鈦表面微弧氧化-微波水熱法銅鈮涂層的制備及抗菌性研究

王天琦， 杜青， 謝偉麗

1.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院修復(fù)科，黑龍江 哈爾濱（150001）； 2.哈爾濱工業(yè)大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院，黑龍江 哈爾濱（150001）

鈦及鈦合金由于優(yōu)異的機(jī)械性能、高耐腐蝕性及良好的生物相容性等，被廣泛應(yīng)用于骨科手術(shù)及牙科種植體［1］。植入物表面改性是減少植入物相關(guān)感染發(fā)生的有效途徑，同時(shí)也是可以在不破壞材料本身性能的情況下改性植入物界面屬性相對(duì)簡(jiǎn)單的方法［2］。微弧氧化技術(shù)雖然可以通過調(diào)控電解液成分引入到涂層中一些生物活性元素，但部分生物活性元素以非晶形式存在于涂層內(nèi)不具備好的生物活性，微波水熱處理能更好地賦予涂層生物活性及活化表面性能［3］。銅離子在一定濃度下具有抗菌性能和生物活性，且不會(huì)對(duì)細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性［4］。鈮具有較高的化學(xué)穩(wěn)定性和生物相容性，含有鈮元素的磷酸鈣復(fù)合涂層可顯著增加成骨細(xì)胞的堿性磷酸酶活性，具有促進(jìn)成骨細(xì)胞鈣化的作用［5］，但目前對(duì)于含鈮涂層抗菌性能相關(guān)文獻(xiàn)較少。本實(shí)驗(yàn)擬采用微弧氧化法在純鈦表面制備含鈣磷元素陶瓷涂層，通過微波水熱法合成含銅鈮的涂層，觀察分析涂層的結(jié)構(gòu)表征，并測(cè)定其抗菌效果。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料及菌株

純鈦TA2（江浙鈦制品有限公司，中國(guó)）；大腸桿 菌（Escherichia coli，E. coli）國(guó) 際 標(biāo) 準(zhǔn) 菌 株（ATCC25922）與金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，S. aureus）國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)菌株（ATCC29213）均由哈爾濱獸醫(yī)研究所提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑及主要儀器設(shè)備

LB 培養(yǎng)基（luria-bertni culture，LB culture）（百思生物技術(shù)有限公司，中國(guó)）；氯化銅（天津福晨化學(xué)試劑公司，中國(guó)）；草酸鈮（上海麥克林生化科技有限公司，中國(guó)）；微弧氧化設(shè)備（MAO60-Ⅱ，西安理工大學(xué)，中國(guó)）；微波水熱平行合成儀（XH-800S；北京祥鵠科技發(fā)展有限公司，中國(guó)）；掃描電子顯微 鏡（scanning electron microscope，SEM）（Helios Nanolab 600i，F(xiàn)EI，美國(guó)）；X 射線能譜儀（energy dispersive spectrometer，EDS）（Helios Nanolab 600i，EDAX，美國(guó)）；常溫/高溫多功能X 射線衍射儀（Xray diffraction，XRD）（X’PERT，Panalytical，荷蘭）；生化培養(yǎng)箱（KB115，Binder，德國(guó)）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 試件的制備及分組 將純鈦TA2 用線切割加工成標(biāo)準(zhǔn)試件10 mm×10 mm×1 mm，表面預(yù)處理，依次用240#、400#、800#、1 000#的SiC 砂紙打磨去除其表面氧化層。將試件浸沒在丙酮、無水乙醇、去離子水超聲清洗30 min，吹干備用。

①M(fèi)AO 組：預(yù)處理后的鈦試件為陽極，不銹鋼為陰極，置于帶有攪拌系統(tǒng)的電解液中，將MAO60-Ⅱ型脈沖電源升至預(yù)設(shè)電壓，制備MAO 涂層。電解液成分如表1 所示。工藝參數(shù)見表2。

表1 微弧氧化電解液成分Table 1 Composition of the microarc oxidation electrolyte

表2 微弧氧化工藝參數(shù)Table 2 Process parameters of the microarc oxidation

②MH-Cu 組：將帶有MAO 涂層的鈦片用夾具將其固定在微波水熱反應(yīng)釜中，樣品完全浸沒在40 mL 不同濃度的CuCl2溶液中，放入XH-800S 型微波水熱平行合成儀中。微波水熱處理引入Cu2+工藝參數(shù)及分組如表3。反應(yīng)完成后，待樣品自然冷卻至室溫后取出。去離子水沖洗，烘干備用。

表3 不同濃度CuCl2溶液微波水熱處理的分組及工藝參數(shù)Table 3 Grouping and process parameters of microwave hydrothermal treatment of CuCl2 solutions with different concentrations

③MH-Nb 組：純鈦試件微弧氧化處理后，以0.1 mol/L 的草酸鈮為反應(yīng)液微波水熱法制備含鈮涂層，處理方法同MH-Cu 組。

④MH-Cu/Nb 組：根據(jù)掃描電子顯微鏡和能譜儀選擇MH-Cu 組中引入銅最多的組別與0.1 mol/L的草酸鈮溶液混合微波水熱制備銅鈮涂層，處理方法同MH-Cu 組。

1.3.2 涂層表面形貌、元素分析、物相組成 SEM下對(duì)涂層微觀結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察；EDS 測(cè)定涂層表面元素種類、含量及其元素面分布；XRD 對(duì)表面物相組成進(jìn)行分析。

1.3.3 貼膜法測(cè)定抗菌性能 LB 培養(yǎng)基分別接種凍干株E. coli和S. aureus，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h 后，再將其傳至兩代，接種環(huán)取菌株在LB 液體培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，最后用麥?zhǔn)媳葷岱▽⒕鷳乙簼舛认♂屩? × 106CFU/mL。貼膜法測(cè)定本實(shí)驗(yàn)中MAO 組、MH-Cu 組中Cu2+引入量最多組、MHNb 組、MH-Cu/Nb 組表面涂層，將20 μL 菌懸液滴在24 孔板上的樣品表面，用無菌性的PE 薄膜（0.855 cm × 0.85 cm）覆蓋，在菌液均勻分布、不溢出狀態(tài)下37 ℃培養(yǎng)24 h。將試樣取出后置于20 mL 的PBS 中洗脫5 min。將100 μL 洗脫液滴在LB固體培養(yǎng)基上，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h 后菌落平板計(jì)數(shù)?？咕剩剑郏▽?duì)照組平均回收菌落數(shù)-實(shí)驗(yàn)組平均回收菌落數(shù)）/對(duì)照組平均回收菌落數(shù)］×100%。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 23.0 軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，數(shù)據(jù)符合正態(tài)性和方差齊性，以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD 檢驗(yàn)分析，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 表面元素含量、分布分析

EDS 顯示，MHL-Cu、MHM-Cu、MHH-Cu 組表面均引入了Cu 元素，各組Cu 元素原子比例依次為（0.68 ± 0.04）%、（1.17 ± 0.06）%、（1.64 ± 0.03）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），因而選擇MHH-Cu組與草酸鈮混合經(jīng)微波水熱制備復(fù)合涂層（MHCu/Nb 組）。圖1 為MHH-Cu 組涂層表面元素掃描圖，可以看出各元素分布均勻，Ti 元素分布較為廣泛，在微孔處含量較多；O、Si、P、Ca、Cu 元素主要分布在微孔周圍，在孔內(nèi)含量較少。圖2、圖3 分別為MH-Nb、MH-Cu/Nb 組表面元素分布圖，與引入Cu 元素類似，各元素分布均勻，Ti 含量較多，分布在微孔處，其他元素主要分布在孔洞周圍。

2.2 涂層表面形貌分析

圖4a 為MAO 組的SEM 圖，呈現(xiàn)典型的“火山口狀”形貌，孔洞分布均勻，孔隙率為8.83%，通過右上角高倍掃描圖可以觀察到涂層表面較為光滑。MH-Cu 組表面形貌如圖4b～4d 所示，涂層表面仍保持著多孔結(jié)構(gòu)，隨著Cu2+濃度的增加，孔洞尺寸變化不大，孔隙率略有下降（依次為8.13%、7.39%、6.92%），粗糙度增加，顆粒物粒徑變大。MH-Nb 組涂層表面仍保持著火山狀微孔（圖4e），孔隙率（9.26%）較MAO 涂層有所增加，表面出現(xiàn)溝壑狀，顆粒物較小，局部存在大顆粒沉積。MH-Cu/Nb 組涂層表面微孔尺寸變化不大（圖4f），但孔隙率達(dá)到11.2%，涂層表面溝壑狀明顯，沉積物較多。

Figure 1 Distribution of elements on the surface of a microwave hydrothermal coating with a high copper content(× 5 000)圖1 高銅組微波水熱涂層表面元素分布（×5 000）

Figure 2 Distribution of the elements on the surface of the microwave hydrothermal coating containing niobium(× 5 000)圖2 含鈮組微波水熱涂層表面元素分布（×5 000）

2.3 表面物相分析

MAO 組主要是Ti 和銳鈦礦（Anatase）TiO2的衍射峰，含有少量的金紅石（Rutile）相，TiO2的存在與能譜中元素含量相吻合（圖5）。實(shí)驗(yàn)組可同時(shí)觀測(cè) 到Anatase 和Rutile 相TiO2的 衍 射 峰，Rutile 相TiO2的衍射峰較MAO 組有所增強(qiáng)。各組的Anatase和Rutile 相TiO2的衍射峰強(qiáng)度基本相同。

2.4 貼膜法抗菌性能分析

Figure 3 Distribution of elements on the surface of the microwave hydrothermal coating of the copper-niobium composite group(× 5 000)圖3 銅鈮復(fù)合組微波水熱涂層表面元素分布（×5 000）

Figure 4 Surface scanning electron microscope morphology of the coatings on each group of specimens圖4 各組試件涂層的表面掃描電子顯微鏡形貌

Figure 5 X-ray diffraction patters of the different groups圖5 各組X 射線衍射儀圖譜

貼膜法測(cè)定各組試件表面培養(yǎng)24 h 對(duì)E. coli和S.aureus生長(zhǎng)情況的影響（圖6），菌落計(jì)數(shù)見表4。E. coli和S. aureus的菌落數(shù)分別為MAO 組：（590.3± 23.0）CFU、（488.0 ± 21.0）CFU，MHH-Cu 組：（46.0± 5.7）CFU、（34.7 ± 3.5）CFU，MH-Nb 組：（273.0 ±9.2）CFU、（213.0 ± 7.0）CFU，MH-Cu/Nb 組：（39.0 ±2.6）CFU、（28.3 ± 2.1）CFU，與MAO 組相比，MHHCu、MH-Nb、MH-Cu/Nb組E.coli和S.aureus菌落數(shù)均有不同程度減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)（P＜0.001）；MHHCu、MH-Cu/Nb 組E. coli和S. aureus菌落 數(shù)均少 于MH-Nb 組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）；MHH-Cu 組E. coli和S. aureus菌落數(shù)與MH-Cu/Nb 組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0.521，P＝0.510），但兩者對(duì)E.coli和S.aureus的抗菌率均達(dá)到92%以上。

Figure 6 Escherichia coli and Staphylococcus aureus after 24 h surface culture of each group of specimens圖6 各組試件表面培養(yǎng)24 h 后大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的情況

表4 各組試件對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抗菌效果Table 4 Antibacterial effect of each group on Escherichia coli and Staphylococcus aureus n=3,±s

表4 各組試件對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抗菌效果Table 4 Antibacterial effect of each group on Escherichia coli and Staphylococcus aureus n=3,±s

1): compared with MAO group, P ＜0.001; 2): compapred with MHH-Cu group,P ＜0.001;3):compared with MH-Nb group,P ＜0.001

Groups MAO MHH-Cu MH-Nb MH-Cu/Nb Antibacterial rate（%）-92.2 53.8 94.4 Antibacterial rate（%）-92.9 56.4 94.2 FP Escherichia coli Colony count（CFU）590.3±23.0 46.0±5.71）273.0±9.21）2）39.0±2.61）3）1 237.560＜0.001 Staphylococcus aureus Colony count（CFU）488.0±21.0 34.7±3.51）213.0±7.01）2）28.3±2.11）3）1 102.054＜0.001

3 討 論

影響植入物周圍軟硬組織的種植體周圍炎是牙種植最常見的并發(fā)癥之一［6］，在種植體表面粘附的細(xì)菌被認(rèn)為是生物膜形成的初始和關(guān)鍵步驟，這會(huì)導(dǎo)致種植體的失敗。因此，對(duì)生物材料表面改性獲得抗菌材料涂層以抑制病原微生物的粘附是目前研究的重點(diǎn)［7］。Scarano 等［8］認(rèn)為細(xì)菌一旦早期定植，可能構(gòu)成一個(gè)細(xì)菌庫，隨后可能污染種植體的周圍環(huán)境，并干擾種植體周圍軟硬組織的健康，進(jìn)一步影響骨整合。

微弧氧化是以輕金屬為陽極，不銹鋼板為陰極，首先在基體表面形成陽極氧化絕緣層，隨著電壓升高，絕緣層被擊穿，金屬基體在弧光放電產(chǎn)生的高溫高壓的作用下發(fā)生氧化，形成多孔納米結(jié)構(gòu)的陶瓷涂層［9］。本實(shí)驗(yàn)中，微弧氧化后形成了多孔的表面涂層，這種多孔結(jié)構(gòu)可以促進(jìn)周圍新的骨組織向內(nèi)生長(zhǎng)和血管的生成，且結(jié)合牢固［10］。微波水熱是在高溫、高壓、微波的共同作用下，提高反應(yīng)物的活性，能快速有效將生物活性元素引入涂層中，同時(shí)保留生物活性元素的優(yōu)勢(shì)［11］。SEM 結(jié)果顯示，同MAO 組相較，微波水熱處理的涂層表面仍保持了微弧氧化獨(dú)特的多孔結(jié)構(gòu)，同時(shí)MH-Cu 組隨著銅離子濃度增加，涂層表面孔隙率減小，粗糙度增加，顆粒物粒徑稍有增加，MH-Nb、MH-Cu/Nb 組涂層孔隙率與MAO 組相比略有增加，這可能是草酸鈮微波水熱過程中釋放氣體引起的，顆粒物粒徑較小，局部有沉積物。

羥基磷灰石主要由磷酸鈣組成，是骨組織的主要成分，磷酸鈣的形成在種植體與周圍的骨組織之間產(chǎn)生了強(qiáng)烈的化學(xué)鍵，可以改善骨組織和種植體材料的同化［12］。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過微波水熱方法，成功地在MAO 涂層表面引入了相應(yīng)的抗菌元素。同時(shí)，鈣、磷等元素仍保持在涂層表面，說明微波水熱過程不會(huì)破壞涂層誘導(dǎo)HA 的能力。經(jīng)過不同溶液微波水熱處理后的涂層，各組涂層均以Anatase 和Rutile 相TiO2礦物成分組成，沒有檢測(cè)到含Cu 或者Nb 的相，可能是由于Cu、Nb 含量較少或以非晶形式摻雜在MAO 層表面。而Anatase 和Rutile TiO2能夠誘導(dǎo)HA 形成，促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖分化［13］。涂層表面粗糙多孔結(jié)構(gòu)及鈣磷等活性元素對(duì)于成骨方面作用已有大量研究，本實(shí)驗(yàn)主要研究如何提高該涂層的抗菌性能。

Cu 作為人體必需的微量元素，有研究表明將Cu 離子作為抗菌離子引入鈦及鈦合金中時(shí)對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌有著明顯的抑菌效果［14］。而含Nb 的涂層會(huì)增加種植體抗腐蝕性及生物相容性［15］。Wojcieszak 等［16］利用高能磁控濺射制備含有Cu 和Nb 的二氧化鈦的涂層，與未摻雜的TiO2涂層相比，TiO2（Nb，Cu）的粗糙度較高，同時(shí)具有很好的抗菌性能。同樣本實(shí)驗(yàn)中抗菌結(jié)果顯示，與MAO 組相比，MHH-Cu、MH-Nb、MH-Cu/Nb 組均具有抑菌效果，而MHH-Cu 組與MH-Cu/Nb 組，對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抗菌率均達(dá)到92%以上，效果顯著，這可能與Cu 離子的釋放相關(guān)。

綜上所述，使用微弧氧化-微波水熱兩步法對(duì)純鈦表面改性，成功制備了含銅、鈮、鈣、磷等活性元素的粗糙多孔涂層，有效抑制大腸桿菌和金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)。然而銅鈮涂層的抗菌機(jī)制及對(duì)于其他優(yōu)勢(shì)菌屬的抗菌性能還需進(jìn)一步研究。

【Author contributions】Wang TQ performed the experiments and wrote the article. Du Q and Xie WL designed the study. All authors read and approved the final manuscript as submitted.