生脈注射液對(duì)創(chuàng)傷失血性休克大鼠免疫功能的影響

劉 星 王毅鑫 蘇文利

1.上海長(zhǎng)征醫(yī)院心內(nèi)科，上海 200003；2.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬普陀醫(yī)院急診科，上海 200062

對(duì)創(chuàng)傷失血性休克的研究長(zhǎng)期以來(lái)一直是臨床和科研工作者的熱點(diǎn)和難點(diǎn)問(wèn)題。隨著人們對(duì)休克微循環(huán)理論和創(chuàng)傷急救技術(shù)的提高，創(chuàng)傷失血性休克的早期死亡率已明顯下降，而后期因感染導(dǎo)致的死亡率則相對(duì)升高。近年來(lái)，人們已經(jīng)開(kāi)始密切關(guān)注創(chuàng)傷失血性休克后免疫功能的變化，并且從不同角度研究創(chuàng)傷失血性休克后免疫功能改變對(duì)機(jī)體的影響。目前臨床上對(duì)創(chuàng)傷失血性休克后免疫功能紊亂的防治主要集中在如何抑制過(guò)度的炎癥反應(yīng)、如何提高創(chuàng)傷后機(jī)體受抑制的免疫功能等方面。在尚未找到安全有效的免疫調(diào)節(jié)藥物基礎(chǔ)上，人們把目光逐漸轉(zhuǎn)向了中醫(yī)中藥研究。與西藥相比，中藥成分多樣化，藥理作用廣泛復(fù)合，不少中藥對(duì)免疫具有雙向調(diào)節(jié)作用，且副作用小，來(lái)源廣泛，價(jià)格便宜，有很大的利用空間，故其對(duì)免疫功能的作用正日益受到人們的重視。隨著中醫(yī)藥科研方法的進(jìn)步，很多補(bǔ)益類中藥，無(wú)論健脾、補(bǔ)腎、滋陰、壯陽(yáng)，只要用藥對(duì)證（指補(bǔ)虛藥針對(duì)虛證狀態(tài)），都可增強(qiáng)細(xì)胞免疫，這幾乎已成為補(bǔ)虛藥的共性。生脈注射液是目前研究較多的經(jīng)典方劑，本研究旨在探討大鼠創(chuàng)傷失血性休克后免疫功能的改變以及應(yīng)用生脈注射液后其免疫功能的變化情況，以期為臨床用藥及進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康SD（Sprague-Dawley）大鼠 30只，清潔級(jí)，雄性，體重（200±20）g，上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供[生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（滬）2003-0002]。分6籠飼養(yǎng)，每籠5只，標(biāo)準(zhǔn)鼠料喂養(yǎng)，自然光照，室溫22～26℃，濕度45%～65%，動(dòng)物自由攝水和進(jìn)食。適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后正式實(shí)驗(yàn)。

1.1.2 主要試劑 ①生脈注射液：江蘇蘇中藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司；規(guī)格：20 mL/瓶，批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字Z32021056。②小鼠抗大鼠CD3-FITC抗體：美國(guó)Invitrogen/Caltag公司提供；批號(hào)：83-MR5301。③小鼠抗大鼠CD4R-PE抗體：美國(guó)Invitrogen/Caltag公司提供：批號(hào)：83-MR5104。④小鼠抗大鼠CD8 PE-Cy5（PC5）抗體：美國(guó) Invitrogen/Caltag 公司提供；批號(hào)：83-MR5206。⑤溶血素（FCMlysing Solution 100T）：美國(guó)MBA公司提供；批號(hào)：11-MBA-LS01。⑥磷酸鹽緩沖液（PBS，PH=7.2～7.4）：福州邁新公司；批號(hào)：60906006OR。⑦0.9%氯化鈉注射液、林格液、2%戊巴比妥鈉、10%中性甲醛、肝素等，均為上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬普陀醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.3 主要儀器 流式細(xì)胞儀：美國(guó)BD公司；全自動(dòng)生化分析儀：7600-010型，日立儀器（蘇州）有限公司；低溫高速離心機(jī)：J2、HS型，美國(guó)Bekman公司；微量移液器：德國(guó)Eppendorf公司；手術(shù)器械：眼科剪、持針器、彎鉗、醫(yī)用縫線等。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 動(dòng)物被隨機(jī)分為3組，即正常對(duì)照組（A組），創(chuàng)傷失血性休克組（B組），生脈注射液治療組（C組），每組各10只。C組大鼠在造模手術(shù)開(kāi)始前2 d，腹腔注射生脈注射液，每日1次，每次3 mL，直至實(shí)驗(yàn)開(kāi)始后第3天為止，共5 d。B組在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前2 d，腹腔注射與生脈注射液治療組等體積的生理鹽水，每日1次，每次3 mL，直至實(shí)驗(yàn)開(kāi)始后第3天為止，共5 d。A組不予任何處理。各組大鼠分別于造實(shí)驗(yàn)開(kāi)始后的第3天處死，收集血液及胸腺、脾臟標(biāo)本。

1.2.2 動(dòng)物模型建立方法 參照龐榮清[1]、張勻等[2]的創(chuàng)傷失血性休克動(dòng)物模型制作方法[3]。①SD大鼠30只，實(shí)驗(yàn)前12 h禁食，4 h禁水，術(shù)前稱重，大鼠腹腔注射2%戊巴比妥鈉（45 mg/kg）麻醉，麻醉成功后固定于手術(shù)臺(tái)上。②失血：造模大鼠麻醉成功后剪開(kāi)右后肢皮膚及皮下組織，暴露股動(dòng)脈，于股動(dòng)脈按公式[4][鼠重（g）×75 mL/1000 mg×（0.2～0.3）]抽血（約5 mL），止血后無(wú)肉眼可見(jiàn)出血，縫合皮膚。③斷股骨：用夾鉗鉗夾大鼠雙側(cè)股骨中段，聽(tīng)到咔嚓聲后，手中有骨摩擦感，即造成大鼠雙側(cè)后肢股骨骨折。④手術(shù)完成后維持大鼠創(chuàng)傷失血性休克0.5 h，于陰莖靜脈補(bǔ)充失血量?jī)杀兜钠胶馊芤貉a(bǔ)充血容量。⑤大鼠末次給藥30 min后抽血處死，血液肝素抗凝后待檢。

1.2.3 血常規(guī)檢測(cè) 將肝素1∶25抗凝后的全血于采血后2 h內(nèi)用全自動(dòng)生化分析儀進(jìn)行血常規(guī)檢測(cè)，上機(jī)前搖勻，防止血液分層。觀察血常規(guī)中白細(xì)胞 （white bloodcell count，WBC）、淋巴細(xì)胞（lympholeukocyte，LY）、中性粒細(xì)胞（granulocyte，GR）比例變化。

1.2.4 T淋巴細(xì)胞亞群含量測(cè)定 將肝素1∶25抗凝后的全血于24 h內(nèi)進(jìn)行T細(xì)胞亞群含量測(cè)定。①取大鼠全血100 μL，放在分別標(biāo)有A、B、C的試管中。②A管分別放入CD3 FITC（為熒光素5-異硫酸鹽異構(gòu)體-Fluorescein Isothiocyanate，F(xiàn)ITC）和 CD4 PE（熒光巰基化藻紅蛋白-Phycoerythrin，PE）熒光標(biāo)記抗體，各20 μL；B管分別放入CD 3FITC和CD8 PC5（熒光藻紅蛋白染料-Phycoerythrin-Cy5，PC5）熒光標(biāo)記抗體，各20 μL；C管分別放入CD8 PC5和CD4 PE熒光標(biāo)記抗體，各 20 μL。③混勻后，室溫避光孵育 30 min。④于 A、B、C 試管中分別加入紅細(xì)胞裂解液2 mL，室溫避光孵育10 min。⑤于離心機(jī)1500 r/min離心5 min，去上清。⑥將10%PBS（磷酸鹽緩沖液-Phosphate Buffered Saline，PBS）溶液1 mL分別加入A、B、C試管中，充分混勻，于離心機(jī)1500 r/min離心5 min，去上清。⑦再次重復(fù)步驟“⑥”后，上機(jī)利用CELL Quest軟件進(jìn)行參數(shù)設(shè)定，獲取數(shù)據(jù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 15.0處理，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間均數(shù)差異經(jīng)方差齊性檢驗(yàn)，采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組大鼠治療后血常規(guī)變化比較

創(chuàng)傷失血性休克后，B組與A組比較，大鼠白細(xì)胞明顯升高（P=0＜0.05），其中淋巴細(xì)胞所占比例明顯下降（P=0.001＜ 0.05），中性粒細(xì)胞占比例明顯升高（P=0＜ 0.05）。說(shuō)明創(chuàng)傷失血性休克后，大鼠機(jī)體炎癥反應(yīng)較強(qiáng)，機(jī)體的免疫功能受到抑制。

生脈注射液治療后，C組白細(xì)胞總數(shù)較B組大鼠明顯下降 （P=0＜0.05），淋巴細(xì)胞所占比例明顯上升 （P=0.007＜0.05），中性粒細(xì)胞占比例有所下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.001＜0.05）。這一結(jié)果表明，生脈注射液可以減輕創(chuàng)傷失血性休克后過(guò)度的炎癥反應(yīng)，提高受抑制的免疫功能。見(jiàn)表1。

2.2 三組治療后T淋巴細(xì)胞亞群變化比較

統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，創(chuàng)傷失血性休克造成大鼠外周血中CD3+T淋巴細(xì)胞亞群含量下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.05）；予以生脈注射液治療后，C組大鼠外周血中CD3+T細(xì)胞總數(shù)較創(chuàng)傷失血性休克組大鼠明顯上升，且統(tǒng)計(jì)學(xué)意義顯著（P=0.001＜ 0.05）。

表1 三組大鼠治療后血常規(guī)變化比較（）

表1 三組大鼠治療后血常規(guī)變化比較（）

注：與 B 組比較，☆P ＜ 0.05，△P=0.001＜0.05，▲P=0.007 ＜0.05

A組B組C組1010104.230±0.856☆8.890±0.3876.290±0.758☆76.61±4.97△68.57±5.2374.85±4.12▲16.00±4.53☆26.15±2.9720.29±3.09☆組別 只數(shù) 白細(xì)胞（，×109/L）淋巴細(xì)胞（，%）中性粒細(xì)胞（，%）

同時(shí)，創(chuàng)傷失血性休克造成大鼠外周血中CD4+T淋巴細(xì)胞亞群含量下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.003＜0.05）；相反，CD8+T淋巴細(xì)胞亞群含量變化差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P=0.997＞0.05）；予以生脈注射液治療后，C組大鼠外周血中CD4+T細(xì)胞總數(shù)較創(chuàng)傷失血性休克組大鼠明顯上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.008＜ 0.05）。

創(chuàng)傷失血性休克導(dǎo)致大鼠細(xì)胞免疫功能紊亂，CD4+/CD8+比值下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000＜0.05）；與 B組大鼠相比，C組大鼠機(jī)體免疫功能相對(duì)平衡，CD4+/CD8+比值有所上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.001＜0.05）。見(jiàn)表2。

表2 三組治療后T淋巴細(xì)胞亞群變化比較（）

表2 三組治療后T淋巴細(xì)胞亞群變化比較（）

注：與 B 組比較，☆P=0 ＜ 0.05，★P=0.001 ＜ 0.05，△P=0.003 ＜ 0.05，▲P=0.008 ＜ 0.05，○P=0.997 ＞ 0.05，□P=0 ＜ 0.05，■P=0.001 ＜ 0.05

組別 只數(shù) CD3+T細(xì)胞（%）CD4+T細(xì)胞（%）CD8+T細(xì)胞（%） CD4+/CD8+A組B組C組10101041.97±2.50☆31.17±4.0036.64±5.73★15.51±3.48△10.49±1.4213.94±2.02▲17.34±3.77○17.75±5.9417.56±4.701.19±0.07□0.97±0.091.12±0.03■

3 討論

本實(shí)驗(yàn)的對(duì)照組實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，創(chuàng)傷失血性休克后大鼠的免疫功能處于紊亂狀態(tài)，機(jī)體處于過(guò)度的炎癥反應(yīng)（白細(xì)胞、中性粒細(xì)胞顯著升高）和免疫防御機(jī)能受抑制的狀態(tài)。主要表現(xiàn)為：淋巴細(xì)胞含量降低，CD3+、CD4+T細(xì)胞數(shù)量減少，CD4+/CD8+比值降低等。

為了使實(shí)驗(yàn)效果更加顯著，本實(shí)驗(yàn)在造模前2 d給予C組大鼠生脈注射液腹腔注射進(jìn)行干預(yù)，在造模結(jié)束后的第3天筆者觀察到：C組大鼠的體重、精神狀態(tài)等均較A、B組良好。血常規(guī)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，C組大鼠白細(xì)胞含量有所下降，淋巴細(xì)胞所占比例相對(duì)升高，中性粒細(xì)胞所占比例相應(yīng)下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這說(shuō)明與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組大鼠的免疫功能有所升高，機(jī)體的炎癥反應(yīng)有所減輕。這與以往對(duì)生脈注射液的研究結(jié)果一致。有人將生脈注射液應(yīng)用于慢性、頑固性心衰的治療后得出結(jié)論，生脈注射液可以使心衰患者血液中白細(xì)胞介素-6、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）的活性明顯降低[5-6]。廖澤云等[3]發(fā)現(xiàn)，生脈注射液可以調(diào)節(jié)骨髓造血系統(tǒng)、升高白細(xì)胞、刺激機(jī)體的造血能力，其作用和鯊肝醇相當(dāng)。本實(shí)驗(yàn)推測(cè)，創(chuàng)傷失血性休克大鼠應(yīng)用生脈注射液治療后，其白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞含量增高的可能機(jī)制與生脈注射液可以提高血液中IgG抗體含量，提高T淋巴細(xì)胞數(shù)目和增強(qiáng)巨噬細(xì)胞吞噬能力有關(guān)，其減輕炎癥反應(yīng)的作用同樣是因?yàn)門淋巴細(xì)胞及吞噬細(xì)胞的數(shù)目增加，促炎性細(xì)胞因子釋放減少而實(shí)現(xiàn)的[8]。另外，出現(xiàn)這一結(jié)果的原因還可能與生脈注射液與皮質(zhì)酮具有一定的量效關(guān)系有關(guān)[7]。

本研究還發(fā)現(xiàn)，生脈注射液對(duì)大鼠T淋巴細(xì)胞亞群變化亦可產(chǎn)生作用。應(yīng)用生脈注射液進(jìn)行治療后，創(chuàng)傷失血性休克大鼠外周血CD3+、CD4+T細(xì)胞含量顯著增加，CD4+/CD8+比值有所升高，并與對(duì)照組差異顯著。本實(shí)驗(yàn)得出結(jié)果印證了以上的研究報(bào)道。推測(cè)其作用機(jī)制可能與生脈注射液可以刺激大鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化，增加大鼠脾淋巴細(xì)胞產(chǎn)生IL-2的能力[8]以及生脈注射液可以使胸腺T細(xì)胞數(shù)量增加，使脾淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)性升高[9]；同時(shí)還刺激人體皮質(zhì)酮的分泌[10]有關(guān)。

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