沉默LncRNA TUG1對骨肉瘤細胞放射敏感性影響

邵 林，李同相，肖 睿，王冰玲，鄧焰軍

（宜賓市第一人民醫(yī)院a:骨二科；b:整形燒傷科，四川宜賓644000）

骨肉瘤屬于骨原發(fā)性惡性腫瘤，其主要特點為侵襲性強、致死率高、致殘率高及預(yù)見性差，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量［1］。目前放射治療是治療骨肉瘤的主要手段，但放射抵抗明顯降低其治療效果［2］。因此增強骨肉瘤患者放射敏感性成為亟待解決的問題。長鏈非編碼RNA?；撬嵘险{(diào)基因1（long non-coding RNA taurine upregulated gene1,LncRNA TUG1）在骨肉瘤中的表達與骨肉瘤預(yù)后不良及病情有關(guān)［3］。長鏈非編碼的RNA TUG1通過在骨肉瘤細胞中充當(dāng)mir-335-5p的ceRNA而促進遷移和侵襲［4～6］。然而，TUG1對骨肉瘤放射敏感性的影響仍然未知。因此本研究主要探討放射抵抗的骨肉瘤細胞中TUG1變化對骨肉瘤細胞凋亡及放射敏感性的影響，分析其是否可通過吸附miR-328-3p而發(fā)揮作用以期為骨肉瘤治療提供新靶點。

1 材料與方法

1.1 細胞與主要試劑

人成骨細胞hFOB 1.19由上海通派生物科技有限公司提供，骨肉瘤細胞HOS由上海賽默生物科技發(fā)展有限公司提供。

RPMI 1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶、胎牛血清均購自美國Gibco公司；Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑購自美國 Invitrogen公司；si-TUG1、miR-328-3p mimic、miR-328-3p inhibitor及其陰性對照質(zhì)粒均購自上海吉瑪生物科技有限公司；凋亡檢測試劑盒購自美國Sigma公司；Trizol試劑購自北京索萊寶公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒與SYBR G人PCR Master Mix試劑盒均購自美國ABI公司。

1.2 細胞處理

室溫使用X射線放療機（6 MeV X）射線垂直照射細胞，照射劑量率為2.0 Gy/min，調(diào)整靶皮距（70 cm），照射劑量為600 cGy/次，培養(yǎng)12 h，用0.25%胰蛋白酶消化存活細胞，消化細胞進行傳代培養(yǎng)，以上過程重復(fù)5次后將其命名為HOS-R細胞。

HOS-R細胞生長融合度達50%～80%時參照Li?pofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑說明書，將si-TUG1、miR-328-3p mimic及其相應(yīng)陰性對照轉(zhuǎn)染入HOS-R細胞，分別命名為沉默對照組、沉默TUG1組、過表達miR-NC組、過表達miR-328-3p組。再進行si-TUG1與miR-NC共轉(zhuǎn)染，命名為TUG1+抑制miRNC組；si-TUG1與miR-328-3p inhibitor共轉(zhuǎn)染，命名為沉默TUG1+抑制miR-328-3p組。轉(zhuǎn)染前1 d將培養(yǎng)基更換為Opti-MEM減血清培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染6 h后棄轉(zhuǎn)染液并將細胞培養(yǎng)基更換為含有10%胎牛血清的 RPMI 1640 完全培養(yǎng)基培養(yǎng)［7］。

1.3 檢測指標(biāo)

1.3.1 照射與克隆形成試驗

收取生長良好的HOS細胞與HOS-R細胞接種于6孔板，放入37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，用0、2、4、6、8 Gy不同照射劑量照射細胞，若出現(xiàn)細胞克隆團終止培養(yǎng)，用PBS洗滌3次×10 min，采用甲醇固定，20 min后用吉姆薩染色，40 min后用清水洗滌，置于顯微鏡下觀察有效克隆數(shù)。繪制放射存活曲線圖。

1.3.2 qRT-PCR檢測

收集hFOB 1.19、HOS、HOS-R細胞及轉(zhuǎn)染各組HOS-R細胞，分別加入Trizol試劑提取RNA，并按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA，qRT-PCR法檢測TUG1、miR-328-3p相對表達量。

1.3.3 細胞凋亡檢測

HOS-R細胞經(jīng)4Gy劑量照射48 h后用預(yù)冷PBS洗滌細胞，加入100 μl 1×Binding Buffer重懸細胞，調(diào)整細胞密度（2×105個細胞/ml），取 195 μl細胞懸液依次加入 5 μl Annexin V-FITC（避光孵育 15 min，1 000 r/min轉(zhuǎn)速離心3 min）與5 μl PI（避光孵育15 min），放入流式細胞儀檢測細胞凋亡。

1.3.4 基因雙熒光素酶檢測

將含有miR-328-3p結(jié)合位點的TUG1 3'UTR序列及其突變體插入熒光素酶報告基因載體中得到TUG1-Wt、TUG1-Mut，同時將HOS-R細胞接種于24孔板，待細胞生長融合度達80%左右時分別將miR-328-3p mimic或 miR-NC與 TUG1-Wt、TUG1-Mut共轉(zhuǎn)染HOS-R細胞，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后收集細胞，根據(jù)雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒說明書測定相對熒光素酶活性。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 放射抵抗的骨肉瘤細胞中TUG1高表達

細胞存活分?jǐn)?shù)與TUG1表達檢測結(jié)果見圖1。放射后HOS-R骨肉瘤細胞存活分?jǐn)?shù)顯著高于HOS細胞存活分?jǐn)?shù)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。Gy為2時（P<0.001），Gy為 4時（P<0.001），Gy為 6時（P<0.001），Gy為8時（P<0.001）；HOS與HOS-R細胞中TUG1表達水平均顯著高于人成骨細胞hFOB 1.19（P<0.001），HOS-R細胞中TUG1表達水平顯著高于HOS細胞（P<0.001）。

圖1 放射抵抗的骨肉瘤細胞中TUG1的表達 1a:骨肉瘤細胞和放射抵抗的骨肉瘤細胞的放射存活曲線圖 1b:人成骨細胞hFOB 1.19和骨肉瘤細胞、放射抵抗的骨肉瘤細胞中TUG1的表達情況，與骨肉瘤細胞相比，aP<0.05；與hFOB 1.19細胞相比，bP<0.05

2.2 沉默TUG1增加HOS-R細胞的放射敏感性

沉默對照組TUG1的表達量為（1.01±0.07），沉默TUG1組TUG1的表達量為（0.27±0.04），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.001）。不同劑量照射向兩組的細胞存活分?jǐn)?shù)見圖2，沉默TUG1組細胞存活分?jǐn)?shù)較沉默對照組顯著減少（P<0.05），Gy為2時（P<0.001），Gy為4時（P=0.000），Gy為6時（P<0.001），Gy為8時（P<0.001）。沉默TUG1組HOS-R細胞增敏比（SER）為 1.539。

圖2 沉默TUG1對放射抵抗的骨肉瘤細胞放射敏感性的影響

2.3 沉默TUG1促進放射照射誘導(dǎo)的HOS-R細胞凋亡

細胞凋亡檢測結(jié)果見圖3。沉默TUG1組與沉默對照+4Gy組較沉默對照組放射照射誘導(dǎo)的HOS-R細胞凋亡率明顯增加（P<0.001），與沉默對照+4Gy組相比，沉默TUG1+4Gy組明顯增加HOS-R細胞凋亡率（P<0.001）。

圖3 沉默TUG1對4Gy輻射照射48 h后HOS-R細胞凋亡的影響 3a:流式細胞儀檢測細胞凋亡情況 3b:細胞凋亡檢測結(jié)果直方圖，與沉默對照組相比，aP<0.05；與沉默對照+4Gy組相比，bP<0.05

2.4 TUG1可吸附調(diào)節(jié)miR-328-3p的表達

miR-328-3p基因雙熒光素酶檢測結(jié)果見圖4。過表達miR-328-3p組相對熒光素酶活性顯著降低（P=0.00），突變型TUG1-Mut相對熒光素酶活性無明顯變化（P=0.367）。qRT-PCR檢測沉默 TUG1后HOS-R細胞中miR-328-3p相對表達量明顯高于沉默對照組（P<0.001）。

圖4 TUG1可調(diào)控miR-328-3p的表達 4a:TUG1與miR-328-3p互補結(jié)合的核苷酸位點示意圖 4b:過表達miR-328-3p對熒光素酶活性的影響 4c:沉默TUG1對HOS-R細胞中miR-328-3p表達的影響

2.5 過表達miR-328-3p增加HOS-R細胞的放射敏感性

miR-328-3p的表達對HOS-R細胞的放射敏感性的影響見圖5。HOS細胞與HOS-R細胞中miR-328-3p的表達水平較hFOB 1.19細胞降低（P<0.001）；miR-328-3p mimic轉(zhuǎn)染HOS-R細胞后其表達水平顯著升高（P<0.001）；過表達miR-328-3p+4Gy組細胞凋亡率顯著高于過表達miR-NC+4Gy組（P<0.001）。過表達 miR-328-3p放射增敏比為1.493。

圖5 過表達miR-328-3p對HOS-R細胞放射敏感性的影響：結(jié)果示與hFOB 1.19、HOS細胞相比，aP<0.05；與HOS細胞相比，bP<0.05；與過表達miR-NC組相比，cP<0.05；與過表達miR-NC+4Gy組相比，dP<0.05 5a:人成骨細胞hFOB 1.19和HOS、HOS-R骨肉瘤細胞中miR-328-3p的表達 5b:過表達miR-328-3p后HOS-R細胞中miR-328-3p的表達情況5c:過表達miR-328-3p對HOS-R細胞放射敏感性的影響情況 5d:過表達miR-328-3p對放射誘導(dǎo)的HOS-R細胞凋亡的影響

2.6 抑制miR-328-3p逆轉(zhuǎn)了沉默TUG1對HOS-R細胞放射敏感性的影響

抑制miR-328-3p對沉默TUG1對HOS-R細胞放射敏感性的影響見圖6。抑制miR-328-3p聯(lián)合沉默TUG1后HOS-R細胞中miR-328-3p表達水平顯著降低（P<0.001）；抑制 miR-328-3p聯(lián)合沉默TUG1后HOS-R細胞存活分?jǐn)?shù)顯著較高，抑制miR-328-3p聯(lián)合沉默TUG1后放射誘導(dǎo)的HOS-R細胞凋亡率明顯降低（P<0.001）。與沉默TUG1組放射增敏比（SER=1.487）相比，抑制miR-328-3p聯(lián)合沉默TUG1后HOS-R細胞放射增敏比（SER=0.726）明顯降低。

圖6 抑制miR-328-3p聯(lián)合沉默TUG1對HOS-R細胞放射敏感性及放射誘導(dǎo)的細胞凋亡的影響：結(jié)果示與沉默對照組相比，aP<0.05；與沉默TUG1+抑制miR-NC組相比，bP<0.05 6a:抑制miR-328-3p聯(lián)合沉默TUG1后HOS-R細胞中miR-328-3p的表達 6b:抑制miR-328-3p聯(lián)合沉默TUG1對HOS-R細胞放射敏感性的影響 6c:抑制miR-328-3p聯(lián)合沉默TUG1對放射誘導(dǎo)的HOS-R細胞凋亡的影響

3 討論

TUG1在腦膠質(zhì)瘤細胞中呈高表達，沉默TUG1表達后，腦膠質(zhì)瘤細胞增殖能力明顯受到抑制并可誘導(dǎo)細胞凋亡［8］。沉默TUG1表達還可抑制神經(jīng)母細胞瘤細胞遷移及侵襲能力［9］。宮頸癌細胞中TUG1表達上調(diào)，抑制TUG1表達后宮頸癌細胞增殖與侵襲能力亦受到抑制并可促進細胞凋亡［10］。TUG1在肺癌組織中表達水平高于對應(yīng)癌旁組織，其表達量與腫瘤直徑增大、高TNM分期相關(guān)，抑制其表達可抑制肺癌細胞增殖及促進細胞凋亡，沉默TUG1則可促進P16 m RNA及蛋白表達水平從而促進肺癌細胞生長［11］。與人正常乳腺上皮細胞HGC-27相比，TUG1在甲狀腺癌組織和甲狀腺癌細胞中表達上調(diào)，并可促進甲狀腺癌細胞增殖、遷移及侵襲，下調(diào)其表達可抑制甲狀腺癌細胞增殖、遷移及侵襲，TUG1還可通過競爭性結(jié)合miR-145而促進甲狀腺癌細胞的進展［12］。與鄰近組織中TUG1的表達相比，前列腺癌組織中TUG1的表達水平顯著升高，其表達量與患者生存期有關(guān)，下調(diào)其表達可抑制前列腺癌細胞遷移及侵襲，上調(diào)其表達可促進前列腺癌細胞遷移及侵襲，敲除TUG1可抑制DGCR8的表達，上調(diào)TUG1表達后可促進DGCR8的表達，即TUG1可通過上調(diào)DGCR8的表達而促進前列腺癌細胞遷移及侵襲［13］。本研究結(jié)果顯示，HOS與HOS-R細胞中TUG1表達水平顯著升高，且同時隨著照射劑量的不斷增加HOS細胞存活分?jǐn)?shù)低于HOS-R細胞存活分?jǐn)?shù)，說明放射后可降低HOS細胞存活率但對HOS-R細胞無明顯影響，其可能通過上調(diào)TUG1表達進而增強HOS-R細胞放射抵抗。經(jīng)照射后發(fā)現(xiàn)細胞存活分?jǐn)?shù)明顯下降，細胞凋亡率隨著沉默TUG1表達而顯著增加，說明沉默TUG1表達可顯著增強HOS-R細胞放射敏感性。提示抑制TUG1基因表達可能成為增強骨肉瘤細胞放射敏感性的潛在治療靶點。

本研究用靶基因預(yù)測網(wǎng)站預(yù)測TUG1與miR-328-3p存在結(jié)合位點，推測TUG1可能對miR-328-3p有一定調(diào)控作用。提示TUG1可能通過靶向調(diào)控miR-328-3p的表達從而降低骨肉瘤細胞放射敏感性。miR-328-3p在非小細胞肺癌中低表達，上調(diào)miR-328-3p表達可抑制非小細胞肺癌細胞增殖及侵襲能力并可增強其放射敏感性［14］。miR-328-3p在膠質(zhì)母細胞瘤、乳腺癌等惡性腫瘤細胞中表達水平均明顯降低，并在腫瘤發(fā)生及發(fā)展過程中發(fā)揮抑癌基因作用［15］。本研究發(fā)現(xiàn)miR-328-3p可結(jié)合TUG1的3’UTR序列。沉默TUG1基因后miR-328-3p表達水平明顯升高，上調(diào)miR-328-3p表達顯著抑制HOS-R細胞存活分?jǐn)?shù)并可誘導(dǎo)細胞凋亡進而增強HOS-R細胞的放射敏感性。抑制miR-328-3p表達聯(lián)合沉默TUG1表達后HOS-R細胞存活分?jǐn)?shù)明顯增加而細胞凋亡率明顯降低，放射增敏比亦明顯降低，提示TUG1可直接調(diào)控miR-328-3p表達而影響HOS-R細胞放射敏感性。

綜上所述，TUG1在骨肉瘤細胞與放射抵抗的骨肉瘤細胞中的表達量上調(diào)，而miR-328-3p的表達量下調(diào)，TUG1可通過靶向作用于miR-328-3p從而調(diào)控骨肉瘤細胞放射敏感性，沉默TUG1表達可增強骨肉瘤細胞的放射敏感性。但關(guān)于其具體作用機制尚需進一步探究。