攜帶MYH7或MYBPC3基因突變的肥厚型心肌病患者心肌組織比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究

王慶堯 祁琳 陸敏杰 張禪那 王繼征 趙鵬

(1 青島大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，山東 青島 266071； 2 青島大學(xué)附屬醫(yī)院病理科； 3 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院阜外醫(yī)院心血管疾病國家重點實驗室)

肥厚型心肌病(HCM)是一種常見的遺傳性心血管疾病,在我國患病率約為80/10萬[1]。HCM患者臨床表現(xiàn)異質(zhì)性較大，可表現(xiàn)為無明顯癥狀、胸痛、心悸、暈厥和心源性猝死等[2]。目前認(rèn)為，HCM是導(dǎo)致青年人或者運動員發(fā)生心源性猝死的首要原因[2]?，F(xiàn)已經(jīng)報道近30種基因與該疾病的發(fā)病相關(guān)[3],其中主要的兩個致病基因為β-肌球蛋白重鏈 (MYH7)基因以及肌球蛋白結(jié)合蛋白 (MYBPC3) 基因,目前在HCM陽性突變患者中的檢出率約為80%[4]。MYH7基因編碼的蛋白在心肌細(xì)胞舒張和收縮過程中發(fā)揮著重要作用[5]；MYBPC3基因編碼的蛋白在維持心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能中扮演重要角色[6]。臨床研究表明，MYH7基因突變的HCM患者比MYBPC3基因突變的HCM患者左心室流出道梗阻的發(fā)生率較高，發(fā)病年齡也較早[7]。另有研究表明MYH7基因突變的HCM患者臨床表型更重，預(yù)后較差[8]。兩種基因突變所致的HCM患者臨床表型存在較大差異，但具體的分子機制尚不明確。本研究通過檢測MYH7基因突變的HCM患者和MYBPC3基因突變的HCM患者心肌組織中蛋白表達(dá)譜的差異，探討兩種基因突變所致HCM患者臨床表型差異的可能原因。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2012年6月—2018年5月于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院阜外醫(yī)院行改良擴大Morrow術(shù)治療的HCM患者。診斷標(biāo)準(zhǔn)為超聲心動圖顯示左室壁或室間隔的最大厚度≥15 mm；排除標(biāo)準(zhǔn)為心肌繼發(fā)性肥厚(如由主動脈狹窄、高血壓等引起)、HCM擬表型或明顯伴隨其他疾病的患者[9]。HCM患者入院時采集外周血進(jìn)行基因檢測，根據(jù)攜帶致病突變基因的不同，分為MYH7組(僅攜帶MYH7基因突變的患者)33例和MYBPC3組(僅攜帶MYBPC3基因突變患者)30例。收集所有HCM患者手術(shù)過程中切除的心肌組織。本研究通過了中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院阜外醫(yī)院倫理委員會審查，所有患者均簽署知情同意書。

1.2 定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析

將所有HCM患者的心肌組織分別在液氮中研磨成粉末，加入組織裂解緩沖液裂解，然后使用超聲波進(jìn)行充分裂解，離心后使用BCA試劑盒對蛋白濃度進(jìn)行測定。吸取上述分離到的蛋白20 μg進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，并進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色。然后對提取出的蛋白質(zhì)溶液進(jìn)行肽段酶解，再應(yīng)用Strata X C18(Phenomenex)進(jìn)行脫鹽處理，真空干燥。加入0.5 mmol/L TEAB溶解肽段，加入乙腈溶解的TMT標(biāo)記試劑室溫孵育2 h。將標(biāo)記后的肽段在高pH條件下進(jìn)行反向HPLC分級，選用Agilent 300Extend C18色譜柱，而后將肽段合并為18個組分，并對每一個組分分別進(jìn)行真空冷凍干燥處理后，溶解于體積分?jǐn)?shù)0.001的甲酸水溶液中，于超高效液相系統(tǒng)EASY-nLC 1000中分離肽段。分離后的肽段注入NSI離子源中電離后，使用Q ExactiveTMPlus質(zhì)譜進(jìn)行分析。將上面得到的二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)使用Maxquant (v1.5.2.8)在SwissProt人類數(shù)據(jù)庫(20 317條序列)中進(jìn)行檢索。實驗重復(fù)3次，取每種蛋白表達(dá)水平的平均值。

1.3 心肌組織中差異表達(dá)蛋白的篩選

將MYBPC3組與MYH7組患者心肌組織中蛋白表達(dá)水平的比值作為兩組之間蛋白的差異表達(dá)量，取log2使數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，采用雙樣本雙尾t檢驗方法推算P值。以P<0.05且差異表達(dá)量>1.2作為顯著上調(diào)的閾值，以P<0.05且差異表達(dá)量<0.83作為顯著下調(diào)的閾值。

1.4 心肌組織中差異表達(dá)蛋白的生物信息學(xué)分析

分別使用基因本體論(GO)數(shù)據(jù)庫和KEGG數(shù)據(jù)庫對差異表達(dá)蛋白進(jìn)行GO富集分析和KEGG通路富集分析。再利用STRING數(shù)據(jù)庫(version 11.0)對差異表達(dá)蛋白進(jìn)行蛋白相互作用分析。

2 結(jié) 果

2.1 兩組患者心肌組織中蛋白質(zhì)的鑒定與差異表達(dá)情況

將所有患者心肌組織蛋白質(zhì)裂解提取后，經(jīng)電泳和考馬斯亮藍(lán)染色后顯示，蛋白條帶清晰、無降解，相對分子質(zhì)量為10 000～200 000。所有患者的心肌組織中共鑒定到3 723種蛋白，兩組患者心肌組織中顯著差異表達(dá)的蛋白共有39種(圖1)，與MYH7組相比較，MYBPC3組患者心肌組織中15種蛋白表達(dá)上調(diào)，24種蛋白表達(dá)下調(diào)。表達(dá)上調(diào)的15種蛋白分別為驅(qū)動蛋白家族成員3B(KIF3B)、ATP合酶F(0)復(fù)合體C1亞基(ATP5G1)、內(nèi)黏蛋白(EMCN)、多剪接RNA結(jié)合蛋白2(RBPMS2)、蛋白激酶Cδ亞型(PRKCD)、Ⅺ型膠原α1鏈(COL11A1)、EMILIN-1、LRRFIP2蛋白、軟骨中間層蛋白1(CILP)、不活躍磷脂磷酸酶7(PLPP7)、輔酶Q10B(COQ10B)、EMILIN-3、蛋白酶體組裝伴侶2(PSMG2)、蛋白酶體抑制劑PI31亞基(PSMF1)及琥珀酸脫氫酶復(fù)合體組裝因子2(SDHAF2)。表達(dá)下調(diào)的24種蛋白分別為三聯(lián)組氨酸核苷酸結(jié)合蛋白2(HINT2)、免疫球蛋白λ變體2-8(IGLV2-8)、ATP合酶亞基S(ATP5S)、Rap1 GTPase激活蛋白2(RAP1GAP2)、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2 (ACE2)、小核核糖核蛋白多肽N(SNRPN)、二氫嘧啶樣蛋白3(DPYSL3)、蛋白質(zhì)透明同源物1 (DIAPH1)、AGFG1蛋白(AGFG1)、組蛋白PARylation因子1(HPF1)、核糖體蛋白L34(RPL34)、EH結(jié)構(gòu)域結(jié)合蛋白1樣蛋白1(EHBP1L1)、CCR4-NOT轉(zhuǎn)錄復(fù)合體亞基1(CNOT1)、真核生物翻譯起始因子2亞基2(EIF2S2)、破骨細(xì)胞刺激因子1(OSTF1)、細(xì)胞周期控制蛋白A(TMEM30A)、免疫球蛋白重鏈變體5-51(IGHV5-51)、前膠原-賴氨酸，2-酮戊二酸5-雙加氧酶1(PLOD1)、補體C9、免疫球蛋白δ重鏈、囊泡相關(guān)膜蛋白5(VAMP5)、清道夫受體家族F類成員1(SCARF1)、核糖體蛋白L29(RPL29)、內(nèi)聚蛋白亞基SA-2(STAG2)。

圖1 與MYH7組相比MYBPC3組中蛋白表達(dá)水平分布火山圖

2.2 兩組患者心肌組織中差異表達(dá)蛋白的GO富集分析結(jié)果

對兩組患者的所有39種差異表達(dá)蛋白質(zhì)進(jìn)行GO富集分析，結(jié)果顯示差異表達(dá)蛋白的分子功能方面主要富集在Rho GTPase綁定、細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)成分和SH3結(jié)構(gòu)域綁定方面；細(xì)胞成分方面主要富集在質(zhì)子運輸ATP合酶復(fù)合物、蛋白質(zhì)的細(xì)胞外基質(zhì)和膠原蛋白三聚物上；生物學(xué)過程主要富集在膜脂分布的調(diào)節(jié)、B細(xì)胞介導(dǎo)免疫和肌細(xì)胞分化的負(fù)調(diào)控等方面。

2.3 兩組患者心肌組織中差異表達(dá)蛋白的KEGG通路富集分析結(jié)果

KEGG通路富集分析結(jié)果顯示，39種差異表達(dá)蛋白主要富集于蛋白質(zhì)體內(nèi)消化吸收通路和糖尿病并發(fā)癥AGE-RAGE信號通路2條通路中。其中在蛋白質(zhì)消化吸收通路當(dāng)中，COL11A1表達(dá)量上調(diào)， ACE2表達(dá)量下調(diào)；在糖尿病并發(fā)癥AGE-RAGE信號通路中，DIAPH1表達(dá)量下調(diào)，PRKCD表達(dá)量上調(diào)。將表達(dá)量上調(diào)以及下調(diào)的蛋白分別導(dǎo)入KEGG數(shù)據(jù)庫進(jìn)行通路富集分析，結(jié)果顯示未能富集到任何通路。

2.4 兩組患者心肌組織中差異表達(dá)蛋白的相互作用分析結(jié)果

STRING分析結(jié)果顯示，39種差異表達(dá)蛋白中有28種蛋白與其他蛋白之間無相互作用關(guān)系，其余11種蛋白分別在4種功能網(wǎng)絡(luò)中表現(xiàn)有相互作用關(guān)系(圖2)。圖中圓圈代表差異表達(dá)蛋白，圓圈之間的線條表示蛋白之間的路徑映射，可見蛋白之間路徑映射數(shù)量較少。

圖2 兩組中差異表達(dá)蛋白相互作用分析圖

3 討 論

蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)可以綜合分析蛋白質(zhì)各個方面的生物學(xué)特性，包括明確蛋白質(zhì)的功能和蛋白質(zhì)之間的相互作用關(guān)系，確定蛋白質(zhì)在細(xì)胞中的定位以及翻譯后修飾水平[10]。與基因組學(xué)“靜態(tài)分析”的特點相比,蛋白質(zhì)組學(xué)的研究對象為數(shù)量巨大且呈動態(tài)變化的蛋白質(zhì)表達(dá)譜，可以分析復(fù)雜的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)以及可以更加系統(tǒng)地挖掘疾病的復(fù)雜致病機制[11-12]。目前，蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)已經(jīng)在多種疾病的研究中得到廣泛應(yīng)用[13-15]。

SCHULDT等[16]對HCM患者的心肌組織進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HCM患者心肌組織中總α-微管蛋白和去酪化微管蛋白水平明顯高于正常健康心肌組織，提示微管的變性參與了HCM的發(fā)病機制。COATS等[9]也通過蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)鑒定出151種正常組與HCM組的心肌組織差異表達(dá)的蛋白，這些差異表達(dá)蛋白主要參與了肌肉收縮、鈣調(diào)節(jié)和氧化應(yīng)激等過程。雖然蛋白質(zhì)組學(xué)研究為探究HCM致病機制提供了科學(xué)證據(jù)，但是攜帶不同致病基因突變的HCM患者心肌組織蛋白質(zhì)表達(dá)譜是否存在差異尚缺乏科學(xué)數(shù)據(jù)。

本研究首先提取MYH7和MYBPC3基因突變HCM患者心肌組織的總蛋白，經(jīng)電泳和考馬斯亮藍(lán)染色后顯示，蛋白條帶清晰、無降解，條帶分布范圍廣，說明提取到的蛋白符合后續(xù)蛋白質(zhì)組學(xué)分析的實驗要求。對總蛋白進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析后，共鑒定出3 723種蛋白，再從中篩選出差異表達(dá)的蛋白39種，約占所有定量蛋白數(shù)量的1%，說明兩種不同基因突變的HCM患者心肌組織中差異表達(dá)蛋白數(shù)量較少。39種中有15種差異蛋白表達(dá)上調(diào)，其中KIF3B上調(diào)的倍數(shù)最高，該蛋白在有絲分裂過程中負(fù)責(zé)囊泡運輸和膜擴張，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞的遷移[17]；EMCN與EMILIN-1在促進(jìn)腫瘤新生血管的生長和穩(wěn)定中發(fā)揮重要作用[18-19]；RBPMS2參與心臟發(fā)育過程，還能起到調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞分化的功能[20]；EMILIN-3蛋白參與成骨細(xì)胞的增殖與遷移[21]；PRKCD是調(diào)控細(xì)胞增殖以及凋亡的蛋白激酶[22]；LRRFIP2蛋白主要地參與調(diào)控炎癥反應(yīng)；PSMF1參與構(gòu)成蛋白酶體抑制物，能夠發(fā)揮抑制多肽降解的作用[23]。但是，通過對所有表達(dá)量上調(diào)和下調(diào)的蛋白分別進(jìn)行KEGG通路富集分析，結(jié)果顯示均未能富集到任何通路，提示這些蛋白功能各不相同，蛋白之間可能無明確相互作用關(guān)系。STAG2是表達(dá)量下調(diào)倍數(shù)最高的蛋白，其主要參與構(gòu)成內(nèi)聚蛋白復(fù)合物，是DNA復(fù)制后染色單體內(nèi)聚所必需的復(fù)合物，同時參與有絲分裂期間紡錘體的組裝；RPL29可以調(diào)控新生血管的形成。STRING分析結(jié)果顯示差異表達(dá)蛋白之間路徑映射數(shù)量少，提示MYH7組與MYBPC3組之間差異表達(dá)蛋白相互作用關(guān)系較弱。

在差異表達(dá)蛋白相互作用分析圖中， ATP5G1和COL11A1與其他蛋白之間的路徑映射數(shù)量相對較多。ATP5G1是構(gòu)成ATP合酶的重要組成部分，在線粒體能量產(chǎn)生過程中發(fā)揮重要作用。當(dāng)心肌發(fā)生缺血再灌注損傷時，ATP5G1表達(dá)量升高，導(dǎo)致ATP合酶功能紊亂，使得心肌細(xì)胞出現(xiàn)能量代謝異常，進(jìn)而影響心肌細(xì)胞正常功能。本研究的結(jié)果顯示ATP5G1蛋白表達(dá)量上調(diào)，提示ATP5G1表達(dá)量的變化可能與兩組HCM患者臨床表型差異有關(guān)。COL11A1在腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移以及侵襲過程中扮演重要角色，且有研究表明COL11A1蛋白表達(dá)量升高往往導(dǎo)致預(yù)后不佳[24]。本研究結(jié)果顯示，與MYH7組相比MYBPC3組中COL11A1蛋白表達(dá)量上調(diào)，提示COL11A1可能與兩組HCM患者預(yù)后有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，不同致病基因突變的HCM患者心肌組織中肌節(jié)蛋白表達(dá)水平一致，表明基因型不同的HCM患者肌節(jié)蛋白的表達(dá)譜是一致的[25]。本研究顯示，兩組HCM患者心肌組織差異表達(dá)蛋白數(shù)量較少，而且差異表達(dá)蛋白之間缺乏明確相互作用關(guān)系，提示兩組HCM患者心肌組織蛋白表達(dá)譜差異較小。

綜上所述，攜帶MYH7或MYBPC3基因突變的HCM患者間表達(dá)水平發(fā)生顯著改變的蛋白數(shù)量較少，蛋白質(zhì)表達(dá)譜差異較??；其中ATP5G1和COL11A1蛋白可能與兩者不同臨床表型有關(guān)。