48 h

圖2 HT29轉染pEB空載（a）與HSPA1A（b）后的細胞形態(tài)Fig.2 Cell morphology after pEB (left)and HSPA1A(right)transferred into HT29

2.2 免疫熒光

為探究HSPA1A在腫瘤細胞中的亞細胞定位，進行免疫熒光實驗。轉染48 h后進行免疫熒光處理。pEB載體帶GFP基因，因此轉染成功的細胞帶彌散性綠色熒光。HSPA1A蛋白用紅色熒光標記，細胞核用DAPI進行染色。

轉染HSPA1A后，紅色熒光標記的HSPA1A停留于細胞質中，并未與細胞核重疊，可得出結論HSPA1A主要在腫瘤細胞的細胞質中發(fā)揮作用（見圖5）。

圖5 3種細胞轉染pEB空載與HSPA1A的免疫熒光Fig.5 Immunofluorescence of three cells transfected pEB and HSPA1A

2.3 周期實驗

由于細胞周期各階段的DNA含量不同，而PI可以與DNA結合，因此其熒光強度直接反映了細胞內(nèi)DNA含量。通過流式細胞儀檢測PI熒光強度可以估計細胞內(nèi)DNA含量繼而確定細胞周期。

HT29細胞轉染pEB空載后，位于G1期的細胞占所有細胞數(shù)目的比例為65.38%；位于G2期的細胞占所有細胞數(shù)目的比例為0.54%；位于S期的細胞占所有細胞數(shù)目的比例為34.08%。轉染HSPA1A后位于G1期的細胞占所有細胞數(shù)目的比例為57.15%；位于G2期的細胞占所有細胞數(shù)目的比例為1.69%；位于S期的細胞占所有細胞數(shù)目的比例為41.16%（見圖6）。

圖6 HT29轉染pEB空載（a）與HSPA1A（b）后的細胞周期Fig.6 Cell cycle after HT29 transfection of pEB empty(left)and HSPA1A(right)

HeLa細胞轉染pEB空載后，位于G1期的細胞占所有細胞數(shù)目的比例為53.71%；位于G2期的細胞占所有細胞數(shù)目的比例為1.58%；位于S期的細胞占所有細胞數(shù)目的比例為44.72%。轉染HSPA1A后位于G1期的細胞占所有細胞數(shù)目的比例為48.26%；位于G2期的細胞占所有細胞數(shù)目的比例為1.40%；位于S期的細胞占所有細胞數(shù)目的比例為50.34%（見圖7）。

圖7 HeLa轉染pEB空載（a）與HSPA1A（b）后的細胞周期Fig.7 Cell cycle after HeLa transfection of pEB empty(left)and HSPA1A(right)

PC3細胞轉染pEB空載后，位于G1期的細胞占所有細胞數(shù)目的比例為56.42%；位于G2期的細胞占所有細胞數(shù)目的比例為2.38%；位于S期的細胞占所有細胞數(shù)目的比例為41.20%。轉染HSPA1A后位于G1期的細胞占所有細胞數(shù)目的比例為53.46%；位于G2期的細胞占所有細胞數(shù)目的比例為2.71%；位于S期的細胞占所有細胞數(shù)目的比例為43.83%（見圖8）。

圖8 PC3轉染pEB空載（a）與HSPA1A（b）后的細胞周期圖Fig.8 Cell cycle after PC3 transfection of pEB empty(left)and HSPA1A(right)

G1期稱為DNA合成前期，由細胞周期實驗可知HSPA1A過表達后，處于G1期的細胞明顯變少。大多數(shù)細胞處于S期和G2/M期即DNA合成中后期。因此，過表達HSPA1A可以加速腫瘤細胞的G1期。

2.4 HSA1A對周期蛋白的影響

通過周期實驗確定，HSPA1A能夠加速細胞的G1期，推測可能是腫瘤細胞增殖加快的原因。為探究過表達HSPA1A以后對G1/S檢查點相關的細胞周期蛋白（cyclin D1，cyclin E1）、細胞周期蛋白依賴激酶（CDK4、CDK6、CDK2）的影響，對3種腫瘤細胞進行轉染，轉染48 h后，收集細胞進行Western Blot。

結果表明過表達HSPA1A在細胞中可以促進cyclin D1、cyclin E1、CDK4、CDK6、CDK2的表達（見圖9）。cyclin D1、cyclin E1、CDK4、CDK6、CDK2作為確定的G1/S檢查點相關周期蛋白和周期蛋白依賴性激酶，其表達量增多，可以幫助細胞周期加快。其 中HeLa細 胞 中CDK4、CDK6、cyclin D1、cyclin E1明顯增加，HT29中CDK2、CDK4、CDK6、cyclin D1、cyclin E1均發(fā)生明顯上調，PC3中CDK4發(fā)生明顯上調。推測HSPA1A可能促進cyclin D1和CDK4/CDK6的結合和（或）cyclin E1和CDK2的結合，HSPA1A作為伴侶蛋白質可能通過穩(wěn)定cyclin D1-CDK4/CDK6和（或）cyclin E1-CDK2這兩條途徑中相關蛋白質，上調相應蛋白質含量，使細胞增殖加快。

圖9 HSPA1A對周期蛋白相關蛋白質的影響Fig.9 Effect of HSPA1A on cyclins and CDKs

2.5 討論

當細胞受到應激時，細胞中的應激誘導型HSP70發(fā)揮保護細胞的作用[13]。HSP70家族由幾個高度同源的成員組成[14]，包括HSPA1A、HSPA5、HSPA8、HSPA9[15]。HSPA1A定位與細胞質和細胞核中[16]，HSPA5定位于細胞內(nèi)質網(wǎng)上，是一個鈣離子結合蛋白質，HSPA8蛋白質均勻分布于整個細胞，HSPA9作為線粒體伴侶蛋白質，主要定位于線粒體中[17]。有證據(jù)表明HSP70在癌癥中過表達，這種伴侶蛋白質的高表達與腫瘤的產(chǎn)生和預后不良反應有關[18]。例如，HSP70過表達是早期肝細胞和前列腺癌的標志，也是大腸癌和乳腺癌晚期癌細胞結轉移的標志之一[19]。

目前HSPA1A對細胞的增殖作用及相關機制尚未有明確的研究。已有的研究表明，外源性的HSPA1A可以促進腫瘤的生長。HSPA1A通過TLR2和TLR4信號傳導促進H22肝癌細胞的增殖，推測HSPA1A充當TLR2和TLR4的內(nèi)源性配體，以促進腫瘤生長[20]。

3 結 語

本研究發(fā)現(xiàn)HSPA1A可以促進PC3、HT29、HeLa這3種腫瘤細胞增殖。通過免疫熒光發(fā)現(xiàn)HSPA1A主要在細胞質中發(fā)揮增殖作用，PI染色發(fā)現(xiàn)HSPA1A主要加速了腫瘤細胞的G1期。在過表達HSPA1A后，發(fā)現(xiàn)G1/S檢查點相關的周期蛋白和周期蛋白依賴激酶表達量均上調。腫瘤細胞中，基礎氧化應激與蛋白質合成均有上調，HSPA1A作為伴侶蛋白質，可以幫助蛋白質正確折疊，同時穩(wěn)定蛋白質構象。因此，腫瘤中高表達HSPA1A可能通過穩(wěn)定cyclin D1-CDK4/CDK6和（或）cyclin E1-CDK2這兩條途徑中的相關蛋白質幫助細胞加速通過G1/S檢查點。

HSPA1A能夠有效促進癌細胞增殖，因此通過尋找靶向HSPA1A的藥物有望抑制腫瘤細胞的增殖，對于臨床腫瘤的治療有重要作用。但是HSPA1A在細胞質中起到伴侶作用，以及在其他腫瘤細胞中的作用尚待研究。