巖藻多糖對(duì)幽門螺桿菌感染后小鼠腸道菌群紊亂的調(diào)節(jié)作用

張雪琳 蔣晨 徐珊 田字彬

(青島大學(xué)附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，山東 青島 266003)

幽門螺桿菌(HP)是一種革蘭陰性、螺旋狀、鞭毛狀細(xì)菌，屬于變形桿菌門，在嚴(yán)酷的胃酸環(huán)境中具有很強(qiáng)的生存能力[1]。HP感染是全世界人群中比較常見的感染之一，發(fā)展中國(guó)家的患病率為70%～90%，發(fā)達(dá)國(guó)家患病率為25%～50%[2-3]。既往研究集中于HP致消化性潰瘍、胃腺癌或黏膜相關(guān)淋巴組織淋巴瘤(MALT)的臨床表現(xiàn)和相關(guān)機(jī)制的研究。近年來，HP感染與腸道菌群紊亂的相關(guān)性逐漸被關(guān)注，如實(shí)驗(yàn)表明HP豐度與腸道共存微生物多樣性呈負(fù)相關(guān)[4-6]，并且HP感染可以導(dǎo)致諸如變形桿菌等細(xì)菌的異常增加[7]?，F(xiàn)有證據(jù)提示，在HP定植期間，除HP具有直接致病性外，其對(duì)于腸道微生物網(wǎng)絡(luò)穩(wěn)態(tài)的破壞也可能影響疾病的發(fā)生發(fā)展。

近年來，褐藻因其抗黏附、抗氧化、抗毒性、免疫調(diào)節(jié)、抗凝、抗感染等多種生物功能而被廣泛研究。巖藻多糖是從海洋食用褐藻中提取的一種復(fù)合硫酸多糖，由巖藻糖和硫酸鹽與少量的半乳糖、甘露糖、木糖以及糖醛酸等形成的聚合物[8-9]，已經(jīng)證實(shí)巖藻多糖具有抗炎作用[10]，可刺激菌群產(chǎn)生含有促進(jìn)健康成分的短鏈脂肪酸(SCFAs)，以增強(qiáng)腸道屏障的完整性[11]。巖藻多糖干預(yù)可增加腸道糞球菌、利肯菌和丁酸球菌的豐度，提高厚壁菌門/擬桿菌門的豐度比例，防止致病菌入侵腸道黏膜[12]。但巖藻多糖作為一種功能性食品，是否也具有改善HP感染后紊亂的腸道菌群結(jié)構(gòu)的作用，目前還沒有明確的研究報(bào)道。本研究通過基因組測(cè)序分析，探討巖藻多糖是否通過調(diào)控腸道菌群并參與HP感染的治療，為從分子水平揭示巖藻多糖調(diào)節(jié)腸道菌群的機(jī)制提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

清潔級(jí)C57BL/6小鼠22只，8周齡，體質(zhì)量18～22 g，購(gòu)自濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司[許可證號(hào)：SCXK(魯)2019 0003]。飼養(yǎng)條件為標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)條件[SPF級(jí)，溫度(22±2)℃，濕度(50±5)%，12-12 h晝夜周期,完全營(yíng)養(yǎng)顆粒飼料飼養(yǎng)]。分析純級(jí)別巖藻多糖來自于青島明月海藻集團(tuán)有限公司國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。HP PMSS1標(biāo)準(zhǔn)菌株來自于青島市市立醫(yī)院。本研究獲得青島大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

22只小鼠按干預(yù)方式不同隨機(jī)分為5組：空白對(duì)照組(A組)4只小鼠每天灌胃3 mL雙蒸水，持續(xù)5周；單純感染組(B組)每天先灌胃1×1014CFU/L的HP菌懸液3 mL，持續(xù)3周，然后再每天灌胃3 mL雙蒸水，持續(xù)2周；單純干預(yù)組(C組)每天灌胃40 g/L的巖藻多糖3 mL，持續(xù)2周，后3周每天灌胃3 mL的雙蒸水；預(yù)防干預(yù)組(D組)每天灌胃40 g/L的巖藻多糖3 mL，持續(xù)2周，后3周每天灌胃濃度1×1014CFU/L的HP菌懸液3 mL；治療干預(yù)組(E組)每天灌胃濃度1×1014CFU/L的HP菌懸液3 mL，持續(xù)3周，后2周每天灌胃40 g/L的巖藻多糖3 mL。采集實(shí)驗(yàn)結(jié)束當(dāng)天的小鼠糞便樣品。

小鼠的糞便樣品進(jìn)行16S rDNA菌群測(cè)序 (由北京百邁克生物科技有限公司完成，https：//international.biocloud.net/zh/project/detail/324153/)，使用 Illumina HiSeq 測(cè)序平臺(tái)完成操作分類單位(OTU)聚類與注釋，每個(gè)OTU代表一個(gè)菌種，通過OTU-Venn分析，獲得腸道菌群的微生物多樣性和不同微生物的豐度；利用QIIME軟件生成不同分類水平的物種豐度表，再利用R語言工具繪制成樣品各分類學(xué)水平的物種分布柱狀圖；使用Mothur(version v.1.30)軟件進(jìn)行α多樣性分析，獲得衡量腸道菌群豐度的指標(biāo)Chao1和衡量物種多樣性的指標(biāo)Shannon指數(shù)；使用QIIME軟件，通過非度量多維標(biāo)定法(NMDS)對(duì)各組小鼠的腸道菌群進(jìn)行β多樣性分析；通過LEfSe技術(shù)分析計(jì)算各組小鼠腸道菌群中各菌類的LDA值，并繪制菌類分布柱狀圖，比較各組間腸道菌群菌類構(gòu)成是否有差異；再利用Metastats分析各組小鼠的腸道菌群相對(duì)豐度并進(jìn)行t檢驗(yàn)，獲得各組間差異較大的生物標(biāo)志菌屬。

2 結(jié) 果

2.1 腸道菌群OTU數(shù)量和物種分布

菌群測(cè)序和OTU聚類與注釋分析結(jié)果顯示，所有小鼠的糞便樣本中共有腸道菌群OTU為604個(gè)，其中A組小鼠的腸道菌群的OTU為395個(gè)，B組為341個(gè)，C組為454個(gè)，D組為401個(gè)，E組為344個(gè)，同時(shí)每組小鼠腸道菌群中均含有的OTU為258個(gè)。

利用QIIME軟件和R語言工具繪制成各組樣品門屬分類水平的物種分布柱狀圖(圖1)。圖中顯示，所有小鼠腸道菌群的優(yōu)勢(shì)菌門主要為厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、變形菌門(Proteobacteria)、Epsilonbacteraeota、Patescibacteria、放線菌門(Actinobacteria)、脫鐵桿菌門(Deferribacteres)、柔膜菌門(Tenericutes)、酸桿菌門(Acidobacteria)和綠彎菌門(Chloroflexi)等(圖1a)；優(yōu)勢(shì)菌屬主要有杜氏桿菌屬(Dubosiella)、Muribaculaceae、乳桿菌屬(Lactobacillus)、脫硫弧菌屬(Desulfovibrio)、毛螺菌科NK4A136菌(LachnospiraceaeNK4A136group)、金黃桿菌屬(Chryseobacterium)、螺桿菌屬(Helicobacter)、疣微菌科(Ruminococcaceae)、Ileibacterium和乳球菌屬(Lactococcus)等(圖1b)。

a：門水平腸道菌群分布柱狀圖，b：屬水平腸道菌群分布柱狀圖，A～E分別為A～E組圖1 各組小鼠門、屬水平的腸道菌群分布柱狀圖

2.2 各組小鼠腸道菌群的α多樣性分析

A～E組的小鼠腸道菌群的Chao1指數(shù)分別為334.715±28.530、249.306±42.753，369.473±89.737，281.579±78.247，268.863±23.176，組間比較差異有顯著性(F=3.045,P<0.05)，其中A組與B、E組比較、C組與B、E組比較，Chao1指數(shù)值均顯著增高(t=-2.634～3.833，P<0.05)。各組小鼠腸道菌群的Shannon指數(shù)分別為3.503±0.415，2.825±0.482，2.744±0.933，3.025±0.722，3.368±0.112，各組之間比較均無顯著差異(F=1.435,P>0.05)。

2.3 各組小鼠腸道菌群β多樣性分析結(jié)果

β多樣性分析結(jié)果顯示，各組小鼠腸道菌群菌屬構(gòu)成存在顯著差異(P<0.01)，且結(jié)果的可靠程度高(Stress<0.2)，其中A組和E組的差別最小，B、C、D組與A組比較差異有顯著性(P<0.01)。見圖2。圖中不同顏色小圓點(diǎn)分別代表A～E組，點(diǎn)與點(diǎn)之間的距離表示各組小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)之間的相似度，距離越近相似度越高。

圖2 各組小鼠腸道菌群的β多樣性分析結(jié)果

2.4 各組小鼠腸道菌群的LEfSe分析結(jié)果

對(duì)各組小鼠腸道菌群中相對(duì)豐度較高的菌類LDA值進(jìn)行比較，同樣顯示各組小鼠腸道菌群菌類構(gòu)成存在顯著差異(LDA值>2)。LEfSe分析結(jié)果顯示,A～E組小鼠腸道菌群中具有顯著性差異的菌類共有67種(LDA值>2)，其中A組中的腸桿菌科(Enterobacteriaceae)、理研菌屬(Rikenella)、Negativibacillu屬、Butyricicoccus、Ruminiclostri-dium、Negativibacillus、螺旋桿菌、Parabacteroi-des屬、Alloprevotella屬、乳桿菌屬(Lactobacillus)、乳桿菌科(lactobacteriaceae)等19種菌類相對(duì)豐度較高；B組中的梭菌屬(Clostridium)、金黃桿菌屬(Chryseobacterium)、Flavobacteriales、Weeksel-laceae科等7種菌的相對(duì)豐度也較高；C組中紅蝽菌科(Coriobacteriaceae)、Atopobiaceae、產(chǎn)糞甾醇真細(xì)菌(Eubacteriumcoprostanoligenes)、Marvinbryantia屬、腸桿菌屬(Enterorhabdus)、伊格爾茲氏菌(Eggerthellaceae)等16種菌類相對(duì)豐度較高；D組中芽孢桿菌科(Bacillus)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、Erysipelotrichaceae科、Faecalibaculum屬、CandidatusStoquefichus、斷鏈真桿菌屬(Eubacteriumfissicatena)等14種菌類相對(duì)豐度較高；E組中梭菌目(Clostridiales)、梭菌屬(Clostridia)、瘤胃菌科(Ruminococcaceae)、Parasutterella屬、伯克氏菌科(Burkholderiaceae)、伯克氏菌目(Burkholderiales)、β變形菌綱(Betaproteobacteria)、γ變形菌綱(Gammaproteobacteria)、lachnoclostridium屬等11種菌類LDA值較高。

2.5 各組小鼠腸道菌群的Metastats分析結(jié)果

根據(jù)Metastats分析獲得各組小鼠的腸道菌群相對(duì)豐度，進(jìn)行t檢驗(yàn)后各組小鼠腸道菌群間差異較大的生物標(biāo)志菌屬有Bifidobacterium、Faecalibaculum、Desulfovibrio、Alistipe和Chryseobacterium。其中A組與C組、C組與D組進(jìn)行比較，Bifidobacterium的相對(duì)豐度顯著增高(P<0.05)；C組與A、B、E組比較，F(xiàn)aecalibaculum的相對(duì)豐度顯著增高(P<0.05)；A組與C組及B組與C、D、E組比較，脫硫弧菌(Desulfovibrio)的相對(duì)豐度顯著增高(P<0.05)；A組與C、D組比較，澤瀉屬(Alistipe)的相對(duì)豐度顯著增高(P<0.05)；A、C組與E組比較，Chryseobacterium的相對(duì)豐度顯著增高(P<0.05)。見表1。

表1 各組小鼠腸道菌群中差異較大的微生物菌屬相對(duì)豐度比較

3 討 論

微生態(tài)調(diào)節(jié)在HP感染治療中的作用愈發(fā)受到重視。隨著抗HP藥物治療的普及，HP耐藥率也逐年增高[13-14]，因此，亟需一種經(jīng)濟(jì)、有效、安全且基于非抗生素的治療方法，目前專家學(xué)者多采用益生菌作為抗生素治療的輔助添加劑[15]。研究表明，一些益生菌可以顯著降低HP感染及藥物治療不良反應(yīng)的發(fā)生率，還有一些益生菌能夠有效提高HP的根除率。L.gasseri是一種在抗耐克拉霉素HP感染中發(fā)揮重要作用的益生菌[16]，LactobacillusacidophilusDDS-1J在體外對(duì)HP具有生長(zhǎng)抑制的作用[17]。研究發(fā)現(xiàn)輔助使用Lactobacillusspecies等益生菌，HP的根除率可能會(huì)升高[18-22]。S.boulardii作為根除HP的輔助劑，效果顯著[23-24]。

益生元是不可消化的食物成分，可以從水果、蔬菜、谷物和其他可食用植物中獲得。它們?cè)谕ㄟ^上消化道時(shí)不會(huì)被代謝或吸收，而是由結(jié)腸中的細(xì)菌發(fā)酵，以增強(qiáng)有益菌(如雙歧桿菌和乳酸桿菌)的生長(zhǎng)和活性[25-27]。過往的研究顯示，一些輔助添加劑可作為益生元調(diào)控益生菌在腸道中的相對(duì)豐度，添加魔芋低聚糖可顯著增加腸道雙歧桿菌的豐度[28]。攝入黃烷醇可以增加有益的腸道細(xì)菌，如乳酸桿菌(Lactobacillus)和雙歧桿菌(Bifidobacterium)，而降低致病性細(xì)菌如產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridiumperfringens)的豐度[29]。食物成分如多酚會(huì)提高益生菌如Bifidobacteriaceae等菌的相對(duì)豐度,而降低致病性細(xì)菌如大腸桿菌(E.coli)、梭狀芽孢桿菌(Clostridiumperfringens)和HP的相對(duì)豐度[30]。

盡管如此，鮮有揭示益生元對(duì)HP感染后腸道菌群紊亂調(diào)節(jié)作用的研究。為研究益生元如巖藻多糖對(duì)HP感染后腸道菌群紊亂的調(diào)節(jié)作用，本研究選用C57BL/6品系小鼠感染HP，研究巖藻多糖不同干預(yù)方式對(duì)小鼠腸道菌群數(shù)量及構(gòu)成的影響。本研究采用α多樣性分析反映樣品中的物種豐度及物種多樣性，α多樣性中的Chao1指數(shù)衡量物種豐度即物種數(shù)量的多少,Shannon指數(shù)用于衡量物種多樣性；同時(shí)以物種分布柱狀圖體現(xiàn)樣品中門屬水平的物種種類和豐度組成；通過LEfSe分析比較各組間Biomarker的LDA值是否具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；最后通過Metastats軟件分析篩選出各組樣品中有差異的物種。本研究中α多樣性分析結(jié)果顯示B組樣品的生物多樣性顯著低于A組，提示HP感染降低了腸道菌群的生物多樣性，而D組和E組生物多樣性均出現(xiàn)不同程度的恢復(fù)，物種豐度均顯著高于B組，說明HP感染前后應(yīng)用巖藻多糖干預(yù)均能增加腸道生物多樣性，可調(diào)整腸道菌群紊亂狀況，而HP感染前預(yù)防性巖藻多糖干預(yù)對(duì)腸道生物多樣性保護(hù)作用更明顯。本研究Metastats分析結(jié)果提示，C組相對(duì)于A、B、E組，SCFAs糞便桿菌Faecalibacterium的相對(duì)豐度增高，說明巖藻多糖的干預(yù)會(huì)增加有益細(xì)菌如Faecalibacterium的相對(duì)豐度；C組相對(duì)于A、B組，D、E組相對(duì)于B組，Desulfovibrio相對(duì)豐度降低，說明巖藻多糖的干預(yù)會(huì)減少小鼠腸道有害菌屬如Desulfovibrio相對(duì)豐度；C、D組相對(duì)于A組，Alistipe的相對(duì)豐度降低，說明巖藻多糖的干預(yù)會(huì)減少小鼠腸道有害菌屬如Alistipe的相對(duì)豐度。

菌群發(fā)酵中最重要的代謝物是SCFAs[31]。對(duì)于微生物群落而言，SCFAs為微生物交叉服務(wù),可被細(xì)菌(如還原乙酸菌、硫酸鹽還原細(xì)菌和產(chǎn)甲烷菌)用作碳和能源[32]。SCFAs是由1～6個(gè)碳組成的飽和脂肪族有機(jī)酸，其中乙酸鹽(C2)、丙酸酯(C3)和丁酸酯(C4)含量最高(95%)[33]，丁酸和丙酸可以調(diào)節(jié)腸道生理和免疫功能。巖藻多糖可促進(jìn)產(chǎn)SCFAs細(xì)菌，如Faecalibacterium的豐度，提示巖藻多糖干預(yù)可作為一種緩解HP感染后腸道菌群紊亂的輔助治療方法。

綜上所述，HP感染可致腸道生物多樣性下降，通過巖藻多糖干預(yù)后，增加了腸道微生物的多樣性，改善了腸道菌群結(jié)構(gòu)的紊亂狀況，使產(chǎn)SCFAs細(xì)菌的相對(duì)豐度增加，有害菌屬的相對(duì)豐度降低。本研究從分子水平揭示了巖藻多糖調(diào)節(jié)腸道菌群的機(jī)制，為巖藻多糖參與HP感染的綜合治療提供了數(shù)據(jù)支持。