錳氧化菌激活及生物氧化錳去除乙炔基雌二醇試驗(yàn)研究

翟俊 夏亦寒 成水平 田雨 王泉峰

摘 要：利用污水廠好氧污泥進(jìn)行錳氧化細(xì)菌的激活試驗(yàn)，探究pH值以及初始Mn2+濃度對激活效果的影響，采用高通量測序技術(shù)分析激活前后微生物群落變化，利用X射線衍射（X-ray diffraction，XRD）技術(shù)對產(chǎn)生的生物氧化錳進(jìn)行表征，研究pH值和投加量對生物氧化錳去除乙炔基雌二醇（17α-ethinylestradiol，EE2）的影響。結(jié)果表明：pH值為7、初始Mn2+濃度為1 mmol/L時(shí)，Mn2+氧化率7 d內(nèi)能達(dá)到83.3%，錳氧化菌激活效果最好。XRD結(jié)果表明：生物氧化錳主要含有MnO2、Mn3O4、Na3Mn（PO3）CO3等3種成分。高通量測序結(jié)果表明：經(jīng)過激活后，芽孢桿菌屬（0.75%）、不動(dòng)桿菌屬（1.26%）、假單胞菌屬（1.36%）、鞘氨醇桿菌屬（1.81%）、黃桿菌屬（2.39%）、微桿菌屬（2.97%）、氣單胞菌屬（7.35%）的豐度顯著增加，典型的錳氧化細(xì)菌菌屬總豐度達(dá)到17.89%。EE2在反應(yīng)pH值為4.0、生物氧化錳投加量為20 mg/L的條件下去除效果最好，48 h后EE2的去除率可達(dá)97.7%，其中，生物氧化錳對EE2的去除率可達(dá)76.9%。

關(guān)鍵詞：乙炔基雌二醇;錳氧化菌;高通量測序;生物氧化錳

中圖分類號：X522?? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A?? 文章編號：2096-6717（2020）04-0154-08

收稿日期：2020-09-26

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金（51878093）

作者簡介：翟俊 （1977- ），男，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事廢水處理理論與技術(shù)研究，E-mail：zhaijun99@126.com。

Received：2020-09-26

Foundation item：National Natural Science Foundation of China （No. 51878093）

Author brief：ZHAI Jun （1977- ）， professor， doctorial supervisor， main research interests： wastewater treatment theory and technology， E-mail： zhaijun99@126.com.

Activation of manganese-oxidizing bacterium and removal of 17 α-ethinylestradiol by biogenic manganese oxides

ZHAI Jun1， XIA Yihan1， CHENG Shuiping2， TIAN Yu1， WANG Quanfeng1

（1. College of Environment and Ecology， Chongqing University， Chongqing 400045， P. R. China; 2. College of Environmental Science and Engineering， Tongji University， Shanghai 200092， P. R. China）

Abstract： Aerobic sludge from the wastewater treatment plant was sampled as inoculation bacteria， and the effects of pH and initial Mn2+ concentration on the activation of manganese-oxidizing bacterium were studied. High-throughput sequencing technology was used to analyze the variation of microbial communities before and after activation. On this basis， the biogenic manganese oxides produced by manganese-oxidizing bacterium were characterized by X-ray diffraction. Besides， the effects of pH and biogenic manganese oxides dosage on the removal of EE2 by biogenic manganese oxides were analyzed. The results show that the best activation effect of manganese oxidizing bacterium is obtained when the initial Mn2+ concentration is 1 mmol/L at pH 7.0 and 83.3% Mn2+ is transformed into biogenic manganese oxides after 7 days under this condition. XRD results show that the biogenic manganese oxides produced mainly include MnO2， Na3Mn（PO3）CO3， and Mn3O4. According to the results of high-throughput sequencing， the abundance of Bacillus（0.75%）， Acinetobacter（1.26%）， Pseudomonas（1.36%）， Sphingobacterium（1.81%）， Flavobacterium（2.39%）， Exiguobacterium（2.97%）， Areomonas（7.35%） increases significantly， and the total relative abundance of typical manganese-oxidizing bacterium reaches 17.89%. When the biogenic manganese oxides dosage is 20 mg/L at pH 4.0， EE2 has the best removal efficiency. After 48 h， the removal rate of EE2 reaches 97.7%， in which 76.9% is removed by biogenic manganese oxides.

Keywords：17α-ethinylestradiol; manganese-oxidizing bacterium; high-throughput sequencing; biogenic? manganese oxides

乙炔基雌二醇（17α-ethinylestradiol，EE2）是一種典型的人工合成類固醇雌激素，主要應(yīng)用于治療脫發(fā)癥、乳腺癌、前列腺等疾病，其中，大量未被人體利用的EE2以及代謝物會(huì)排放進(jìn)入環(huán)境[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，目前中國自然水體內(nèi)的EE2濃度為5.7～70 ng/L[2-4]。然而，即使在如此低濃度的條件下，EE2也會(huì)對環(huán)境中非目標(biāo)生物的生長、發(fā)育以及繁殖產(chǎn)生明顯影響，甚至?xí)ㄟ^食物鏈富集對生態(tài)安全和人類健康產(chǎn)生潛在威脅[5]。

污水處理廠是污水中各種污染物去除的主要場所，但其設(shè)計(jì)的初衷并不是為了完全去除有機(jī)藥物，因此，對EE2的去除率較低，且吸附于污泥的EE2容易造成二次污染[6]。目前的EE2處理工藝，如高級氧化、膜工藝及過濾法等，雖然有較好的去除效果，但因其能耗較大及毒性副產(chǎn)物產(chǎn)生等問題，大規(guī)模應(yīng)用受到限制[7]，因此，開發(fā)低環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)的EE2處理技術(shù)具有重要的環(huán)境意義。

生物氧化錳是微生物（錳氧化細(xì)菌或真菌）氧化Mn2+而生成的一種無定形礦物[8]。大量研究表明，生物氧化錳具有優(yōu)異的吸附和氧化性能，能夠有效去除環(huán)境中許多種類的有機(jī)和無機(jī)污染物[8]。因此，利用生物氧化錳去除EE2具有較大的應(yīng)用前景。錳氧化細(xì)菌（manganese-oxidizing bacterium，MnOB）可以通過直接[9-10]和間接氧化[11-12]兩種機(jī)制實(shí)現(xiàn)對Mn2+的氧化。例如，MnOB可以分泌胞外錳氧化因子（如多糖、蛋白質(zhì)）直接催化氧化Mn2+[9-10]。另外，MnOB自身生長代謝活動(dòng)導(dǎo)致的環(huán)境條件改變（如提高pH值和DO）會(huì)加速M(fèi)n2+的化學(xué)氧化過程，實(shí)現(xiàn)間接氧化[11-12]。相關(guān)研究表明，溫度、pH值、Mn2+濃度等因素均會(huì)影響MnOB的活性[13]，進(jìn)而對生物氧化錳的生成產(chǎn)生影響。但關(guān)于這些條件對MnOB及生物氧化錳去除EE2效果的影響還鮮有報(bào)道。

筆者以污水廠好氧污泥作為菌源，在不同pH值及初始Mn2+濃度條件下對MnOB進(jìn)行激活。利用XRD對最優(yōu)激活條件下生成的生物氧化錳進(jìn)行分析，并通過高通量測序分析激活反應(yīng)前后微生物群落的變化，以生物氧化錳為氧化劑，研究pH值和投加量對生物氧化錳去除EE2的影響，研究結(jié)果可為生物氧化錳去除EE2提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

菌源：試驗(yàn)菌源取自重慶豪洋水務(wù)沙坪壩排水公司氧化溝好氧段污泥。培養(yǎng)基采用Leptothrix培養(yǎng)基[14]，根據(jù)試驗(yàn)需要加入一定量的Mn2+（MnCl2·4H2O），緩沖溶液為MES緩沖溶液（pH值為5.0及6.0）或HEPES緩沖溶液（pH值為7.0及8.0）。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1 MnOB激活

將5%的好氧污泥接種于100 mL培養(yǎng)基中，pH值分別設(shè)置為5.0、6.0、7.0、8.0，體系初始Mn2+濃度為1 mmol/L，設(shè)置3個(gè)平行，于28 ℃、轉(zhuǎn)速140 r/min的搖床中避光培養(yǎng)7 d。定期對體系內(nèi)Mn2+濃度、生物氧化錳濃度進(jìn)行測定。

研究初始Mn2+濃度的影響時(shí)，操作同上，pH值為試驗(yàn)得到的最優(yōu)pH值，初始Mn2+濃度設(shè)置為0.5、1、2.5、5、10 mmol/L，其他條件同上。

將菌源接種至培養(yǎng)基中，在上述試驗(yàn)得到的最優(yōu)pH值及Mn2+濃度下培養(yǎng)7 d。取適量菌懸液，用無菌水清洗，并以2 000 r/min離心10 min，以去除雜質(zhì)，重復(fù)以上步驟10次，所得樣品部分在4 ℃冰箱中保存，以用于后續(xù)EE2去除試驗(yàn)。其余樣品進(jìn)行純化程序，獲得純化生物氧化錳用于XRD分析。純化程序?yàn)閇15]：樣品在10 mL苯酚中超聲提取45 min，并以50∶50苯酚∶氯仿、氯仿和12∶5∶3甲醇∶氯仿∶水為溶劑提取10 min。用無菌水沖洗樣品10次，并酸化至pH值為3。以150 r/min離心30 min，

去上清液，在0.17% NaOH溶液中振蕩4 h，最后，用無菌水清洗樣品10次，保存?zhèn)溆谩?/p>

純化后得到的生物氧化錳經(jīng)冷凍干燥（-50 ℃）、研磨、過篩，進(jìn)行XRD表征。此外，為分析激活前后微生物群落的變化，在激活反應(yīng)前后，取適量污泥樣品，提取總DNA后進(jìn)行16SrDNA高通量測序。

1.2.2 生物氧化錳去除EE2

取最優(yōu)激活條件下產(chǎn)生的生物氧化錳進(jìn)行EE2去除試驗(yàn)。根據(jù)不同pH值設(shè)置為5組，體系pH值分別為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0，生物氧化錳濃度為20 mg/L，有機(jī)藥物濃度為1 mg/L。每組試驗(yàn)取3次平行試驗(yàn)的平均值作為試驗(yàn)數(shù)據(jù)。此外，為了排除體系中生物相對有機(jī)藥物去除的貢獻(xiàn)，每組試驗(yàn)設(shè)置一個(gè)對照組。對照組通過加入50 μL 10%抗壞血酸以使生物氧化錳溶解，其余條件同上，定期取樣對體系內(nèi)EE2濃度進(jìn)行測定。

研究生物氧化錳投加量的影響時(shí)，體系pH值為試驗(yàn)得到的最優(yōu)pH值，分別控制體系的生物氧化錳濃度為5、10、20 mg/L，其余試驗(yàn)及測試條件同上。

1.3 測試方法

1.3.1 化學(xué)測試方法

采用高碘酸鉀分光光度法[16]進(jìn)行Mn2+濃度的測定。采用亮柏藍(lán)分光光度法[17]進(jìn)行生物氧化錳濃度的測定。采用液相色譜法進(jìn)行EE2濃度的測定，其中：色譜柱為Eclipse XDB-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）;流動(dòng)相為乙腈和水，體積比為60∶40;進(jìn)樣量20 μL;流速1.0 mL/min;柱溫26 ℃;檢測波長205 nm;保留時(shí)間2.977 min。

1.3.2 XRD表征

采用布魯克D8 ADVANCE X射線衍射儀對生物氧化錳進(jìn)行物相分析，其測試條件為Cu kα輻射源，掃描范圍為10°～90°（2θ），掃描速率2.0 （°）/min，步幅0.02°。

1.3.3 微生物多樣性分析

混合液離心后去上清液，按照PowerSoil DNA試劑盒說明提取總DNA，隨后用核酸濃度測定儀測定樣品DNA濃度（NanoDrop2000，美國Thermo Fisher Scientific公司）。對檢測合格的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增后進(jìn)行16SrDNA高通量測序（上海美吉生物技術(shù)有限公司）。PCR擴(kuò)增引物為338F（3-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-5）及806R（3-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-5）[18]。PCR產(chǎn)物片段驗(yàn)證采用2%瓊脂糖凝膠電泳。

2 結(jié)果與討論

2.1 MnOB激活

2.1.1 pH值的影響

不同pH值條件下，Mn2+、生物氧化錳濃度變化及Mn2+轉(zhuǎn)化率見圖1。反應(yīng)7 d后，Mn2+及生物氧化錳濃度均達(dá)到穩(wěn)定，激活反應(yīng)完成。在pH值為7.0時(shí)，7 d后體系內(nèi)Mn2+去除率達(dá)到92.4%，而Mn2+的氧化率達(dá)到83.3%，氧化率顯著高于其他試驗(yàn)組，以激活反應(yīng)完成后Mn2+的氧化率作為衡量激活反應(yīng)效果的指標(biāo)，pH值為7.0時(shí)，MnOB激活效果最好，這與Zhou等[19]及崔馨文[20]的研究結(jié)果一致。在試驗(yàn)pH值范圍內(nèi)，Mn2+的氧化主要是生物氧化而非生物化學(xué)氧化，因?yàn)閜H值小于9時(shí)動(dòng)力學(xué)上不利于Mn2+的化學(xué)氧化[21]。因此，pH值對Mn2+氧化速率的影響主要是對MnOB活性的影響，中性條件對MnOB的生長更

有利[20]，這可能是中性條件下Mn2+的氧化率高的主要原因。因此，在研究初始Mn2+濃度的影響時(shí)，控制pH值為7.0。

2.1.2 初始Mn2+濃度的影響

不同初始Mn2+濃度下，Mn2+、生物氧化錳濃度變化及Mn2+轉(zhuǎn)化率見圖2。反應(yīng)7 d后體系的Mn2+及生物氧化錳濃度均達(dá)到穩(wěn)定，激活反應(yīng)完成。初始Mn2+濃度為1 mmol/L時(shí)，7 d后Mn2+去除率達(dá)到92.4%，其中，90.15%轉(zhuǎn)化為生物氧化錳，Mn2+的氧化率達(dá)到83.3%，而初始Mn2+濃度為2.5 mmol/L時(shí)，雖然生物氧化錳的生成量最高，但其Mn2+的氧化率較低，因此，以激活反應(yīng)完成后Mn2+的氧化率作為衡量激活反應(yīng)效果的指標(biāo)，初始Mn2+濃度為1 mmol/L時(shí)，MnOB激活效果最好。而當(dāng)初始Mn2+濃度高于

5 mmol/L時(shí)，Mn2+利用較差，MnOB受到極大的抑制，此時(shí)MnOB激活失敗。崔馨文[20]對來自好氧污泥的MnOB進(jìn)行Mn2+抗性研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，地衣芽胞桿菌（Bacillus megaterium）及巨大芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）在Mn2+濃度高于8 mmol/L時(shí)均不能生長。Zhou等[19]發(fā)現(xiàn)高濃度Mn2+對海洋沉積物中MnOB同樣有抑制作用，這與試驗(yàn)結(jié)果一致。

2.2 生物氧化錳的XRD表征

XRD測試結(jié)果如圖3所示。樣品的2θ角特征峰出現(xiàn)在19.823°、20.962°、26.580°、36.501°、34.776°、59.890°等處。通過與相應(yīng)礦物的標(biāo)準(zhǔn)XRD卡片進(jìn)行對比可以確定，MnOB激活產(chǎn)生的生物氧化錳主要包含MnO2、Na3Mn（PO3）CO3、Mn3O4等化合物。Zhou等[19]在對海洋沉積物中的MnOB生成的生物氧化錳進(jìn)行XRD分析時(shí)，也發(fā)現(xiàn)了Na3Mn（PO4）CO3。Chubar等[22]研究發(fā)現(xiàn)，Shewanella putrefaciens產(chǎn)生的Mn3（PO4）2、MnCO3會(huì)通過離子交換和表面絡(luò)合形成Na3Mn（PO3）CO3，這可能是生物氧化錳中未發(fā)現(xiàn)MnCO3的原因。

MnOB激活產(chǎn)生的生物氧化錳主要包含MnO2、Na3Mn（PO3）CO3、Mn3O4等化合物，與化學(xué)合成的氧化錳相比，生物錳氧化物具有更好的氧化和吸附能力[8]，另外，生物錳氧化物可以在錳氧化微生物作用下進(jìn)行持續(xù)再生[15]，因此，生物錳氧化物在污染物的處理效果和成本上比化學(xué)合成錳氧化物更有優(yōu)勢。

2.3 微生物群落的變化

在最優(yōu)條件下，激活反應(yīng)前后各取適量生物樣品進(jìn)行16SrDNA高通量測序，并對數(shù)據(jù)樣本進(jìn)行alpha多樣性分析，以探究微生物多樣性的變化。微生物16SrDNA的alpha多樣性指數(shù)表見表1。由表1可以看出，激活反應(yīng)前后Chao指數(shù)、ACE指數(shù)及Shannon指數(shù)減小，Simpson指數(shù)增大，說明激活反應(yīng)前后群落的豐富度及多樣性均在下降。

為了確定主導(dǎo)生物氧化錳生成的微生物，對比了相對豐度顯著提高的屬與目前已知存在MnOB的菌屬。結(jié)果表明，激活反應(yīng)后有9種菌屬的相對豐度顯著提高，其中，有7種已證明存在的MnOB屬，包括變形菌門中的氣單胞菌屬[23]（Aeromonas）、假單胞菌屬[24]（Pseudomonas）、不動(dòng)桿菌屬[25]（Acinetobacter）、厚壁菌門中的芽孢桿菌屬[24]（Bacillus）、微桿菌屬[26]（Exiguobacterium）、擬桿菌門中的黃桿菌屬[27]（Flavobacterium）、鞘氨醇桿菌屬[26]（Sphingobacterium），上述菌屬的相對豐度變化情況見圖4。其相對豐度在激活反應(yīng)后分別增加了7.2%、1.34%、1.1%、0.75%、2.96%、2.33%、1.47%，總相對豐度由0.74%增加至17.89%，這表明試驗(yàn)成功激活了環(huán)境樣本中的MnOB。此外，兩種未報(bào)道存在MnOB的菌屬，包括變形菌門的從毛單胞菌屬（Comamonas）和嗜氫菌屬（Hydrogenophaga），其相對豐度在激活反應(yīng)后也顯著增加，分別從0.06%、0.5%增加到1.60%、0.83%，說明這兩個(gè)屬中也可能存在可以氧化Mn2+的細(xì)菌，也可能是兩個(gè)屬中存在對高濃度Mn2+較為耐受的微生物。

2.4 生物氧化錳去除EE2

2.4.1 pH值的影響

圖5為不同pH值條件下EE2的去除情況。圖中，pH值為4.0時(shí)，試驗(yàn)組（生物氧化錳+生物相）對EE2的去除率達(dá)到97.7%，其中，生物氧化錳的貢獻(xiàn)率達(dá)到76.9%，去除效果最好。隨著pH值的升高，試驗(yàn)組對EE2的去除效果逐漸變差，pH值為8.0時(shí)生物氧化錳對EE2的去除效果顯著降低，這與郭淑文[28]和孔祥震[29]的研究結(jié)果一致。這可能是由于pH值的增加會(huì)降低錳氧化物的表面電子轉(zhuǎn)移速率及產(chǎn)物脫附速率。此外，由于生物氧化錳對EE2的去除可能引起EE2從生物相解吸附，這可能解釋了試驗(yàn)組初始階段EE2濃度的上升。

2.4.2 生物氧化錳投加量的影響

基于試驗(yàn)結(jié)果，在研究生物氧化錳投加量的影響時(shí)，控制pH值為4.0。圖6為不同生物氧化錳投加量下EE2的去除情況。試驗(yàn)結(jié)果表明，生物氧化錳投加量為20 mg/L時(shí)，試驗(yàn)組（生物氧化錳+生物相）對EE2去除效果最好，去除率達(dá)到97.7%，其中生物氧化錳的貢獻(xiàn)率為76.9%。生物氧化錳投加量越大，試驗(yàn)組去除率越大，生物氧化錳對EE2去除的貢獻(xiàn)率也越大，這是由于投加量的增加會(huì)增加去除反應(yīng)結(jié)合位點(diǎn)，促進(jìn)反應(yīng)的進(jìn)行。與之類似，生物氧化錳的增加同樣增加了生物相的質(zhì)量，因此，提高了生物相對EE2的吸附率。

3 結(jié)論

從氧化溝好氧段污泥中能夠激活富集得到錳氧化菌群。當(dāng)培養(yǎng)條件pH值為7.0、初始Mn2+濃度為1 mmol/L時(shí)，MnOB的激活效果最好，其對Mn2+的氧化率能夠達(dá)到90.15%。生成的生物氧化錳主要包含MnO2、Na3Mn（PO3）CO3、Mn3O4等3種物質(zhì)。激活反應(yīng)后，7個(gè)已知存在的MnOB屬，包括芽孢桿菌屬、微桿菌屬、氣單胞菌屬、假單胞菌屬、不動(dòng)桿菌屬、黃桿菌屬、鞘氨醇桿菌屬，豐度顯著提高，激活反應(yīng)后，其總豐度達(dá)到17.89%。pH值為4.0、生物氧化錳投加量為20 mg/L時(shí)，EE2的去除效果最好，48 h后試驗(yàn)組（生物氧化錳+生物相）對EE2的去除率可達(dá)97.7%，其中生物氧化錳的貢獻(xiàn)率達(dá)到76.9%。在中性條件下，試驗(yàn)組對EE2的去除率低于酸性條件，但仍可以達(dá)到85%，這為生活污水中的EE2的去除提供了一個(gè)高效可行的方向。參考文獻(xiàn)：

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（編輯 胡玲）