含牛輪狀病毒VP6 的嵌合型HBcAg 顆?？乖闹苽浼捌涿庖咴苑治?/h1>
2021-07-24 04:36:20邢亞茹張?jiān)鲑t顧文源彭志豪左玉柱范京惠
邢亞茹，張?jiān)鲑t，顧文源，郭 禹，彭志豪，左玉柱，范京惠
（1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院，河北 保定 071001; 2. 寧晉縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，河北 寧晉 055550; 3. 河北省動物疫病預(yù)防控制中心，河北 石家莊 050035; 4. 河北省獸醫(yī)生物技術(shù)創(chuàng)新中心，河北 保定 071001）
牛輪狀病毒（Bovine rotavirus,BRV）是犢牛腹瀉的重要病原之一。1968 年Mebus 等首次從新生犢牛腹瀉糞便中分離到NCDV 株，并證實(shí)BRV 是引發(fā)新生犢牛腹瀉的主要病原［1］。1980 年福建畜牧獸醫(yī)研究所研究證實(shí)BRV 也存在于我國牛群中［2］。目前BRV感染在全球范圍內(nèi)流行，嚴(yán)重威脅著全世界養(yǎng)牛業(yè)的快速發(fā)展［3］，因此有必要加強(qiáng)對BRV 的及時(shí)監(jiān)測和防治。而預(yù)防BRV 的主要手段就是通過疫苗進(jìn)行免疫接種，常見的疫苗有滅活疫苗和減毒活疫苗。世界范圍內(nèi)唯一的商品化BRV 減毒疫苗（NCDV-lincoln 株）已經(jīng)獲得USDA 的批文［4］。近年來，隨著科學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步和發(fā)展，基因工程疫苗也得到快速的發(fā)展，如嵌合疫苗、轉(zhuǎn)基因疫苗和亞單位疫苗等。
RV 由外層衣殼、內(nèi)層衣殼和核心衣殼3 層衣殼蛋白組成，分別編碼（VP1 ～VP4、VP6、VP7）6 種結(jié)構(gòu)蛋白和（NSP1 ～NSP6）6 種非結(jié)構(gòu)蛋白［5］。VP6 蛋白可以在組裝病毒顆粒的過程中讓VP4 和VP7 空間結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定從而增強(qiáng)外殼蛋白的免疫原性。同時(shí)VP6 蛋白可以針對不同輪狀病毒毒株產(chǎn)生交叉保護(hù)性免疫應(yīng)答，這對BRV 疫苗的研制具有重要意義［6］。
1986 年，Newton SE 和Clarke 等人首次報(bào)道了HBcAg 可作為VLP 載體，用于包裝外源的口蹄疫病毒片段，并通過實(shí)驗(yàn)證明可獲得良好的免疫保護(hù)效果，這為表達(dá)其他外源性抗原提供了可能［7-9］，同時(shí)HBcAg 在許多表達(dá)系統(tǒng)中都能高水平表達(dá)，如在人HeLa 細(xì)胞、腺病毒載體表達(dá)系統(tǒng)及細(xì)菌（大腸桿菌、沙門氏菌等）表達(dá)系統(tǒng)中都能有效表達(dá)［10-11］。因此，本研究以HBcAg 作為載體蛋白，在其主要免疫優(yōu)勢區(qū)插入VP6 序列，經(jīng)誘導(dǎo)后在大腸桿菌中表達(dá)獲得重組HBc-VP6 蛋白，并在小鼠模型組中檢測重組蛋白的免疫原性，為今后研制BRV 疫苗提供重要的參考。
1 材料與方法
1.1 材料和試劑
pcDNA3.1(+)-HBcAg-VP1-VP4 陽性質(zhì)粒由王家鑫老師惠贈；pET32a 空質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)室保存；BRV病毒陽性血清由本實(shí)驗(yàn)室收集保存；pMD19-T 載體、DL2000 DNA Marker、大腸桿菌DH5α 和BL21 感受態(tài)菌細(xì)胞均購自寶生物（大連）有限公司；蛋白純化試劑盒購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；小鼠細(xì)胞因子ELISA 檢測試劑盒為北京綠源伯德生物科技有限公司產(chǎn)品；BALB/c 小鼠購自斯貝福實(shí)驗(yàn)動物科技有限公司。
1.2 引物的設(shè)計(jì)與合成
根據(jù)BRV（登錄號MN047454）VP6 基因和乙肝病毒核心抗原基因序列（KC774394），設(shè)計(jì)上下游引物PCR.擴(kuò)增所需的片段（見表1）。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。
表1 引物信息Table 1 Primer information
1.3 融合基因的擴(kuò)增與重組表達(dá)載體的構(gòu)建
以pcDNA3.1(+)-HBcAg-VP1-VP4 為 模 板，使用引物P5 及P6 擴(kuò)增F3 片段，即HBcAg（編碼83 ～144 aa）基因，膠回收PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物利用XhoⅠ和Hind Ⅲ進(jìn)行雙酶切回收并連接至pET32a 載體上，獲得pET32a- HBcAg(編碼83 ～144aa)重組質(zhì)粒。同理利用P1 和P2 為引物擴(kuò)增F1 片段，即HBcAg（編碼1 ～74 aa），使用引物P3 及P4 擴(kuò)增F2 片段，即VP6 基因。通過Overlap PCR 法將F1 和F2 片段融合擴(kuò)增得到HBcAg(編碼1 ～74aa)-VP6基因，膠回收PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物利用EcoRⅠ和Hind Ⅲ進(jìn)行雙酶切回收并連接至pET32a-HBcAg (編碼83 ～144 aa)重組質(zhì)粒，獲得重組質(zhì)粒pET32a-HBcAg-VP6。
1.4 重組蛋白的表達(dá)及純化
將測序正確的陽性菌液培養(yǎng)至OD600nm為0.6 ～0.8 時(shí)，加入誘導(dǎo)劑IPTG，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)6 h，收集菌體。超聲破碎菌體，分別收集上清和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE 電泳，觀察目的蛋白的表達(dá)情況。超聲裂解收集誘導(dǎo)的菌體沉淀按照蛋白純化試劑盒說明書進(jìn)行純化。將純化后的蛋白溶液加入透析袋中，在4 ℃條件下透析，每6 ～8 h 更換1 次透析液，透析液中尿素的濃度依次為6、4、2、1、0 mol/L，測定透析后的蛋白濃度。
1.5 重組蛋白的Western blot 鑒定
將純化后的重組蛋白HBc-VP6 進(jìn)行SDS-PAGE電泳后將蛋白轉(zhuǎn)移至NC 膜上，5%脫脂牛奶4 ℃封閉過夜，用1∶500 稀釋的BRV 陽性血清室溫孵育2 h，PBST 洗滌3 次。加入1∶10 000 稀釋的HRP兔抗牛IgG 室溫孵育2 h，PBST 洗滌3 次。使用DAB 顯色液顯色。
1.6 透射電鏡成像
復(fù)性后的目的蛋白送至河北師范大學(xué)分析測試中心進(jìn)行透射電鏡成像實(shí)驗(yàn)，觀察病毒樣顆粒的形成情況。
1.7 小鼠免疫驗(yàn)證
將24 只6 ～8 周齡的BALB/c 小鼠隨機(jī)平均分成3 組。即HBc-VP6 組、VP6 組和PBS 組。于第0 天將HBc-VP6 重組蛋白和VP6 重組蛋白分別與完全弗氏佐劑1∶1 混勻乳化后進(jìn)行背部皮下多點(diǎn)注射。HBc-VP6 組接種50 μg/只的HBc-VP6 重組蛋白；VP6 組接種50 μg/只的VP6 重組蛋白；PBS 組接種等量的PBS。在第14、28 天將HBc-VP6 重組蛋白和VP6 重組蛋白分別與不完全弗氏佐劑1∶1 混勻乳化后按照首次的免疫劑量和方式對各組小鼠進(jìn)行免疫。于首免后第7、14、21、28、35、42、49 天進(jìn)行尾靜脈采血。室溫放置1 h 后，4 ℃靜置過夜，3 000 r/min 離心10 min，收集血清存放于-20 ℃。
1.8 ELISA 檢測
通過間接ELISA 檢測血清中抗BRV 的特異性IgG 抗體。將純化的HBc-VP6 蛋白稀釋至2 μg/mL作為包被抗原，包被96 孔培養(yǎng)板，每孔100 μL，37 ℃孵育1 h，4 ℃孵育過夜。PBST 洗滌3 次，以1∶200 稀釋的血清為一抗，以HRP 標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG 為二抗，以TMB 底物顯色液顯色，多功能酶標(biāo)儀檢測OD450值。
1.9 細(xì)胞因子檢測
采用商業(yè)化細(xì)胞因子ELISA 試劑盒，檢測待測血清中細(xì)胞因子IL-4 的質(zhì)量濃度。標(biāo)準(zhǔn)孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品各50 μL，待測樣品孔中先加樣品稀釋液40 μL，然后加待測樣品10 μL，輕輕晃動混勻后每孔加入酶標(biāo)試劑100 μL，用封板膜封板后置37 ℃溫育60 min。棄去液體，甩干，每孔加滿稀釋后的洗滌液，靜置30 s 后棄去，重復(fù)洗滌5 次，拍干。每孔加入顯色劑A 50 μL，再加入顯色劑B 50 μL，輕輕振蕩混勻，37 ℃避光顯色15 min，每孔加50 μL 終止液終止反應(yīng)，450 nm 波長測量各孔的吸光度（OD 值）。以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)，OD 值為縱坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品的OD 值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實(shí)際濃度。
采用商業(yè)化細(xì)胞因子ELISA 試劑盒，檢測待測血清中IFN-γ 的質(zhì)量濃度。具體操作參照細(xì)胞因子IL-4 的質(zhì)量濃度的操作方法并結(jié)合小鼠γ 干擾素酶聯(lián)免疫分析試劑盒說明書進(jìn)行檢測。
1.10 數(shù)據(jù)分析
應(yīng)用GraphPad Prism8.0.1 軟件進(jìn)行作圖與數(shù)據(jù)分析，采用t檢驗(yàn)進(jìn)行差異顯著性分析，P＜0.05 認(rèn)為具有生物統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2 結(jié)果與分析
2.1 重組質(zhì)粒的鑒定
重組表達(dá)質(zhì)粒pET32a-HBcAg-VP6經(jīng)EcoRⅠ、XhoⅠ雙酶切后得到5 900 bp（載體）和1 014 bp（目的基因）2 條條帶（圖1），說明重組的HBcAg-VP6基因已成功插入到pET32a 載體中。
圖1 重組質(zhì)粒pET32a- HBcAg-VP6 的酶切鑒定Fig.1 Identification of pET32a-HBcAg-VP6 by enzyme digestion
2.2 重組蛋白的純化與復(fù)性
超聲裂解后收集的上清和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE 檢測，結(jié)果顯示重組蛋白HBc-VP6主要存在于包涵體中（見圖2）。純化并復(fù)性后的重組蛋白HBc-VP6 經(jīng)SDSPAGE 檢測可見僅在57 kD 左右的單一條帶（見圖3），經(jīng)BandScan 軟件分析蛋白純度可達(dá)80%以上，經(jīng)濃縮后重組蛋白HBc-VP6 的質(zhì)量濃度為0.54 mg/mL。
圖2 重組蛋白的可溶性檢測Fig.2 Soluble detection of recombinant protein
圖3 HBc-VP6 蛋白純化的SDS-PAGE 分析Fig.3 SDS-PAGE analysis of HBc-VP6 protein purification
2.3 目的蛋白的Western blot 檢測
Western blot 檢測結(jié)果顯示，純化復(fù)性后的蛋白HBc-VP6 在約57 kD 處出現(xiàn)單一的條帶（圖4），說明其可以和BRV 陽性血清發(fā)生良好的反應(yīng)。
圖4 HBc-VP6 蛋白Western-blot 分析Fig.4 Western-blot analysis of HBc-VP6 protein
2.4 透射電鏡檢測重組蛋白HBc-VP6
純化復(fù)性后的重組蛋白在透射電子顯微鏡下呈現(xiàn)病毒樣顆粒結(jié)構(gòu)（圖5），表明VP6 蛋白與HBc蛋白融合表達(dá)后，HBc-VP6 重組蛋白能自我折疊裝配成病毒樣顆粒結(jié)構(gòu)。
圖5 透射電鏡檢測HBc-VP6 重組蛋白病毒樣顆粒結(jié)構(gòu)Fig.5 Observation of virus-like particles of HBc-VP6 recombinant protein by negative-stain TEM
2.5 特異性抗體的ELISA 檢測
ELISA 結(jié)果顯示，重組蛋白HBc-VP6 和VP6首次免疫后第14 天加強(qiáng)免疫，產(chǎn)生的抗BRV 特異性抗體水平明顯升高（圖6）。首次免疫后第14天HBc-VP6 和VP6 抗體水平顯著高于PBS 組（P＜0.01）。首次免疫后第21 天HBc-VP6 組產(chǎn)生的抗體水平顯著高于另外兩組（P＜0.01）。在整個(gè)過程中，HBc-VP6 組的抗體水平較高，PBS 組并未檢測到抗BRV 特異性抗體。
圖6 免疫后小鼠血清中BRV 特異性抗體IgG 的檢測Fig.6 Detection of BRV specific antibody IgG in serum of immunized mice
2.6 細(xì)胞因子的檢測
為了進(jìn)一步檢測小鼠產(chǎn)生的免疫應(yīng)答的類型和水平，本研究檢測免疫小鼠血清中Th1 型（IFN-γ）和Th2 型（IL-4）細(xì)胞因子的質(zhì)量濃度。結(jié)果表明HBc-VP6 組和VP6 組產(chǎn)生的IL-4 水平顯著高于PBS 組（P＜0.01）。首免后第7 天HBc-VP6 組產(chǎn)生的IL-4 水平高于VP6 組和PBS 組（P＜0.05）。首免后第21 天HBc-VP6 組產(chǎn)生的IL-4 水平顯著高于VP6 組（P＜0.01）。首免后第28 天VP6 組產(chǎn)生的IL-4 水平顯著高于PBS 組(見圖7)。
圖7 免疫后小鼠血清細(xì)胞因子IL-4 的檢測Fig.7 Detection of serum cytokines IL-4 in mice after immunization
細(xì)胞因子IFN-γ 檢測結(jié)果表明（見圖8），首免后第7 天HBc-VP6 組和VP6 組產(chǎn)生的IFN-γ 水平顯著高于PBS 組（P＜0.05），首免后第14 天HBc-VP6 組和VP6 組產(chǎn)生的IFN-γ 水平極顯著高于PBS 組（P＜0.01），但HBc-VP6 組和VP6 組產(chǎn)生的IFN-γ 水平無明顯差異。
圖8 免疫后小鼠血清細(xì)胞因子IFN-γ 的檢測Fig.8 Detection of serum cytokines IFN-γ in mice after immunization
3 結(jié)論與討論
犢牛腹瀉是養(yǎng)牛場飼養(yǎng)管理過程中面臨的最主要的奶牛健康問題之一，而牛輪狀病毒是引起犢牛腹瀉最主要同時(shí)也是發(fā)生率最高的病原，7 日齡以內(nèi)犢牛最為易感［12-13］。因此用疫苗接種預(yù)防BRV感染就成為犢牛腹瀉防控的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。VP6 蛋白作為決定輪狀病毒分組的特異性抗原有較強(qiáng)的免疫原性，是輪狀病毒感染血清抗體檢測重要的候選抗原［14］。VP6 蛋白作為RV 共同亞組的抗原蛋白，在原核表達(dá)系統(tǒng)中VP6 表達(dá)效率高，可作為重組亞單位疫苗抵抗不同基因型RV 的感染［15］。故本研究將VP6 蛋白插入到HBcAg 的免疫顯性區(qū)的基因中，使其在大腸桿菌BL21 中表達(dá)融合蛋白HBc-VP6，并通過Western blot 對所表達(dá)的融合蛋白進(jìn)行鑒定。同時(shí)在小鼠模型中檢測了重組抗原的免疫原性和產(chǎn)生的免疫反應(yīng)類型。
BRV 引起的腹瀉在新生犢牛最為常見，新生犢牛的保護(hù)機(jī)制主要是由泌乳免疫介導(dǎo)的，哺乳初期犢牛主要通過母乳獲得抗體，犢牛從母乳中獲取的BRV 特異性抗體IgG 在預(yù)防全身性感染中承擔(dān)重要作用［16-18］。本研究結(jié)果表明，最終檢測的HBc-VP6 組和VP6 組均能產(chǎn)生抗BRV 的特異性抗體IgG，且抗體水平顯著高于PBS 對照組(P＜0.01),同時(shí)HBc-VP6 組產(chǎn)生的抗體水平顯著高于VP6 組，說明HBcAg 與外源基因VP6融合表達(dá)后，其自發(fā)組裝成的HBc-VLPs 不僅其本身具有較強(qiáng)的免疫原性，且相連后可與外源基因VP6增強(qiáng)外源基因的免疫原性。
IFN-γ 由Th1 型細(xì)胞分泌，在機(jī)體產(chǎn)生的細(xì)胞免疫過程中承擔(dān)重要的作用。IL-4 由Th2 型細(xì)胞產(chǎn)生，促進(jìn)B 淋巴細(xì)胞的增殖和分化，在機(jī)體的體液免疫反應(yīng)中承擔(dān)重要作用。為探討重組抗原HBc-VP6 誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)類型，本研究檢測了免疫小鼠血清中IFN-γ 和IL-4 的水平，結(jié)果顯示，HBc-VP6 組和VP6 組小鼠在免疫后第7 天既產(chǎn)生IFN-γ，同時(shí)也產(chǎn)生IL-4，且分泌水平顯著高于PBS 組(P＜0.01),這表明重組抗原能夠促進(jìn)Th1 型和Th2 型細(xì)胞免疫反應(yīng)，間接表明HBc-VP6 能同時(shí)促進(jìn)細(xì)胞免疫和體液免疫反應(yīng)。
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RV 由外層衣殼、內(nèi)層衣殼和核心衣殼3 層衣殼蛋白組成，分別編碼（VP1 ～VP4、VP6、VP7）6 種結(jié)構(gòu)蛋白和（NSP1 ～NSP6）6 種非結(jié)構(gòu)蛋白［5］。VP6 蛋白可以在組裝病毒顆粒的過程中讓VP4 和VP7 空間結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定從而增強(qiáng)外殼蛋白的免疫原性。同時(shí)VP6 蛋白可以針對不同輪狀病毒毒株產(chǎn)生交叉保護(hù)性免疫應(yīng)答，這對BRV 疫苗的研制具有重要意義［6］。
1986 年，Newton SE 和Clarke 等人首次報(bào)道了HBcAg 可作為VLP 載體，用于包裝外源的口蹄疫病毒片段，并通過實(shí)驗(yàn)證明可獲得良好的免疫保護(hù)效果，這為表達(dá)其他外源性抗原提供了可能［7-9］，同時(shí)HBcAg 在許多表達(dá)系統(tǒng)中都能高水平表達(dá)，如在人HeLa 細(xì)胞、腺病毒載體表達(dá)系統(tǒng)及細(xì)菌（大腸桿菌、沙門氏菌等）表達(dá)系統(tǒng)中都能有效表達(dá)［10-11］。因此，本研究以HBcAg 作為載體蛋白，在其主要免疫優(yōu)勢區(qū)插入VP6 序列，經(jīng)誘導(dǎo)后在大腸桿菌中表達(dá)獲得重組HBc-VP6 蛋白，并在小鼠模型組中檢測重組蛋白的免疫原性，為今后研制BRV 疫苗提供重要的參考。
1 材料與方法
1.1 材料和試劑
pcDNA3.1(+)-HBcAg-VP1-VP4 陽性質(zhì)粒由王家鑫老師惠贈；pET32a 空質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)室保存；BRV病毒陽性血清由本實(shí)驗(yàn)室收集保存；pMD19-T 載體、DL2000 DNA Marker、大腸桿菌DH5α 和BL21 感受態(tài)菌細(xì)胞均購自寶生物（大連）有限公司；蛋白純化試劑盒購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；小鼠細(xì)胞因子ELISA 檢測試劑盒為北京綠源伯德生物科技有限公司產(chǎn)品；BALB/c 小鼠購自斯貝福實(shí)驗(yàn)動物科技有限公司。
1.2 引物的設(shè)計(jì)與合成
根據(jù)BRV（登錄號MN047454）VP6 基因和乙肝病毒核心抗原基因序列（KC774394），設(shè)計(jì)上下游引物PCR.擴(kuò)增所需的片段（見表1）。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。
表1 引物信息Table 1 Primer information
1.3 融合基因的擴(kuò)增與重組表達(dá)載體的構(gòu)建
以pcDNA3.1(+)-HBcAg-VP1-VP4 為 模 板，使用引物P5 及P6 擴(kuò)增F3 片段，即HBcAg（編碼83 ～144 aa）基因，膠回收PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物利用XhoⅠ和Hind Ⅲ進(jìn)行雙酶切回收并連接至pET32a 載體上，獲得pET32a- HBcAg(編碼83 ～144aa)重組質(zhì)粒。同理利用P1 和P2 為引物擴(kuò)增F1 片段，即HBcAg（編碼1 ～74 aa），使用引物P3 及P4 擴(kuò)增F2 片段，即VP6 基因。通過Overlap PCR 法將F1 和F2 片段融合擴(kuò)增得到HBcAg(編碼1 ～74aa)-VP6基因，膠回收PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物利用EcoRⅠ和Hind Ⅲ進(jìn)行雙酶切回收并連接至pET32a-HBcAg (編碼83 ～144 aa)重組質(zhì)粒，獲得重組質(zhì)粒pET32a-HBcAg-VP6。
1.4 重組蛋白的表達(dá)及純化
將測序正確的陽性菌液培養(yǎng)至OD600nm為0.6 ～0.8 時(shí)，加入誘導(dǎo)劑IPTG，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)6 h，收集菌體。超聲破碎菌體，分別收集上清和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE 電泳，觀察目的蛋白的表達(dá)情況。超聲裂解收集誘導(dǎo)的菌體沉淀按照蛋白純化試劑盒說明書進(jìn)行純化。將純化后的蛋白溶液加入透析袋中，在4 ℃條件下透析，每6 ～8 h 更換1 次透析液，透析液中尿素的濃度依次為6、4、2、1、0 mol/L，測定透析后的蛋白濃度。
1.5 重組蛋白的Western blot 鑒定
將純化后的重組蛋白HBc-VP6 進(jìn)行SDS-PAGE電泳后將蛋白轉(zhuǎn)移至NC 膜上，5%脫脂牛奶4 ℃封閉過夜，用1∶500 稀釋的BRV 陽性血清室溫孵育2 h，PBST 洗滌3 次。加入1∶10 000 稀釋的HRP兔抗牛IgG 室溫孵育2 h，PBST 洗滌3 次。使用DAB 顯色液顯色。
1.6 透射電鏡成像
復(fù)性后的目的蛋白送至河北師范大學(xué)分析測試中心進(jìn)行透射電鏡成像實(shí)驗(yàn)，觀察病毒樣顆粒的形成情況。
1.7 小鼠免疫驗(yàn)證
將24 只6 ～8 周齡的BALB/c 小鼠隨機(jī)平均分成3 組。即HBc-VP6 組、VP6 組和PBS 組。于第0 天將HBc-VP6 重組蛋白和VP6 重組蛋白分別與完全弗氏佐劑1∶1 混勻乳化后進(jìn)行背部皮下多點(diǎn)注射。HBc-VP6 組接種50 μg/只的HBc-VP6 重組蛋白；VP6 組接種50 μg/只的VP6 重組蛋白；PBS 組接種等量的PBS。在第14、28 天將HBc-VP6 重組蛋白和VP6 重組蛋白分別與不完全弗氏佐劑1∶1 混勻乳化后按照首次的免疫劑量和方式對各組小鼠進(jìn)行免疫。于首免后第7、14、21、28、35、42、49 天進(jìn)行尾靜脈采血。室溫放置1 h 后，4 ℃靜置過夜，3 000 r/min 離心10 min，收集血清存放于-20 ℃。
1.8 ELISA 檢測
通過間接ELISA 檢測血清中抗BRV 的特異性IgG 抗體。將純化的HBc-VP6 蛋白稀釋至2 μg/mL作為包被抗原，包被96 孔培養(yǎng)板，每孔100 μL，37 ℃孵育1 h，4 ℃孵育過夜。PBST 洗滌3 次，以1∶200 稀釋的血清為一抗，以HRP 標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG 為二抗，以TMB 底物顯色液顯色，多功能酶標(biāo)儀檢測OD450值。
1.9 細(xì)胞因子檢測
采用商業(yè)化細(xì)胞因子ELISA 試劑盒，檢測待測血清中細(xì)胞因子IL-4 的質(zhì)量濃度。標(biāo)準(zhǔn)孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品各50 μL，待測樣品孔中先加樣品稀釋液40 μL，然后加待測樣品10 μL，輕輕晃動混勻后每孔加入酶標(biāo)試劑100 μL，用封板膜封板后置37 ℃溫育60 min。棄去液體，甩干，每孔加滿稀釋后的洗滌液，靜置30 s 后棄去，重復(fù)洗滌5 次，拍干。每孔加入顯色劑A 50 μL，再加入顯色劑B 50 μL，輕輕振蕩混勻，37 ℃避光顯色15 min，每孔加50 μL 終止液終止反應(yīng)，450 nm 波長測量各孔的吸光度（OD 值）。以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)，OD 值為縱坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品的OD 值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實(shí)際濃度。
采用商業(yè)化細(xì)胞因子ELISA 試劑盒，檢測待測血清中IFN-γ 的質(zhì)量濃度。具體操作參照細(xì)胞因子IL-4 的質(zhì)量濃度的操作方法并結(jié)合小鼠γ 干擾素酶聯(lián)免疫分析試劑盒說明書進(jìn)行檢測。
1.10 數(shù)據(jù)分析
應(yīng)用GraphPad Prism8.0.1 軟件進(jìn)行作圖與數(shù)據(jù)分析，采用t檢驗(yàn)進(jìn)行差異顯著性分析，P＜0.05 認(rèn)為具有生物統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2 結(jié)果與分析
2.1 重組質(zhì)粒的鑒定
重組表達(dá)質(zhì)粒pET32a-HBcAg-VP6經(jīng)EcoRⅠ、XhoⅠ雙酶切后得到5 900 bp（載體）和1 014 bp（目的基因）2 條條帶（圖1），說明重組的HBcAg-VP6基因已成功插入到pET32a 載體中。
圖1 重組質(zhì)粒pET32a- HBcAg-VP6 的酶切鑒定Fig.1 Identification of pET32a-HBcAg-VP6 by enzyme digestion
2.2 重組蛋白的純化與復(fù)性
超聲裂解后收集的上清和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE 檢測，結(jié)果顯示重組蛋白HBc-VP6主要存在于包涵體中（見圖2）。純化并復(fù)性后的重組蛋白HBc-VP6 經(jīng)SDSPAGE 檢測可見僅在57 kD 左右的單一條帶（見圖3），經(jīng)BandScan 軟件分析蛋白純度可達(dá)80%以上，經(jīng)濃縮后重組蛋白HBc-VP6 的質(zhì)量濃度為0.54 mg/mL。
圖2 重組蛋白的可溶性檢測Fig.2 Soluble detection of recombinant protein
圖3 HBc-VP6 蛋白純化的SDS-PAGE 分析Fig.3 SDS-PAGE analysis of HBc-VP6 protein purification
2.3 目的蛋白的Western blot 檢測
Western blot 檢測結(jié)果顯示，純化復(fù)性后的蛋白HBc-VP6 在約57 kD 處出現(xiàn)單一的條帶（圖4），說明其可以和BRV 陽性血清發(fā)生良好的反應(yīng)。
圖4 HBc-VP6 蛋白Western-blot 分析Fig.4 Western-blot analysis of HBc-VP6 protein
2.4 透射電鏡檢測重組蛋白HBc-VP6
純化復(fù)性后的重組蛋白在透射電子顯微鏡下呈現(xiàn)病毒樣顆粒結(jié)構(gòu)（圖5），表明VP6 蛋白與HBc蛋白融合表達(dá)后，HBc-VP6 重組蛋白能自我折疊裝配成病毒樣顆粒結(jié)構(gòu)。
圖5 透射電鏡檢測HBc-VP6 重組蛋白病毒樣顆粒結(jié)構(gòu)Fig.5 Observation of virus-like particles of HBc-VP6 recombinant protein by negative-stain TEM
2.5 特異性抗體的ELISA 檢測
ELISA 結(jié)果顯示，重組蛋白HBc-VP6 和VP6首次免疫后第14 天加強(qiáng)免疫，產(chǎn)生的抗BRV 特異性抗體水平明顯升高（圖6）。首次免疫后第14天HBc-VP6 和VP6 抗體水平顯著高于PBS 組（P＜0.01）。首次免疫后第21 天HBc-VP6 組產(chǎn)生的抗體水平顯著高于另外兩組（P＜0.01）。在整個(gè)過程中，HBc-VP6 組的抗體水平較高，PBS 組并未檢測到抗BRV 特異性抗體。
圖6 免疫后小鼠血清中BRV 特異性抗體IgG 的檢測Fig.6 Detection of BRV specific antibody IgG in serum of immunized mice
2.6 細(xì)胞因子的檢測
為了進(jìn)一步檢測小鼠產(chǎn)生的免疫應(yīng)答的類型和水平，本研究檢測免疫小鼠血清中Th1 型（IFN-γ）和Th2 型（IL-4）細(xì)胞因子的質(zhì)量濃度。結(jié)果表明HBc-VP6 組和VP6 組產(chǎn)生的IL-4 水平顯著高于PBS 組（P＜0.01）。首免后第7 天HBc-VP6 組產(chǎn)生的IL-4 水平高于VP6 組和PBS 組（P＜0.05）。首免后第21 天HBc-VP6 組產(chǎn)生的IL-4 水平顯著高于VP6 組（P＜0.01）。首免后第28 天VP6 組產(chǎn)生的IL-4 水平顯著高于PBS 組(見圖7)。
圖7 免疫后小鼠血清細(xì)胞因子IL-4 的檢測Fig.7 Detection of serum cytokines IL-4 in mice after immunization
細(xì)胞因子IFN-γ 檢測結(jié)果表明（見圖8），首免后第7 天HBc-VP6 組和VP6 組產(chǎn)生的IFN-γ 水平顯著高于PBS 組（P＜0.05），首免后第14 天HBc-VP6 組和VP6 組產(chǎn)生的IFN-γ 水平極顯著高于PBS 組（P＜0.01），但HBc-VP6 組和VP6 組產(chǎn)生的IFN-γ 水平無明顯差異。
圖8 免疫后小鼠血清細(xì)胞因子IFN-γ 的檢測Fig.8 Detection of serum cytokines IFN-γ in mice after immunization
3 結(jié)論與討論
犢牛腹瀉是養(yǎng)牛場飼養(yǎng)管理過程中面臨的最主要的奶牛健康問題之一，而牛輪狀病毒是引起犢牛腹瀉最主要同時(shí)也是發(fā)生率最高的病原，7 日齡以內(nèi)犢牛最為易感［12-13］。因此用疫苗接種預(yù)防BRV感染就成為犢牛腹瀉防控的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。VP6 蛋白作為決定輪狀病毒分組的特異性抗原有較強(qiáng)的免疫原性，是輪狀病毒感染血清抗體檢測重要的候選抗原［14］。VP6 蛋白作為RV 共同亞組的抗原蛋白，在原核表達(dá)系統(tǒng)中VP6 表達(dá)效率高，可作為重組亞單位疫苗抵抗不同基因型RV 的感染［15］。故本研究將VP6 蛋白插入到HBcAg 的免疫顯性區(qū)的基因中，使其在大腸桿菌BL21 中表達(dá)融合蛋白HBc-VP6，并通過Western blot 對所表達(dá)的融合蛋白進(jìn)行鑒定。同時(shí)在小鼠模型中檢測了重組抗原的免疫原性和產(chǎn)生的免疫反應(yīng)類型。
BRV 引起的腹瀉在新生犢牛最為常見，新生犢牛的保護(hù)機(jī)制主要是由泌乳免疫介導(dǎo)的，哺乳初期犢牛主要通過母乳獲得抗體，犢牛從母乳中獲取的BRV 特異性抗體IgG 在預(yù)防全身性感染中承擔(dān)重要作用［16-18］。本研究結(jié)果表明，最終檢測的HBc-VP6 組和VP6 組均能產(chǎn)生抗BRV 的特異性抗體IgG，且抗體水平顯著高于PBS 對照組(P＜0.01),同時(shí)HBc-VP6 組產(chǎn)生的抗體水平顯著高于VP6 組，說明HBcAg 與外源基因VP6融合表達(dá)后，其自發(fā)組裝成的HBc-VLPs 不僅其本身具有較強(qiáng)的免疫原性，且相連后可與外源基因VP6增強(qiáng)外源基因的免疫原性。
IFN-γ 由Th1 型細(xì)胞分泌，在機(jī)體產(chǎn)生的細(xì)胞免疫過程中承擔(dān)重要的作用。IL-4 由Th2 型細(xì)胞產(chǎn)生，促進(jìn)B 淋巴細(xì)胞的增殖和分化，在機(jī)體的體液免疫反應(yīng)中承擔(dān)重要作用。為探討重組抗原HBc-VP6 誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)類型，本研究檢測了免疫小鼠血清中IFN-γ 和IL-4 的水平，結(jié)果顯示，HBc-VP6 組和VP6 組小鼠在免疫后第7 天既產(chǎn)生IFN-γ，同時(shí)也產(chǎn)生IL-4，且分泌水平顯著高于PBS 組(P＜0.01),這表明重組抗原能夠促進(jìn)Th1 型和Th2 型細(xì)胞免疫反應(yīng)，間接表明HBc-VP6 能同時(shí)促進(jìn)細(xì)胞免疫和體液免疫反應(yīng)。
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