373例婦女下生殖道微生物宏基因組鳥槍法測序分析

陳寧 ，陳晨，王小雨 ，陸瑞科，高紅琴，李少華，郝梨嵐，葉志強(qiáng)，趙倩，張韻紅*

女性生殖道中棲息著龐大的菌群，對(duì)女性生殖道健康起著極重要的作用，國內(nèi)外研究提示，菌群失衡與不孕、早產(chǎn)、宮頸癌等婦科疾病有密切關(guān)系。目前基于女性生殖道微生態(tài)系統(tǒng)研究多局限于16S rRNA基因高通量測序方法研究，使用16S rRNA基因擴(kuò)增子測序的研究在分類學(xué)上存在對(duì)微生物種水平的分辨率較低和缺乏物種特異性功能推斷能力的局限性[1]。宏基因組鳥槍法測序通過對(duì)微生物的全組DNA進(jìn)行測序分析，可以充分發(fā)現(xiàn)宏基因組序列和功能差異信息，不但能了解微生物群體的多樣性和豐度，還能發(fā)掘和研究具有特定功能的新基因[2]。本研究采用宏基因組鳥槍法測序，旨在探索女性生殖道微生物組和生殖道健康相關(guān)疾病的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

招募蘇州高新區(qū)2018年6～7月參與“兩癌”篩查項(xiàng)目的女性，年齡35～65周歲，現(xiàn)場充分知情告知并簽訂知情同意書者入組，然后進(jìn)行個(gè)人信息和樣本采集，個(gè)人信息進(jìn)行匿名處理。涉及臨床診斷相關(guān)資料來自“兩癌”篩查項(xiàng)目。資料和樣本齊全納入分析。

1.2 研究方法

1.2.1 樣本采集和處理 醫(yī)生在為入組志愿者進(jìn)行婦科檢查時(shí)，用無菌棉拭子在宮頸外口旋轉(zhuǎn)10～20圈，蘸取足量分泌物，置于專用微生物保存液常溫保存。兩周之內(nèi)寄往實(shí)驗(yàn)室-80℃冰箱保存待DNA提取。

1.2.2 微生物基因組總DNA提取及測序 采用美基生物通用型DNA抽提試劑盒(MagPure Universal DNA KF Kit)對(duì)樣本的DNA進(jìn)行提取，將提取好的DNA產(chǎn)物用賽默飛QubitTM雙鏈DNA高靈敏度熒光定量試劑盒(Qubit dsDNA HS assay kit)進(jìn)行定量。選取提取質(zhì)量合格的DNA樣本進(jìn)行測序文庫構(gòu)建，使用Covaris E220非接觸式超聲波破碎儀進(jìn)行核酸打斷，Axyge公司AxyPrep核酸分離試劑盒核酸純化，賽默飛ABI PCR儀進(jìn)行接頭連接等實(shí)驗(yàn)操作。測序文庫應(yīng)用DNBSEQTM測序技術(shù)在國產(chǎn)測序平臺(tái)DIPSEQ(華大生命科學(xué)院，深圳)進(jìn)行宏基因組鳥槍法測序(雙端測序，100bp)。

1.2.3 物種注釋及菌群類型 對(duì)測序數(shù)據(jù)進(jìn)行去除低質(zhì)量序列、去除人源序列以及利用MetaPhlAn2軟件進(jìn)行物種注釋。注釋結(jié)果選取種水平進(jìn)行分析，定義在一個(gè)樣本中相對(duì)豐度≥50%的物種為該樣本的優(yōu)勢種，并以此為該樣本的菌群類型，沒有物種的相對(duì)豐度≥50%的類型定義為混合類型(Diverse類型)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用R統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)檢測數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)數(shù)資料以百分比表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 人群分布特點(diǎn)

本研究通過蘇州高新區(qū)“兩癌”篩查項(xiàng)目，招募了年齡在35～65歲之間的373例女性，平均(46±7.6)歲，年齡分布如圖1A所示。其中絕經(jīng)期女性有96例，占整個(gè)人群的25.74% (圖1B)。該人群孕產(chǎn)史如圖1C,D所示，幾乎所有女性都有過孕產(chǎn)經(jīng)歷(≥99%)。對(duì)于育齡期女性，統(tǒng)計(jì)其半年內(nèi)使用的避孕方式，依次為：避孕套(63.10%)，宮內(nèi)節(jié)育器(29.52%)，結(jié)扎(1.48%)，還有5.90%的人群沒有進(jìn)行避孕(圖1E)，圖1見彩插2。

2.2 下生殖道菌群分布特點(diǎn)

373例女性的微生物在種水平的分布情況如圖2所示(見彩插2)，惰性乳桿菌、卷曲乳桿菌和加德納菌是在人群中占比最高的三種菌，以它們?yōu)橹鲗?dǎo)菌(相對(duì)豐度在樣本中≥50%)的，分別占人群的20%，15%和13%。其中惰性乳桿菌和卷曲乳桿菌屬于益生菌，它們?yōu)榕缘年幍拉h(huán)境提供酸性環(huán)境，抑制有害菌的生長。而加德納菌是細(xì)菌性陰道病發(fā)病密切相關(guān)的重要種屬之一。人群中有38%的女性為Diverse類型，即在她們陰道內(nèi)沒有明顯的主導(dǎo)菌，是由多種微生物共存的狀態(tài)。此外，在人群中還檢測出了有皰疹病毒(human herpesvirus)和HPV病毒(human papillomavirus)感染的個(gè)體。

2.3 育齡期婦女和絕經(jīng)期婦女的陰道菌群比較

對(duì)育齡期婦女和絕經(jīng)期女性的菌群類型進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)有明顯差異。惰性乳桿菌型、卷曲乳桿菌型在絕經(jīng)期女性中銳減，僅占11.46%和5.21%，遠(yuǎn)低于育齡女性，而Diverse型絕經(jīng)期明顯高于育齡期，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，加德納菌型占比與育齡期婦女占比比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，詳見下頁表1。

表1 育齡期與絕經(jīng)期婦女陰道菌群類型差異比較 [例(%)]

2.4 育齡期女性不同避孕方式對(duì)陰道菌群影響

本項(xiàng)目研究人群中，育齡期女性主要采用避孕套和宮內(nèi)節(jié)育器的避孕方式(圖1E)。研究發(fā)現(xiàn)采用不同避孕方式的女性陰道菌群有明顯的差異，使用宮內(nèi)節(jié)育器避孕的女性Diverse型比例高于采用避孕套避孕的女性，加德納菌型的占比低于采用避孕套避孕的女性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，詳見下頁表2。

表2 避孕套和宮內(nèi)節(jié)育器對(duì)育齡女性陰道菌群類型差異比較[例(%)]

3 討論

陰道環(huán)境是復(fù)雜的各種因素相互作用的結(jié)果。微生物與上皮細(xì)胞之間的相互作用形成黏膜免疫，微生物的組成對(duì)于維持健康的陰道環(huán)境起著獨(dú)特的作用[3]。乳桿菌被認(rèn)為是最重要的陰道微生物，乳桿菌產(chǎn)生的乳酸維持陰道較低的pH值，抑制有害菌的繁殖。而目前公認(rèn)為的“不健康”的菌群環(huán)境，是以少乳桿菌、多厭氧菌共存的環(huán)境，微生物的物種多樣性較高[4]。“不健康”的菌群環(huán)境會(huì)導(dǎo)致生殖道感染及增加一些婦科疾病的發(fā)生概率，如細(xì)菌性陰道病、性傳播疾病、早產(chǎn)等[5-7]。目前對(duì)下生殖道的研究大多采用16S rRNA基因測序，同時(shí)主要集中于對(duì)育齡期女性的菌群分析。Ravel等[8]對(duì)396例來自5個(gè)種族的育齡女性的陰道菌群進(jìn)行16S rRNA基因測序，發(fā)現(xiàn)陰道菌群主要分為5種類型，四種以乳桿菌為主，分別是卷曲乳桿菌、惰性乳桿菌、詹氏乳桿菌、加氏乳桿菌，以及第5種是以低乳桿菌，高比例的厭氧菌為主，包括加德納菌、陰道阿托波氏菌、二路普雷沃爾菌等多種菌并存(Diverse型)。其中Diverse型被認(rèn)為是“不健康”的菌群環(huán)境，更容易導(dǎo)致陰道炎癥的發(fā)生。他們的研究結(jié)果同時(shí)也顯示，不同的種族，在陰道菌群上也呈現(xiàn)差異。對(duì)于96例亞洲女性來說，惰性乳桿菌型比例最高，占人群的42.7%。卷曲乳桿菌型和Diverse型分別占25%和19.8%。Chen等[9]對(duì)110例育齡期女性上下生殖道多個(gè)部位進(jìn)行采樣，并分析不同部位之間菌群的差異，結(jié)果顯示，同一個(gè)體陰道1/3處、陰道后穹隆以及宮頸管的菌群相似度非常高，而宮頸管作為一個(gè)連接上下生殖道的關(guān)鍵部位，其菌群具有更大的預(yù)測子宮類疾病的潛能，如對(duì)子宮內(nèi)膜異位癥導(dǎo)致的不孕、子宮腺肌病等患病可能性的預(yù)測。因此，本研究主要以宮頸菌群為代表來研究下生殖道菌群。

相比于目前國內(nèi)外在下生殖道菌群的研究情況，本研究選取的研究對(duì)象具有更大的年齡跨度(35～65歲)，包含育齡期女性和絕經(jīng)期女性。此外，國內(nèi)外對(duì)于生殖道菌群的研究多采用16S rRNA基因的高通量測序，而16S rRNA基因擴(kuò)增測序法在技術(shù)上具有很多的局限性，其一，依賴于PCR擴(kuò)增存在一定的偏向性；其二，讀長只覆蓋該基因的部分高變區(qū)，短序列很難從種或亞種水平進(jìn)行區(qū)分；其三，檢測的對(duì)象均為細(xì)菌，無法達(dá)到細(xì)菌、真菌、古生菌、病毒等所有微生物全覆蓋。由于生殖道樣本具有極高的宿主率(約99%)，使獲得足夠有效宏基因組數(shù)據(jù)量的研究成本大幅度提高，大規(guī)模宏基因組研究難以開展。目前已公開發(fā)表的數(shù)據(jù)中女性下生殖道的宏基因組數(shù)據(jù)總和不足千例，而對(duì)中國女性的下生殖道宏基因組數(shù)據(jù)僅有一篇2018年Li等[10]發(fā)表在自然通訊(Nature Communications)上。本研究采用宏基因組鳥槍法測序技術(shù)，從細(xì)菌、真菌、病毒等多維度系統(tǒng)描繪蘇州地區(qū)的女性下生殖道菌群結(jié)構(gòu)，目前國內(nèi)外使用此法研究基本空白，因此采用此技術(shù)是本研究項(xiàng)目的一個(gè)創(chuàng)新點(diǎn)和突破點(diǎn)。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)蘇州高新區(qū)女性生殖道菌群主要為4種類型，惰性乳桿菌型、卷曲乳桿菌型、加德納菌型和Diverse類型，分別占人群的20%、15%、13%和38%。與Ravel只針對(duì)育齡期女性下生殖道菌群結(jié)果相比，本人群中乳桿菌型比例大大降低，這與其中包含約1/4比例的絕經(jīng)期女性有關(guān)。此外，本研究在檢測中還發(fā)現(xiàn)在以前研究中罕有報(bào)道的一些非細(xì)菌的信息，如病毒(pepper vein yellows virus)，皰疹病毒(human herpesvirus)，HPV病毒(alpha papillomavirus)等，這些非細(xì)菌信息的檢測豐富了女性生殖道微生態(tài)圖譜。本研究人群中，有39例女性在兩癌篩查中HPV呈現(xiàn)陽性，而基于宏基因組鳥槍法測序結(jié)果對(duì)HPV病毒也能直接檢出，這提示后續(xù)可通過該方法將HPV與其他微生物相組合，尋找某種能提高宮頸癌發(fā)生發(fā)展預(yù)測準(zhǔn)確性的標(biāo)志物組合，從而提高宮頸癌的篩查效率。

此外，本研究中還收集了孕產(chǎn)史、絕經(jīng)情況、避孕方式等表型信息，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)陰道微生物與年齡、避孕方式的選擇有密切的關(guān)聯(lián)。絕經(jīng)期女性生殖道菌群中的乳桿菌型即惰性乳桿菌型和卷曲乳桿菌型比育齡期女性中的占比明顯減少，而多為Diverse型。說明絕經(jīng)期女性乳桿菌含量降低，陰道的酸性環(huán)境減弱，開始出現(xiàn)多種菌并存的現(xiàn)象，不同于育齡期女性的菌群結(jié)構(gòu)比較健康，多以乳桿菌為主。這也與目前相關(guān)研究顯示未絕經(jīng)期的女性比絕經(jīng)期的女性的微生物更單一，乳酸菌含量比絕經(jīng)期女性更高的結(jié)果一致，未絕經(jīng)期婦女的雌激素水平較高，較高的雌激素和糖原水平會(huì)促進(jìn)陰道分層鱗狀上皮和保護(hù)性黏液層的厚度增加，而充足的糖原為乳桿菌提供營養(yǎng)，從而維持乳酸菌在較高水平，乳桿菌分泌乳酸，維持陰道較低的pH，從而抑制各種有害菌的生長。絕經(jīng)后，雌激素水平下降，糖原和陰道上皮減少，乳酸桿菌含量開始減少，pH相對(duì)增高，導(dǎo)致各種雜菌在種類和含量都有所增加[11]，從微生物菌群角度描繪絕經(jīng)期女性生殖道健康狀態(tài)，并降低其他

感染疾病的風(fēng)險(xiǎn)或?yàn)榕R床關(guān)注和研究提供新的理論和證據(jù)。另外本研究結(jié)果顯示，不同的避孕方式(如男用避孕套和宮內(nèi)節(jié)育器)也會(huì)引起生殖道微生物的變化。相對(duì)于使用宮內(nèi)節(jié)育器女性，使用避孕套的女性卷曲乳桿菌型占比增多，同時(shí)多種雜菌減少，即Diverse型降低，這與之前的研究保持一致[12]，這種避孕方式對(duì)于女性的陰道菌群健康更加有利，能更好地維持陰道菌群健康。本研究從下生殖道菌群的角度出發(fā)，為女性在避孕方式的選擇上提供指導(dǎo)。

越來越多證據(jù)表明，生殖道微生物群在婦女健康和生殖功能的重要性。本研究通過宏基因組鳥槍法對(duì)中國蘇州高新區(qū)女性的下生殖道菌群進(jìn)行了分析，構(gòu)建了比較完整的陰道微生物圖譜。同時(shí)發(fā)現(xiàn)一些影響菌群變化的因素，如絕經(jīng)、避孕方式，為后續(xù)女性生殖道與婦科疾病的關(guān)聯(lián)分析提供了重要的參考依據(jù)。