山藥多糖對2型糖尿病大鼠腎損傷的保護作用及Wnt/β-catenin信號通路的影響

孔茹欣，王子婧，孫悅，張啟慧，韓妤霖，齊悅

（1.牡丹江醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，黑龍江 牡丹江 157011；2.牡丹江醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院公共衛(wèi)生實驗中心，黑龍江 牡丹江 157011）

0 引言

目前，2型糖尿病腎病發(fā)病機制尚未完全明確，現(xiàn)有臨床相關(guān)研究指出，炎性細胞浸潤、組織缺氧、遺傳因素、糖代謝紊亂、脂代謝紊亂以及血液動力學(xué)因素等均可以引起糖尿病腎病[1]。在美國和大多數(shù)發(fā)達國家，糖尿病腎病和糖尿病腎病是導(dǎo)致終末期腎病的主要原因。在美國，糖尿病占終末期腎病發(fā)病率的30%～50%[2]。目前，糖尿病腎病已經(jīng)成為一個重大的公共衛(wèi)生問題，30%～40%的糖尿病患者發(fā)展為糖尿病腎病。糖尿病腎病患者的特殊治療可分為4個主要領(lǐng)域：心血管風(fēng)險降低、血糖控制、血壓控制和腎素-血管緊張素系統(tǒng)（RAS）抑制[3-4]。有研究指出，通過多因素干預(yù)能夠延緩2型糖尿病患者糖尿病腎病進程，但是無法完全預(yù)防終末期腎病的發(fā)生[5]。不過但是由于2型糖尿病腎損傷發(fā)病人群日益增多，因而積極探尋有效治療藥物具有重要臨床價值。Wnt信號通路是最重要的信號通路之一，Wnt/β-catenin信號通路異常活化與糖尿病腎病發(fā)生及發(fā)展密切相關(guān)[6]。山藥多糖是山藥中的主要活性成分，具有抗突變、抗衰老、降血糖血脂以及提高免疫力等作用。本研究分析了山藥多糖對2型糖尿病大鼠腎損傷的保護作用及Wnt/β-catenin信號通路的影響，現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料。SPF級雄性SD大鼠32只，周齡為8周，體重為（200±20）g；購自安徽醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心（SCXK【皖】2015-0001）。山藥多糖為自制，純度為95%；鏈脲佐菌素（STZ）購自美國Sigma公司；雷公藤多苷購自[遠大醫(yī)藥（中國）有限公司]；HE染色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒及實時定量PCR試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；強生-穩(wěn)豪倍優(yōu)型血糖儀購自美國強生公司，日立7600型全自動生化儀購自日本日立株式會社。

1.2 方法

1.2.1 建立模型：所有大鼠均適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，隨機分為空白對照組（n=8）和糖尿病模型組（n=24）。糖尿病模型組給予高糖高脂飼料，空白對照組給予顆粒型普通飼料喂養(yǎng)。喂養(yǎng)4周后，禁食12 h，糖尿病模型組大鼠單次腹腔注射60 mg/kg的STZ，建立2型糖尿病腎損傷大鼠模型，對照組同時給予注射等量枸櫞酸鈉溶劑。建模3d后測量血糖水平，如果在16.7 mmoL/L以上則建模成功。

1.2.2 分組及用藥：糖尿病模型組隨機分為糖尿病腎病組、山藥多糖組和雷公藤多苷組，每組8只。雷公藤多苷組大鼠給予8 mg·kg-1·d-1灌胃治療；山藥多糖組大鼠給予100 mg·kg-1·d-1灌胃治療；糖尿病腎病組大鼠未給予藥物干預(yù)。共干預(yù)8周時間。

1.2.3 標本處理：干預(yù)8周后于麻醉狀態(tài)下處死大鼠，處死之前收集大鼠24 h尿液；經(jīng)心臟留取大鼠血液標本；剖腹采集大鼠雙腎，統(tǒng)一收取左腎，其中一半放置于4%多聚甲醛溶液中進行固定，時間為24 h；剩余一半放置于-80℃冰箱中保存待用。

1.2.4 腎臟組織HE染色：將置于4%多聚甲醛溶液中進行固定的大鼠腎臟組織切為4μm厚度的薄片，放入一次性蠟盒當中，取蒸餾水進行沖洗，逐次進行乙醇梯度脫水、二甲苯透明以及浸蠟，石蠟包埋，常規(guī)性HE染色，于光鏡下觀察大鼠腎臟組織變化情況。

1.2.5 Wnt-1、β-catenin的mRNA相對表達量：通過RT-PCR法檢測各組大鼠腎組織中Wnt-1、β-catenin的mRNA相對表達量，取-80℃冰箱中保存待用的腎臟組織，以Trizol法提取細胞的總RNA，然后反轉(zhuǎn)錄合成為cDNA，所需引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司設(shè)計合成，引物序列見表1；擴增反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性2 min，95℃變性15 s，退火60℃30s，72℃延伸30 s，共35次循環(huán)，最后72℃延伸5 min。GAPDH作為內(nèi)參，全自動圖像分析系統(tǒng)分析電泳圖，采用2-△△Ct表示相對表達量。

表1 Wnt-1、β-catenin引物

1.2.6 血糖及腎功能指標：通過強生-穩(wěn)豪倍優(yōu)型血糖儀檢測大鼠空腹血糖水平，通過日立7600型全自動生化儀檢各組大鼠的血肌酐、尿素氮、24 h尿蛋白定量水平。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理。通過SPSS 20.0進行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料采用均值±標準差（±s）表示，多組計量資料采用方差分析。P＜0.05表示存在顯著差異。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠腎臟病理變化情況觀察?？瞻讓φ战M大鼠腎小管上皮細胞排列整齊，腎小球與腎小管形態(tài)正常，HE染色結(jié)果顯示大鼠腎臟無明顯病理改變；糖尿病腎病組大鼠腎間質(zhì)出現(xiàn)明顯纖維化，腎小管管腔增大，小管間質(zhì)內(nèi)存在炎性細胞浸潤以及基質(zhì)增多；經(jīng)過8周治療后，雷公藤多苷組和山藥多糖組大鼠腎臟病理改變明顯減輕。

2.2 各組大鼠空腹血糖水平及腎功能指標比較。糖尿病腎病組、雷公藤多苷組、山藥多糖組空腹血糖、血肌酐、尿素氮及24 h尿蛋白定量均明顯高于空白對照組，且雷公藤多苷組、山藥多糖組明顯低于糖尿病腎病組（P＜0.05）；雷公藤多苷組和山藥多糖組空腹血糖水平及腎功能指標比較無明顯差異（P＞0.05）。詳見表2。

表2 各組大鼠空腹血糖水平及腎功能指標比較（±s）

表2 各組大鼠空腹血糖水平及腎功能指標比較（±s）

注：與空白對照組比較,aP＜0.05；與糖尿病腎病組比較,bP＜0.05。

組別 空腹血糖(mmol/L)尿素氮(mmol/L)血肌酐(μmol/L)24h尿蛋白定量(mg)空白對照組 5.68±0.91 53.76±9.17 6.83±0.59 10.97±2.91糖尿病腎病組 20.09±3.25a 142.36±16.89a 24.23±1.24a 46.38±4.79a雷公藤多苷組 12.26±2.87ab 89.11±13.46ab 11.07±0.78ab 21.82±3.26ab山藥多糖組 10.32±2.18ab 81.25±12.57ab 10.15±0.74ab 20.14±3.08ab

2.3 各組大鼠Wnt-1、β-catenin的mRNA相對表達量比較。糖尿病腎病組、雷公藤多苷組、山藥多糖組Wnt-1、β-catenin的mRNA相對表達量均明顯高于空白對照組，且雷公藤多苷組、山藥多糖組明顯低于糖尿病腎病組（P＜0.05）；雷公藤多苷組和山藥多糖組Wnt-1、β-catenin的mRNA相對表達量比較無明顯差異（P＞0.05）。詳見表3。

表3 各組大鼠Wnt-1、β-catenin的mRNA相對表達量比較（±s）

表3 各組大鼠Wnt-1、β-catenin的mRNA相對表達量比較（±s）

注：與空白對照組比較,aP＜0.05；與糖尿病腎病組比較,bP＜0.05。

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3 討論

臨床上，2型糖尿病腎病是2型糖尿病患者極為常見的一種并發(fā)癥，嚴重威脅人們身心健康。糖尿病腎病的典型表現(xiàn)為早期的高濾過和蛋白尿，隨后是進行性腎功能下降。糖尿病腎病的表現(xiàn)可能有所不同，尤其是在2型糖尿病患者中，同時存在其他腎小球/腎小管病變和嚴重的外周血管疾病可能成為重要的混雜因素。糖尿病腎病患者的全因死亡率約為無腎病的糖尿病患者的30倍，絕大多數(shù)糖尿病腎病患者在到達終末期腎病之前會死于心血管疾病。

山藥多糖是山藥主要活性成分，隨著臨床相關(guān)研究逐步深入發(fā)現(xiàn)，山藥多糖具有良好的降血脂、降血糖等作用，可通過促進胰島素分泌、清除自由基以及改善胰島β細胞功能等，降低糖尿病大鼠血糖水平[7]。本研究結(jié)果顯示，糖尿病腎病組大鼠腎間質(zhì)出現(xiàn)明顯纖維化，腎小管管腔增大，小管間質(zhì)內(nèi)存在炎性細胞浸潤以及基質(zhì)增多，說明糖尿病腎病組大鼠存在明顯腎臟損害；經(jīng)過山藥多糖干預(yù)后，腎損害明顯減輕。同時，本研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病腎病組、雷公藤多苷組、山藥多糖組空腹血糖、血肌酐、尿素氮及24 h尿蛋白定量均明顯高于空白對照組，且雷公藤多苷組、山藥多糖組明顯低于糖尿病腎病組（P＜0.05），說明山藥多糖能夠減輕糖尿病大鼠腎組織損傷，降低血糖水平及改善腎功能。

目前，糖尿病腎病發(fā)生機制并未完全清楚，研究顯示，高糖引起的Wnt/β-catenin信號通路異?；罨c糖尿病腎病的發(fā)生及發(fā)展存在密切關(guān)系[8]。Wnt信號的復(fù)雜性及其功能作用對發(fā)育和生長至關(guān)重要，它在胚胎發(fā)生過程中最活躍，通過細胞分化、極化和遷移促進新生物體的形成，它的激活在許多腫瘤和其他疾病的發(fā)展過程中也很常見。纖維化是病理性重塑的最終標志，它是各種慢性疾病和衰老相關(guān)器官衰竭的主要發(fā)病機制，以完全控制慢性傷口愈合和恢復(fù)組織功能。纖維化的過程涉及腎、肺、肝、心臟和其他組織疾病的發(fā)病機制[9]。Wnt在異常的傷口修復(fù)和纖維形成中是一個高度保守的信號，持續(xù)的Wnt激活與纖維化的發(fā)病機制相關(guān)，特別是越來越多的證據(jù)表明Wnt信號在細胞命運決定、增殖和細胞極性建立中起著重要作用[10]。Wnt信號在不同組織中的表達和分布隨著年齡的增長而變化，這些變化對維持組織內(nèi)環(huán)境平衡具有關(guān)鍵作用。Wnt信號通路異常活化可以造成腎臟固有細胞如腎小球系膜細胞以及足細胞等的增殖、凋亡，進而引起腎臟疾病[11]。越來越多的研究表明，許多Wnt抑制劑具有抗組織纖維化的潛在作用，特別是在腎纖維化和Wnt信號在衰老相關(guān)疾病中的作用[12]。Wnt/β-catenin信號通路可以提高Ⅳ型膠原的表達，引起腎小管間質(zhì)纖維化。因此，抑制Wnt/β-catenin信號通路異?；罨瘜τ诟纳铺悄虿∧I病具有重要意義。本研究中，糖尿病腎病組、雷公藤多苷組、山藥多糖組Wnt-1、β-catenin的mRNA相對表達量均明顯高于空白對照組，且雷公藤多苷組、山藥多糖組明顯低于糖尿病腎病組（P＜0.05），而雷公藤多苷組和山藥多糖組Wnt-1、β-catenin的mRNA相對表達量比較無明顯差異（P＞0.05），說明山藥多糖能夠降低糖尿病大鼠腎臟組織中Wnt-1、β-catenin表達水平，進而發(fā)揮腎臟保護的作用。

綜上所述，山藥多糖對2型糖尿病大鼠腎損傷有一定保護作用，可能與抑制Wnt/β-catenin信號通路異常激活有關(guān)。