石墨烯對(duì)大腸桿菌和肺炎克雷伯桿菌耐藥基因接合轉(zhuǎn)移的影響和機(jī)制探索研究

彭雪霞, 魏 飛, 王麗芳, 董輝偉, 譚 蓉, 程春燕, 楊 棟*, 李君文*

(濱州醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生與管理學(xué)院， 山東煙臺(tái) 264000)

抗生素主要是由細(xì)菌、霉菌或其他微生物產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物或人工合成的類似物，能夠抑制微生物的生長(zhǎng)甚至將它們殺死，在防治細(xì)菌性疾病方面，抗生素發(fā)揮了至關(guān)重要的作用，人類在醫(yī)療、食品、農(nóng)業(yè)等方面頗有受益〔1-3〕。現(xiàn)如今抗生素已成為全球已成為當(dāng)前最常用的藥物，隨著抗生素在臨床上的引入和濫用〔4〕，在抗生素選擇壓力下不可避免地會(huì)產(chǎn)生耐藥性，人類也在不斷地尋求新的抗菌藥物〔5〕。目前研究發(fā)現(xiàn)臨床、飲用水、廢水、土壤等環(huán)境中均存在著大量的耐藥菌和耐藥基因〔6-10〕，更加表明抗生素的濫用引發(fā)的抗生素耐藥問(wèn)題日趨嚴(yán)重。 至今為止，研究發(fā)現(xiàn)細(xì)菌間發(fā)生基因水平轉(zhuǎn)移的主要方式有 3 種，環(huán)境中最常見(jiàn)的方式為接合轉(zhuǎn)移〔11〕。目前認(rèn)為土壤、污水、生活垃圾和醫(yī)院垃圾混合的污水處理廠是耐藥基因傳播的重要場(chǎng)所〔12〕。納米材料作為一種可能的環(huán)境污染物質(zhì)，其安全問(wèn)題受到全世界的廣泛關(guān)注〔13〕，且目前研究發(fā)現(xiàn)納米材料能促進(jìn)環(huán)境中耐藥基因進(jìn)行水平轉(zhuǎn)移〔14〕。石墨烯是一種具有獨(dú)特的二維碳原子單層納米結(jié)構(gòu)的材料,有優(yōu)異的導(dǎo)熱性、導(dǎo)電性以及吸附性而被廣泛應(yīng)用〔15-16〕，且隨著石墨烯的大量生產(chǎn)和使用，特別是應(yīng)用于基礎(chǔ)設(shè)施建設(shè)環(huán)境中，將會(huì)導(dǎo)致其大量殘留，可能對(duì)環(huán)境中耐藥基因的擴(kuò)散產(chǎn)生影響。本研究以大腸埃希菌和肺炎克雷伯桿菌為研究對(duì)象，在一定條件下探討石墨烯對(duì)耐藥基因水平轉(zhuǎn)移的影響及規(guī)律。

1 材料與方法

1.1 菌株與試劑

1.1.1菌株 研究中采用的菌株為帶有RP4質(zhì)粒的大腸埃希菌E.coli MG1655，是目前研究結(jié)合轉(zhuǎn)移常見(jiàn)的供體菌之一，該菌株攜帶卡那霉素、氨芐青霉素和四環(huán)素抗性基因。研究中的受體菌是具有美羅培南抗性基因的肺炎克雷伯桿菌，實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2石墨烯及相應(yīng)濃度貯備液的配置 石墨烯G835836購(gòu)自麥克林試劑網(wǎng)，純度≥99%。用電子分析天平(型號(hào)：AE2460S)分別稱取0.2 g、0.1 g、0.05 g、0.025 g、0.0125 g、0.006 g、0.002 g石墨烯，每份均加入高壓好的PBS(磷酸鹽緩沖液)10 ml震蕩搖勻，使之濃度分別達(dá)到20 mg/ml、10 mg/ml、5 mg/ml、2.5 mg/ml、1.25 mg/ml、0.6 mg/ml、0.2 mg/ml，常溫放置備用。

1.1.3培養(yǎng)基 (1)LB培養(yǎng)基：LB肉湯Miller，購(gòu)自美國(guó)BD公司。用分析天平準(zhǔn)確稱取25 gLB肉湯粉末，加無(wú)菌蒸餾水定容至1 L，高壓121 ℃滅菌20 min后冷卻備用。 (2)LB瓊脂培養(yǎng)基：LB肉湯Miller(美國(guó)BD公司)、瓊脂粉15 g(北京索萊寶科技有限公司)，加蒸餾水定容至1 L，高壓121 ℃、20 min滅菌后放入電熱鼓風(fēng)干燥箱55 ℃?zhèn)溆谩Ｊ褂们爸蠓?，待冷卻至50 ℃左右加入抗生素混勻后使用。

1.1.4抗生素 實(shí)驗(yàn)所用鹽酸四環(huán)素溶液50 mg/ml采自生工生物工程上海有限股份有限公司，美羅培南三水標(biāo)準(zhǔn)品采自北京索萊寶科技有限公司。配制美羅培南三水標(biāo)準(zhǔn)品溶液，用電子分析天平(型號(hào)：AE2460S)標(biāo)準(zhǔn)稱取0.05 g美羅培南加入10 ml無(wú)菌蒸餾水溶解，使之溶度達(dá)到5 mg/ml。四環(huán)素和美羅培南均用 0.22 μm 微孔濾膜過(guò)濾后分裝，凍存于-20 ℃冰箱備用。

1.1.5試劑及實(shí)驗(yàn)器材 (1)試劑：PBS磷酸鹽緩沖液(PH7.2-7.4)，購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。取緩沖液一包，加入2 L無(wú)菌蒸餾水溶解，高壓121 ℃滅菌20 min 后冷卻備用。 (2)實(shí)驗(yàn)器材：15 ml離心管、10 ml離心管、30 ml離心管、1 L及2 L圓椎瓶、培養(yǎng)皿、離心機(jī)(ΜNIVERSAL)、微型漩渦混合儀(XW-80A)、臺(tái)式恒溫震蕩器(QE-1)等。

1.2 液相接合將大腸埃希菌接種于含有40 μg/ml四環(huán)素LB培養(yǎng)基中，同時(shí)肺炎克雷伯桿菌接種于含有2 μg/ml美羅培南的LB培養(yǎng)基中，在37 ℃下150 r/min振蕩過(guò)夜培養(yǎng)16 h后，在6000 r/min下離心5 min，棄去上清后用滅菌的PBS溶液離心洗滌菌液2次，用PBS重懸菌液后測(cè)定OD 600，根據(jù)OD值調(diào)整菌液至特定密度后備用，并立即進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.1石墨烯濃度對(duì)大腸埃希菌和肺炎克雷伯桿菌耐藥基因接合轉(zhuǎn)移的影響 均取等體積、等密度的供體菌和受體菌各4.75 ml 菌液1∶1混合均勻，在各制備好的懸液中加入石墨烯懸液0.5 ml(處理組)、PBS磷酸緩沖液0.5 ml(對(duì)照組)，使體系中石墨烯終濃度分別為0 μg/ml、1000 μg/ml、500 μg/ml、250 μg/ml、125 μg/ml、62.5 μg/ml、30 μg/ml、10 μg/ml，各體系震蕩搖勻，在37 ℃電熱恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8 h，其中每隔2 h震蕩搖勻一次。作用8 h后后取出進(jìn)行接合子篩選。

1.2.2初始菌濃度對(duì)石墨烯對(duì)大腸埃希菌和肺炎克雷伯桿菌耐藥基因接合轉(zhuǎn)移的影響 取9.5 ml初始菌密度分別為109、108、107、106的混合(1∶1)菌液各4份，向其中3份(設(shè)置3個(gè)平行)中加入0.5 ml濃度為10 mg/ml的石墨烯貯備液使其終濃度達(dá)到500 μg/ml，另外1份中加入0.5 mlPBS作為空白對(duì)照。將所有接合菌液混勻后，迅速放置到37 ℃的電熱恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行接合，接合8h后取出進(jìn)行接合子篩選。

1.3 接合子的篩選水平接合轉(zhuǎn)移結(jié)束后將菌液按梯度稀釋后傾注在雙抗LB培養(yǎng)基選擇平板上，放于37 ℃電熱恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36 h后計(jì)算接合子數(shù)，并計(jì)算耐藥基因水平轉(zhuǎn)移率。 為檢驗(yàn)選擇培養(yǎng)基平板上篩選的耐藥細(xì)菌均為接合子，排除大腸埃希菌或肺炎克雷伯桿菌自發(fā)突變子的干擾，每次實(shí)驗(yàn)在設(shè)立上述組別的同時(shí)還分別設(shè)立單獨(dú)大腸埃希菌對(duì)照組和 單獨(dú)肺炎克雷伯桿菌對(duì)照組，處理及篩選方法與接合組相同。

1.4 接合子驗(yàn)證每項(xiàng)實(shí)驗(yàn)均在雙抗選擇培養(yǎng)基平板上隨機(jī)挑取3個(gè)單個(gè)接合子菌落，培養(yǎng)在含有40 μg/ml四環(huán)素和2 μg/ml美羅培南的LB培養(yǎng)基中，放于臺(tái)式恒溫震蕩器中37 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，觀察接合子生長(zhǎng)情況。

1.6 統(tǒng)計(jì)方法處理采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析或非參數(shù)秩和檢驗(yàn)，有顯著性差異后使用Dunnett檢驗(yàn)比較實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的差異，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 石墨烯濃度對(duì)大腸埃希菌和肺炎克雷伯桿菌耐藥基因接合轉(zhuǎn)移的影響石墨烯(濃度范圍10 μg/ml-1000 μg/ml)對(duì)大腸桿菌和肺炎克雷伯桿菌耐藥基因接合轉(zhuǎn)移的影響(如圖1所示)?？瞻讓?duì)照組的接合轉(zhuǎn)移頻率約為2×10-5，濃度為10 μg/ml的石墨烯與空白對(duì)照無(wú)顯著差異。加入濃度分別1000 μg/ml、500 μg/ml、250 μg/ml、125 μg/ml、62.5 μg/ml、30 μg/ml的石墨烯干預(yù)接合轉(zhuǎn)移后，接合轉(zhuǎn)移頻率與空白對(duì)照組相比明顯升高，最高為濃度500 μg/ml，達(dá)到空白對(duì)照組60倍左右。隨著石墨烯濃度逐漸升高，接合轉(zhuǎn)移頻率呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢(shì)，在濃度為500 μg/ml的時(shí)候達(dá)到高峰。當(dāng)石墨烯濃度達(dá)1000 μg/ml時(shí)仍能促進(jìn)接合轉(zhuǎn)移，但是其促進(jìn)作用要低于500 μg/ml，但依然高于空白對(duì)照組。這些結(jié)果均表明石墨烯可以促進(jìn)大腸埃希菌和肺炎克雷伯桿菌的接合轉(zhuǎn)移，且結(jié)合轉(zhuǎn)移頻率與濃度相關(guān)。

圖1 石墨烯濃度對(duì)大腸埃希菌和肺炎克雷伯桿菌耐藥基因接合轉(zhuǎn)移的影響

在石墨烯對(duì)大腸埃希菌和肺炎克雷伯桿菌耐藥基因接合轉(zhuǎn)移的影響中，石墨烯可以促進(jìn)接合轉(zhuǎn)移過(guò)程。與對(duì)照組相比，石墨烯濃度為1000 μg/ml、500 μg/ml、250 μg/ml、125 μg/ml、62.5 μg/ml、30 μg/ml時(shí)能明顯促進(jìn)接合轉(zhuǎn)移過(guò)程，且差異有顯著性意義(*P<0.05、**P<0.01)，濃度為10 μg/ml也能明顯促進(jìn)接合轉(zhuǎn)移過(guò)程，但差異無(wú)顯著性差異(P>0.05)

2.2 初始菌濃度對(duì)大腸埃希菌和肺炎克雷伯桿菌耐藥基因接合轉(zhuǎn)移的影響在石墨烯濃度為500 μg/ml時(shí)，初始菌濃度對(duì)石墨烯對(duì)大腸埃希菌和肺炎克雷伯桿菌耐藥基因接合轉(zhuǎn)移的影響(如圖2所示)。接合菌液濃度為106-109CFU/ml時(shí)，隨著接合菌液濃度的升高，接合轉(zhuǎn)移頻率明顯呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)，109CFU/ml時(shí)達(dá)到相應(yīng)空白對(duì)照組的70倍左右。當(dāng)接合菌濃度約為106CFU/ml時(shí)，空白對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組無(wú)顯著差異。結(jié)果均表明石墨烯可以促進(jìn)大腸埃希菌和肺炎克雷伯桿菌耐藥基因的接合轉(zhuǎn)移，且結(jié)合轉(zhuǎn)移頻率與初始菌液濃度相關(guān)。

圖2 初始菌濃度對(duì)大腸埃希菌和肺炎克雷伯桿菌耐藥基因接合轉(zhuǎn)移的影響

2.3 接合子驗(yàn)證每項(xiàng)實(shí)驗(yàn)隨機(jī)挑取的3個(gè)單個(gè)接合子菌落在含有40 μg/ml四環(huán)素和2 μg/ml美羅培南的LB培養(yǎng)基均生長(zhǎng)良好。將接合子清洗2遍后將菌液按梯度稀釋后傾注在雙抗LB培養(yǎng)基選擇平板上，放于37 ℃電熱恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，均有良好生長(zhǎng)。

在初始菌濃度對(duì)石墨烯對(duì)大腸埃希菌和肺炎克雷伯桿菌耐藥基因接合轉(zhuǎn)移的影響中。接合菌液濃度為106-109cfu/ml時(shí)，隨著接合菌液濃度的升高，接合轉(zhuǎn)移頻率明顯呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)，且107-109cfu/ml時(shí)與對(duì)照組相比，有顯著性差異(*P<0.05、**P<0.01)。當(dāng)接合菌濃度約為106cfu/ml時(shí)，空白對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組無(wú)明顯差異(P>0.05)。

3 討論

石墨烯可以顯著地促進(jìn)大腸埃希菌和肺炎克雷伯桿菌耐藥基因的接合轉(zhuǎn)移，在石墨烯濃度為10 μg/ml-500 μg/ml時(shí)，隨著石墨烯濃度的升高，結(jié)合轉(zhuǎn)移的促進(jìn)作用逐漸增強(qiáng)；在濃度為500 μg/ml-1000 μg/ml時(shí)，促進(jìn)作用又開(kāi)始逐漸減弱，但也明顯超過(guò)對(duì)照組。在接合條件為37 ℃、菌液濃度為108CFU/ml、結(jié)合時(shí)間為8 h的作用體系下，石墨烯濃度為250 μg/ml時(shí)，接合轉(zhuǎn)移頻率較對(duì)照組上升約40倍左右，500 μg/ml 石墨烯干預(yù)下產(chǎn)生的接合轉(zhuǎn)移頻率最高，是空白對(duì)照組的60倍左右，隨后開(kāi)始下降。在石墨烯濃度為500 μg/ml、初始菌濃度為106-109cfu/ml時(shí)，均對(duì)大腸埃希菌和肺炎克雷伯桿菌耐藥基因接合轉(zhuǎn)移有明顯的促進(jìn)作用。且隨著接合菌液濃度的升高，接合轉(zhuǎn)移頻率明顯呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)，109CFU/ml時(shí)達(dá)到相應(yīng)空白對(duì)照組的70倍左右，當(dāng)接合菌濃度約為106CFU/ml時(shí)，空白對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組無(wú)顯著差異，此結(jié)果與一些研究成果相似〔17〕。

已有一些研究表明，納米材料可以促進(jìn)細(xì)菌的接合轉(zhuǎn)移過(guò)程。主要是通過(guò)納米材料激發(fā)細(xì)菌的氧化抗氧化反應(yīng)，影響細(xì)菌細(xì)胞膜的通透性，為供體菌和受體菌的細(xì)胞膜融合和DNA 跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)提供適當(dāng)?shù)臈l件。納米材料可以產(chǎn)生活性氧(ROS)進(jìn)而破壞細(xì)胞膜、損害DNA，對(duì)細(xì)菌有殺傷作用，導(dǎo)致細(xì)菌死亡〔18-19〕。適當(dāng)?shù)募{米材料濃度能顯著地促進(jìn)細(xì)菌的接合轉(zhuǎn)移過(guò)程，高于一定濃度時(shí)促進(jìn)效率則降低〔14〕。也有研究表明，trbBp基因和trfAp基因是調(diào)控RP4接合轉(zhuǎn)移的兩個(gè)主要的調(diào)控基因〔20〕，納米Al2O3可以促進(jìn)這些基因的表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)結(jié)合轉(zhuǎn)移過(guò)程〔14〕，石墨烯作為納米材料中的一種，它是否也可促進(jìn)這些基因的表達(dá)從而促進(jìn)接合轉(zhuǎn)移過(guò)程，這一結(jié)果還有待下一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。石墨烯除了具備納米特性，還在工業(yè)領(lǐng)域中應(yīng)用來(lái)提高其他材料的韌性〔21〕，不知這其中除了納米材料促進(jìn)結(jié)合轉(zhuǎn)移之外，是否還存在石墨烯充當(dāng)分散劑提供供、受體菌之間的連接從而促進(jìn)接合轉(zhuǎn)移過(guò)程，這些問(wèn)題都有待深一步的探討。