云南省邊境地區(qū)哨兵牛芒市病毒的分離與鑒定

李占鴻，謝佳芮，楊振興，寇美玲，李華春，高 翔，胡忠燕，李卓然，廖德芳，楊 恒

(1 云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院 云南省熱帶亞熱帶動物病毒病重點實驗室，云南 昆明 650224； 2 景洪市動物疫病預(yù)防控制中心，云南 景洪 666100)

芒市病毒 (Mangshi virus, MSV)為一種新發(fā)現(xiàn)的蟲媒病毒，隸屬呼腸孤病毒科Reoviridae東南亞十二節(jié)段RNA病毒屬Seadornavirus，病毒于2013年從云南省芒市采集的三帶喙庫蚊Culex tritaeniorhynchus中首次分離并因而得名[1]，隨后在我國廣東省汕頭市濠江區(qū)采集的三帶喙庫蚊中再次分離到MSV[2]，目前對該病毒在動物健康和公共衛(wèi)生的危害尚不清楚。近年，寨卡病毒[3]、登革熱病毒[4]、非洲豬瘟病毒[5]、非洲馬瘟病毒[6]等新發(fā)和再發(fā)蟲媒病毒給我國公共衛(wèi)生安全和畜牧業(yè)生產(chǎn)帶來了嚴重威脅。掌握我國新發(fā)蟲媒病毒的分布、遺傳特征、感染宿主動物范圍與致病性等方面的信息，對我國蟲媒病毒病的防控具有重要的意義。

東南亞十二節(jié)段RNA病毒屬為2005年第8次國際病毒分類委員會(ICTV)新定義的1個病毒屬[7]，目前該屬包括了MSV、版納病毒(Banna virus, BAV)、卡皮羅病毒 (Kadipiro virus, KDV)與遼寧病毒 (Liaoning virus, LNV) 4 種病毒。1987年從我國云南省西雙版納市出現(xiàn)發(fā)熱與病毒性腦炎癥狀的患者中分離到BAV[8]，于1981年從印度尼西亞爪哇采集的褐首庫蚊Culex fuscocephalus中分離到KDV[9]，1990年在我國遼寧省采集的背斑伊蚊Aedes dorsalis中分離到LNV[10]。從牛、豬以及出現(xiàn)發(fā)熱癥狀的人體上分離到BAV[11-12]，提示東南亞十二節(jié)段RNA病毒可感染人和多種動物，對動物養(yǎng)殖和公共衛(wèi)生安全具有潛在威脅。

MSV病毒粒子為二十面體球形顆粒，直徑為60～70 nm，表面具有蛋白纖突[2]。病毒的基因組大小為 20622 bp，由 12 個基因節(jié)段 (Seg-1 至 Seg-12)的雙鏈 RNA(Double strand RNA, dsRNA)組成，各基因節(jié)段大小在 788 bp(Seg-12)至 3740 bp(Seg-1)之間，可編碼VP12(199個氨基酸殘基)至VP1(1215個氨基酸殘基)等12種蛋白[1]。目前對東南亞十二節(jié)段RNA病毒各基因節(jié)段編碼蛋白的功能尚不完全明確，初步認為Seg-4與Seg-9編碼的VP4與VP9蛋白構(gòu)成病毒的外層衣殼，Seg-2與Seg-7編碼的VP2與VP7蛋白構(gòu)成病毒的內(nèi)層衣殼，Seg-1與Seg-3編碼的VP1蛋白(RNA依賴RNA聚合酶)與VP3蛋白(鳥苷酸轉(zhuǎn)移酶)位于病毒的核心，Seg-6、Seg-8與Seg-12編碼3種非結(jié)構(gòu)蛋白，分別為VP6(三磷酸核苷酶)、VP8(蛋白激酶)與VP12(雙鏈RNA結(jié)合蛋白)[13-15]。

2019年，我們從云南省景洪市哨兵牛的血液中分離到了1株病毒(毒株號：V301/YNJH/2019)，基因組瓊脂糖凝膠電泳與電鏡觀察顯示，病毒具有東南亞十二節(jié)段RNA病毒屬的典型特征，通過測定Seg-2、Seg-4、Seg-7與Seg-9全長序列確認該病毒為MSV。對自然感染MSV哨兵牛血液中的病毒核酸與中和抗體回溯分析顯示，病毒在動物上呈“一過性感染”的特征，感染動物未出現(xiàn)明顯的臨床癥狀。研究結(jié)果豐富了對我國流行的東南亞十二節(jié)段RNA病毒的認知，為開展MSV的流行病學(xué)、致病性與診斷試劑的研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細胞與毒株

白紋伊蚊細胞(C6/36細胞)由云南省熱帶亞熱帶動物病毒病重點實驗室保存，細胞于27 ℃條件下以含10%(φ)胎牛血清的DMEM培養(yǎng)，藍舌病病毒 (Bluetongue virus, BTV)血清 4 型毒株(BTV-4/YTS4)[16]、動物流行性出血病病毒(Epizootic hemorrhagic disease virus, EHDV)血清10型毒株 (EHDV-10/V277)[17]、BAV毒株(BAV/SC043)均由云南省熱帶亞熱帶動物病毒病重點實驗室分離保存。

1.2 主要試劑

總RNA提取試劑RNAiso-Plus、核糖核酸酶S1、病毒DNA/RNA提取試劑盒、一步法RTPCR試劑盒、實時熒光定量qRT-PCR試劑盒、DNA膠回收純化試劑盒、高分辨率瓊脂糖等購自大連寶生物公司；Q5 超保真DNA聚合酶購自美國NEB公司；RNA純化試劑盒購自美國OMEGA公司；PLB平末端克隆載體與大腸埃希菌DH5α感受態(tài)細胞購自北京天根公司。

1.3 引物設(shè)計與合成

根據(jù)GenBank中公布的東南亞十二節(jié)段RNA病毒的序列，設(shè)計4對引物分別用于MSV、BAV、KDV與LNV基因節(jié)段Seg-12的一步法RTPCR擴增；根據(jù)MSV/DH13M041毒株的Seg-2、Seg-4、Seg-7與 Seg-9序列 (GenBank號：KR349188、KR349190、KR349194 與 KR349195)設(shè)計4對引物用于上述4個基因節(jié)段全長序列的擴增；根據(jù)MSV/DH13M041毒株的Seg-12序列(GenBank號：KR349197)設(shè)計PCR擴增引物與TaqMan探針，用于哨兵動物血液樣本中MSV病毒核酸的qRT-PCR檢測，探針的5′端標(biāo)記 FAM(6?羥基熒光素)熒光基團，3′端標(biāo)記黑洞淬滅基團(Black hole quencher, BHQ1)。引物序列如表 1 所示，由上海捷瑞公司合成。

1.4 哨兵動物的設(shè)立與血液樣本的采集

2019年5月，在云南省景洪市勐罕鎮(zhèn)(E100°59′53″，N21°54′58″，海拔 550 m)設(shè)置 3 頭年齡為1周歲，BTV與EHDV抗體檢測為陰性的云南黃牛作為蟲媒病毒監(jiān)測的哨兵動物。哨兵動物不使用任何疫苗與驅(qū)蟲藥物，采用放牧方式進行單獨飼養(yǎng)。5—10月，每周由當(dāng)?shù)芈殬I(yè)獸醫(yī)從哨兵牛上分別采集全血、肝素鈉抗凝血與EDTA抗凝血共3種血液樣品。將采集的血液樣品保存于4 ℃冰盒，送至云南省熱帶亞熱帶動物病毒病重點實驗室進行蟲媒病毒的檢測與分離。

1.5 病毒分離

取500 μL采集自哨兵動物的肝素鈉抗凝血，離心收集紅細胞 (Red blood cell, RBC)，以 PBS 緩沖液洗滌RBC 1次。加入滅菌水裂解RBC。取RBC裂解液接種生長成單層的C6/36細胞并盲傳3～5代。當(dāng)接種細胞出現(xiàn)規(guī)律的細胞病變(Cytopathic effect, CPE)，離心收集細胞上清，?80 ℃ 條件下凍存，留待進一步的鑒定。

1.6 病毒基因組dsRNA提取與瓊脂糖凝膠電泳

取病毒液接種細胞，待細胞出現(xiàn)完全CPE，離心收集細胞沉淀。以RNA提取試劑RNAiso-Plus提取細胞總RNA，參照文獻報道的方法[18]以核糖核酸酶S1降解宿主細胞單鏈RNA(Singlestrand RNA, ssRNA)，使用 RNA 純化試劑盒進行純化。取純化后的病毒核酸，以20 g/L的高分辨率瓊脂糖凝膠電泳，觀察病毒核酸在瓊脂糖凝膠上的電泳帶型。

1.7 病毒的電鏡觀察

將凍融處理后的病毒液以 8 000 r·min?1離心10 min，除去細胞碎片。使用 SW40轉(zhuǎn)頭，在Beckman 超速離心機上以 40 000 r·min?1離心 3 h。將離心后的沉淀以適量TNE Buffer重懸，置于4 ℃條件下過夜，12 000 r·min?1離心 5 min。取超離后的病毒液滴于銅網(wǎng)上，以20 g/L的磷鎢酸溶液(pH6.8)進行負染，在透射電鏡(日立HT7800, 日本)下觀察病毒粒子的形態(tài)。

1.8 RT-PCR擴增與克隆測序

取純化后的病毒dsRNA，94 ℃變性處理3 min，立即冰浴，進行dsRNA的解鏈。取變性核酸為模板，使用表1中針對MSV、BAV、KDV與LNV的Seg-12的鑒定引物進行分離病毒的一步法RT-PCR擴增鑒定。

表 1 本研究中使用的引物與探針序列Table 1 Primers and probe used in this study

采用全長 cDNA擴增技術(shù) (Full length cDNA application technique, FLAC)[19]，獲取病毒基因組全長cDNA。以合成的cDNA為模板，使用表1中的擴增引物，通過Q5高保真DNA聚合酶擴增分離毒株的Seg-2、Seg-4、Seg-7與Seg-9全長序列。電泳膠回收各個基因節(jié)段的PCR產(chǎn)物，將回收的DNA片段克隆入PLB平末端克隆載體中，轉(zhuǎn)化大腸埃希菌DH5α感受態(tài)細胞，挑取單菌落進行PCR鑒定與測序。

1.9 序列分析與系統(tǒng)發(fā)生樹的構(gòu)建

使用NCBI的ORF分析軟件(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)對獲取的 Seg-2、Seg-4、Seg-7與Seg-9基因節(jié)段編碼氨基酸序列進行翻譯。從GenBank上下載東南亞十二節(jié)段RNA病毒的序列，使用Mafft-win序列比對軟件[20]與本研究中獲取的病毒序列進行比對，使用BioEdit計算核酸與氨基序列相似度，使用MAGA X[21]以鄰接法(Neighbor-joining, NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹，使用遺傳距離法 (Genetic distance method)計算P-distance，自舉檢驗值 (Bootstrap)取 1 000。

1.10 病毒在動物上的感染特性分析

取哨兵牛上采集的EDTA抗凝血50 μL，使用磁珠法病毒RNA抽提試劑盒提取核酸，采用表1中MSV的qRT-PCR引物，分析感染動物血液中病毒核酸的動態(tài)變化。qRT-PCR反應(yīng)條件為：95 ℃30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，共 40 個循環(huán)，待檢血液中病毒的核酸含量以qRT-PCR反應(yīng)產(chǎn)生熒光信號的循環(huán)閾值數(shù) (Cycle threshold , Ct)表示。

將病毒液10倍梯度稀釋后接種C6/36細胞，以Karber法[22]測定分離病毒的半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量 (Median tissue culture infective dose，TCID50)；將感染動物的血清56 ℃滅活30 min，倍比稀釋備用。將病毒液稀釋為每50 μL含100個TCID50，取50 μL 稀釋的病毒液與倍比稀釋的血清作用 2 h，在96孔板上采用“固定病毒?稀釋血清”的方法測定稀釋血清對病毒的中和作用，通過Karber法[22]計算血清中和抗體效價，分析感染動物血清中和抗體的動態(tài)變化。

2 結(jié)果與分析

2.1 病毒的分離

2019年5—10月，3號哨兵牛共計采集肝素鈉血液、EDTA抗凝血和血清各24份。將采集的肝素鈉血液樣本接種細胞進行病毒的盲傳分離。8月7日采集的血液樣本在C6/36細胞上連續(xù)盲傳5代后，細胞出現(xiàn)規(guī)律的CPE，表現(xiàn)為接種后的細胞在96 h 出現(xiàn)聚集，120 h 后出現(xiàn)皺縮、脫落與裂解(圖1)。離心收集病變C6/36的細胞上清，將其命名為V301/YNJH/2019，進行下一步的鑒定。

圖 1 V301/YNJH/2019毒株接種C6/36細胞后引起的細胞病變Fig. 1 Cytopathic effect of C6/36 cells after inoculated with V301/YNJH/2019 strain

2.2 分離病毒的基因組電泳與電鏡觀察結(jié)果

提取并純化V301/YNJH/2019、BTV-4/YTS4、EHDV-10/V277與BAV/SC043毒株的核酸，進行高分辨率瓊脂糖凝膠電泳。結(jié)果顯示，V301/YNJH/2019毒株的基因組為dsRNA，其凝膠電泳帶型特征與作為對照的東南亞十二節(jié)段RNA病毒BAV/SC043毒株接近，而與環(huán)狀病毒屬病毒BTV-4/YTS4和EHDV-10/V277毒株相差較大(圖2A)。

通過超速離心進行病毒的富集，電鏡下觀察可見V301/YNJH/2019的病毒粒子直徑約60～70 nm，呈“指環(huán)狀”，病毒表面可見明顯的花瓣狀的突起，與文獻報道[2]的東南亞十二節(jié)段RNA病毒的病毒粒子特征接近(圖2B)。以上結(jié)果提示V301/YNJH/2019毒株可能為東南亞十二節(jié)段RNA病毒的1個成員。

圖 2 V301/YNJH/2019毒株的基因組瓊脂糖凝膠電泳(A)與電鏡觀察(B)Fig. 2 Agarose gel electrophoresis (A) and electron microscopic observation (B) of genomic dsRNA from V301/YNJH/2019 strain

2.3 病毒的RT-PCR鑒定

使用表 1中針對 M S V、B A V、K D V與LNVSeg-12的特異性引物，對V301/YNJH/2019毒株的核酸進行一步法RT-PCR擴增鑒定。結(jié)果顯示僅針對MSV的引物可擴增出符合預(yù)期大小約600 bp的DNA條帶(圖略)。BLAST比對分析顯示，擴增序列與MSV毒株(MSV/DH13M041)的Seg-12/VP12核酸與氨基酸序列相似度最高，分別為98.4%與99.0%，初步表明V301/YNJH/2019為MSV的1個成員。

2.4 分離病毒的基因節(jié)段擴增與測序

為明確V301/YNJH/2019的分類地位以及與其他東南亞十二節(jié)段RNA病毒之間的進化關(guān)系，對病毒的Seg-2、Seg-4、Seg-7與Seg-9共4個基因節(jié)段全長序列進行RT-PCR擴增，結(jié)果顯示可擴增出大小約為1～3 kb的DNA條帶(圖3)。將擴增的DNA片段進行克隆測序，顯示獲取病毒序列長度在1 076～3 055 bp之間 (表 2)。

圖 3 V301/YNJH/2019毒株4個基因節(jié)段全長序列的RTPCR擴增Fig. 3 RT-PCR amplification products for four full length segments of V301/YNJH/2019 strain

2.5 序列分析與系統(tǒng)發(fā)生樹構(gòu)建結(jié)果

將V301/YNJH/2019毒株的測序結(jié)果進行BLAST比對與編碼氨基酸預(yù)測分析，結(jié)果顯示我們成功獲取了V301/YNJH/2019毒株的Seg-2、Seg-4、Seg-7與Seg-9基因節(jié)段全長序列，4個基因節(jié)段分別編碼956、628、314與283個氨基酸殘基的VP2、VP4、VP7與VP9蛋白，VP4與VP7編碼MSV的外層衣殼蛋白，而VP2與VP9編碼該病毒的內(nèi)層衣殼蛋白[1]。獲取的各基因節(jié)段的5′UTR長度均短于 3′UTR，5′UTR 長度在 23 bp(Seg-4)～88 bp(Seg-2)之間，3′UTR 的長度在 99 bp(Seg-7)～201 bp(Seg-3)之間(表2)，與其他東南亞十二節(jié)段RNA病毒上觀察到的情況一致[8-11]。各基因節(jié)段5′UTR與3′UTR末端高度保守的序列特征為：5′-GUAAA GA……GAC-3′。

表 2 V301/YNJH/2019毒株4個基因節(jié)段以及編碼蛋白的序列特征Table 2 Characteristics of four gene segments and their encoded proteins of V301/YNJH/2019 strain

與其他東南亞十二節(jié)段RNA病毒的序列比對結(jié)果顯示，V301/YNJH/2019毒株與MSV/DH13M041毒株具有最近的親緣關(guān)系，Seg-2、Seg-4、Seg-7與Seg-9的核酸序列相似度在97.4%( Seg-9)～98.5%(Seg-2)之間，對應(yīng)的氨基酸序列相似度在96.4%(VP9)～98.4%(VP2)之間；與同屬的BAV、KDV和LNV的序列相似度均遠低于MSV(表2)。在構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)生樹上，V301/YNJH/2019毒株的 Seg-2、Seg-4、Seg-7與 Seg-9分別與MSV/DH13M041毒株對應(yīng)的基因節(jié)段聚為一簇(圖4)，獨立于BAV、KDV與LNV毒株。以上結(jié)果確證了我們從哨兵牛中分離出的病毒為MSV，提示MSV可能通過蚊科動物在動物之間進行傳播；MSV與BAV在系統(tǒng)發(fā)生樹上聚為一簇，提示2種病毒在進化上有著更近的親緣關(guān)系。

2.6 感染動物血液中病毒核酸的回溯分析結(jié)果

提取整個檢測期3號牛采集的24份EDTA抗凝血的核酸，進行V301/YNJH/2019病毒核酸的qRT-PCR檢測。在第11周采集的血液樣本中，可檢測到V301/YNJH/2019的病毒核酸(Ct=37.3)，表明病毒在該時間段內(nèi)感染了哨兵牛。感染動物血液中V301/YNJH/2019病毒核酸含量在監(jiān)測期的第13周處于最高水平(Ct=32.1)，在該周采集血液中，我們分離出了V301/YNJH/2019毒株。隨后病毒核酸含量逐步降低，監(jiān)測期的第18周血液中未檢測到病毒核酸(圖5)。以上結(jié)果提示MSV感染牛后，病毒血癥高峰期較短，僅維持1周時間，這為我們從感染MSV的動物上分離病毒提供了可參考的線索。

圖 4 基于鄰接法構(gòu)建V301/YNJH/2019毒株4個基因節(jié)段的系統(tǒng)發(fā)生樹Fig. 4 Phylogenetic trees of four segments of V301/YNJH/2019 using Neighbor-joining method

圖 5 自然感染V301/YNJH/2019毒株哨兵牛血液中病毒核酸與中和抗體監(jiān)測Fig. 5 Monitoring of viral nucleic acid and neutralization antibodies in the blood samples collected from sentinel cattle naturally infected with V301/YNJH/2019 strain

2.7 感染動物血清中和抗體的回溯分析結(jié)果

5—10月，3號哨兵牛共計采集血清24份。V301/YNJH/2019在C6/36細胞上的TCID50為5.43×106/mL。通過血清中和試驗測定感染牛血液中病毒特異性中和抗體產(chǎn)生情況。結(jié)果顯示在檢測到病毒核酸后的第2周，感染動物的血清中已可檢測到特異性的中和抗體，抗體滴度為1∶14。在病毒感染后的第5周，特異性中和抗體水平到達高峰，抗體滴度為1∶226；抗體滴度在最高點維持2周后，逐漸下降并維持在一個穩(wěn)定水平，在采血期結(jié)束，中和抗體水平仍維持在1∶57(圖5)。

3 討論與結(jié)論

東南亞十二節(jié)段RNA病毒在我國的南方與北方地區(qū)均有分布。BAV廣泛分布于我國的北京市、遼寧省、內(nèi)蒙古自治區(qū)、山東省、甘肅省、山西省、江蘇省、云南省與福建省[8, 11]；KDV于2009年在我國云南省采集的三帶喙庫蚊、中華按蚊Anopheles sinensis和騷擾阿蚊Armigeres subalbatus中首次分離[23]，在我國山東采集的白紋伊蚊Aedes albopictus中也分離出該病毒[24]；LNV除在我國遼寧省首次分離外，在我國新疆維吾爾族自治區(qū)、青海省也有從蚊子中病毒分離的報道[25]；MSV最近在我國的云南省與廣東省三帶喙庫蚊中分離發(fā)現(xiàn)[1-2]，MSV的感染宿主動物的范圍、感染特征、是否具有遺傳多樣性等問題仍有待研究。本研究首次報道了MSV在哨兵牛中的分離、鑒定與遺傳進化特征，在易感動物層面對病毒的感染特性進行了分析。以上研究結(jié)果豐富了我們對MSV的認知，為開展該病毒感染宿主范圍、致病性風(fēng)險分析與診斷技術(shù)的研究提供了基礎(chǔ)。

通過對分離毒株的電鏡與病毒基因組瓊脂糖凝膠電泳觀察，我們初步猜測分離病毒可能為東南亞十二節(jié)段RNA病毒，采用東南亞十二節(jié)段RNA病毒特異性RT-PCR擴增，基本確認V301/YNJH/2019毒株為MSV的1個成員。進一步需明確該毒株與其他東南亞十二節(jié)段RNA病毒之間的進化關(guān)系以及病毒的血清型(或基因型)等關(guān)鍵信息。東南亞十二節(jié)段RNA病毒的外層衣殼蛋白，具有高度變異的特性，可誘導(dǎo)特異性抗體的產(chǎn)生[1, 9, 24-25]；內(nèi)層衣殼蛋白在病毒粒子的組裝中發(fā)揮重要作用，其氨基酸序列在同種病毒中具有高度保守的特性，可作為鑒定病毒種屬間進化關(guān)系的主要依據(jù)[1, 9, 24-25]。因此我們考慮對分離毒株的Seg-2與Seg-7(編碼MSV的內(nèi)層衣殼蛋白VP2與VP7)，Seg-4與Seg-9(編碼MSV的外層衣殼蛋白VP4與VP9)進行全長測序，從而明確V301/YNJH/2019在病毒分類與進化關(guān)系上的位置。更為重要的是，我們希望知道我國流行的MSV是否存在其他的血清型或基因型，這是掌握病毒多樣性最為關(guān)鍵的信息之一。

序列分析顯示，V301/YNJH/2019毒株的Seg-2/VP2和Seg-7/VP7序列與云南省芒市分離的MSV/DH13M04毒株高度相似(核酸和氨基酸序列相似度分別高于97.7%和98.9%)；在Seg-2與Seg-7構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)生樹上，V301/YNJH/2019毒株與DH13M041毒株構(gòu)成了獨立于其他東南亞十二節(jié)段RNA病毒的進化分支，表明云南省芒市分離的DH13M041與景洪分離的V301/YNJH/2019毒株代表著MSV的2個不同毒株，二者具有最近共有祖先 (Most recent ancestors，MRA)。V301/YNJH/2019毒株的Seg-4/VP4和Seg-9/VP9與DH13M041毒株對應(yīng)序列之間也高度相似，在系統(tǒng)發(fā)生樹上聚為一簇，以上結(jié)果提示V301/YNJH/2019與DH13M041均屬于MSV的同一種血清型。環(huán)狀病毒屬Obivirus的藍舌病病毒(BTV)、動物流行性出血病病毒(EHDV)和非洲馬瘟病毒(ASHV)均具有眾多的血清型[6, 26-28]。東南亞十二節(jié)段RNA病毒屬與環(huán)狀病毒屬病毒有著最近的親緣關(guān)系，但為什么目前分離的BAV、KDV、LNV和MSV毒株中均只發(fā)現(xiàn)一種血清型？通過對東南亞十二節(jié)段RNA病毒屬與環(huán)狀病毒屬病毒在“病毒?媒介?感染動物”上的比較，將有助于我們理解蟲媒病毒血清型多樣性產(chǎn)生的原因。

目前僅在三帶喙庫蚊中分離到MSV，該病毒感染動物宿主范圍與感染特性尚不清楚。在哨兵牛上分離出MSV毒株，為我們通過回溯追蹤分析病毒在動物上的感染特性提供了可能性。對感染MSV哨兵牛血液中病毒核酸的qRT-PCR監(jiān)測結(jié)果顯示，MSV在感染動物后的第3周出現(xiàn)病毒血癥高峰期，我們也在該時間點從血液樣本中成功分離到病毒，隨后病毒核酸含量逐步降低，5周后血液中未檢測到病毒核酸，我們試圖使用其他核酸檢測為陽性的血液接種細胞再次分離MSV，但病毒分離均不成功，我們認為很可能隨著感染動物體內(nèi)中和抗體的產(chǎn)生，病毒雖然在血液中存在，但由于中和抗體與病毒粒子的結(jié)合，導(dǎo)致病毒的感染性大幅下降，使病毒的分離困難。對MSV中和抗體的監(jiān)測結(jié)果顯示，哨兵牛在病毒感染第3周已經(jīng)產(chǎn)生中和抗體，且在隨后的2周達到高峰，至監(jiān)測期結(jié)束，血液中的中和抗體效價仍維持在1∶57的水平，表明MSV感染動物后可很快激發(fā)動物的免疫應(yīng)答，產(chǎn)生病毒特異性中和抗體，可保護動物在較長時間免受MSV的再次感染。

目前在GenBank中僅有1個MSV毒株的全基因組序列(DH13M041毒株)，在進一步的工作中，我們將完成V301/YNJH/2019毒株的全基因組測序，完善MSV的qRT-PCR與RT-PCR檢測方法。我們對本研究中另外2頭哨兵牛血液與血清樣本進行了MSV核酸與抗體的檢測，但檢測結(jié)果均為陰性，對MSV在云南省的牛和其他家畜中的流行情況以及其他媒介昆蟲是否攜帶MSV尚不明確，進一步開展家畜與媒介中MSV的流行病學(xué)調(diào)查研究，分析病毒感染動物范圍與潛在致病性十分必要，這些研究工作將獲取對MSV更為全面的認知。