吲哚菁綠在生物成像與醫(yī)學(xué)工程中的應(yīng)用進(jìn)展

周巧雨，許佳佳，劉 敏，馬 鑫，黃雨柔，吳彥東，陳 瓊，尹 軍

華中師范大學(xué)化學(xué)學(xué)院農(nóng)藥與化學(xué)生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430079

近年來，光學(xué)染料發(fā)展迅速，大量的熒光染料被用于生物成像及疾病的診斷與治療[1]。其中，一種陽離子型花菁染料吲哚菁綠(indocyanine green，ICG)(圖1)引起了科學(xué)家的廣泛關(guān)注。作為一種具有近紅外(near-infrared，NIR)吸收和發(fā)射的醫(yī)用水溶性熒光染料，ICG的自熒光弱、干擾低、毒性小、親和力高、易與蛋白結(jié)合形成非共價(jià)熒光復(fù)合物[2, 3]。因此，其也被美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)批準(zhǔn)可于臨床使用[3-5]。為使讀者了解ICG的特性，本文介紹了ICG在臨床醫(yī)學(xué)中的發(fā)展情況，并重點(diǎn)描述了其在腫瘤成像與治療方面的應(yīng)用。

圖1 ICG的結(jié)構(gòu)式

1 臨床應(yīng)用

1.1 肝臟手術(shù)

目前，肝臟手術(shù)中仍存在較多致死性并發(fā)癥(如肝衰竭、小肝綜合征等)。而在手術(shù)期間，部分檢測(cè)手段耗時(shí)較長，難以及時(shí)在術(shù)中提供相關(guān)病情信息[6,7]。因此，開發(fā)一種能快速準(zhǔn)確評(píng)估肝功能的檢測(cè)工具具有重要意義。大量的研究顯示，ICG的血液清除率與肝功能直接相關(guān)[8]，目前大部分醫(yī)院即是通過近紅外光譜法測(cè)定ICG濃度，進(jìn)而評(píng)估患者肝功能。為了擴(kuò)展該方法，2018年，Audebert等[9]提出了從肝細(xì)胞到膽小管的ICG非線性排泄速率模型。此外，ICG也被用于肝癌識(shí)別：2012年，Kokudo等[10]偶然發(fā)現(xiàn)利用ICG進(jìn)行常規(guī)肝功能測(cè)試的肝癌病人癌組織會(huì)發(fā)出強(qiáng)烈的熒光，深入研究顯示，由于膽汁排泄紊亂，ICG可通過靜脈攝取被保留在高分化或中分化的癌組織中；雖然低分化肝癌及轉(zhuǎn)移性肝癌部位不吸收ICG，但其周圍的非癌組織可吸收ICG形成熒光環(huán)，進(jìn)而指示肝癌。

1.2 血管造影

20世紀(jì)70年代初，F(xiàn)lower利用ICG可浸潤脈絡(luò)膜基質(zhì)的特點(diǎn)使用具有近紅外發(fā)射的ICG可視化脈絡(luò)膜循環(huán)，20年后，ICG血管造影法成為該領(lǐng)域公認(rèn)的研究方法[11,12]，目前，將不同視網(wǎng)膜和脈絡(luò)膜層的熒光疊加，并與數(shù)字成像系統(tǒng)鏈接的常規(guī)眼底照相機(jī)已經(jīng)開始為血管成像提供高質(zhì)量的熒光圖片。此外，ICG還被用于術(shù)中血管成像，如Raabe等[13]向病患靜脈注射ICG，隨后以近紅外激光激發(fā)，并用數(shù)字?jǐn)z像機(jī)記錄其信號(hào)，成功觀察到眼外血管流動(dòng)和組織灌注。然而，該方法的實(shí)用性不高，患者樣本少。為了解決該問題，近期，Reshetnyak團(tuán)隊(duì)利用更常見的臨床內(nèi)窺鏡和開放手術(shù)的Stryker成像儀成像血管(圖2)[14]。

圖2 (A)血管的熒光圖像；(B)血管的彩色圖像[14]

1.3 膽道手術(shù)

1931年，術(shù)中膽道造影(IOC)被首次報(bào)道，隨后這一技術(shù)迅速發(fā)展，幾乎成為了膽囊切除術(shù)中膽管成像的唯一方法。然而，這種方法操作時(shí)間長，有可能引起膽道損傷。與之相比，ICG參與的熒光膽道造影術(shù)則更具優(yōu)勢(shì)：靜脈注射ICG后，分子可通過近紅外光勾勒出膽道的解剖輪廓，并可在肝外膽管的剝離過程中實(shí)時(shí)識(shí)別肝外膽管避免膽道誤損傷，而且醫(yī)生及病人均不會(huì)受到輻射傷害[15]。隨著微創(chuàng)手術(shù)視頻成像技術(shù)的發(fā)展，ICG近紅外熒光顯像被引入腹腔鏡手術(shù)(如急性膽囊炎、肝門膽管切除、胰腺腫瘤切除等)，以提供詳細(xì)的相關(guān)信息(圖3)[16]。

圖3 (A)ICG熒光膽道造影；(B)膽囊管圖片[16]

1.4 腸道成像

ICG可評(píng)估直腸手術(shù)中吻合口灌注情況，降低吻合口瘺的發(fā)生率[17]，起到預(yù)警作用，還可以識(shí)別病灶位置，檢測(cè)前哨淋巴結(jié)[18]。在結(jié)直腸癌切除手術(shù)中，ICG會(huì)在代謝較差的腫瘤部位積累，辨別待切除的腫瘤邊界，提高手術(shù)的準(zhǔn)確率[19]。雖然近年來ICG成像技術(shù)發(fā)展迅速并已應(yīng)用于部分手術(shù)(圖4)，但現(xiàn)有的研究顯示，該技術(shù)的應(yīng)用尚處于初級(jí)階段，且ICG一旦流出極有可能污染手術(shù)視野。未來還需將其與分辨率更高的設(shè)備聯(lián)用，并確定試劑的最佳用量及注射部位，保證其在手術(shù)過程中的長期穩(wěn)定性。

圖4 結(jié)腸切除術(shù)中ICG增強(qiáng)的熒光淋巴結(jié)成像

2 腫瘤診斷治療

2.1 腫瘤成像

Kokudo等[10]早在2012年就發(fā)現(xiàn)了ICG在肝癌成像中的潛力，這種方法不僅可以快速識(shí)別肝癌細(xì)胞，還能檢測(cè)手術(shù)后肝臟表面殘存的癌細(xì)胞。同年，Yokoyama等[20]發(fā)表了在術(shù)中利用ICG診斷胰腺癌的研究論文。盡管ICG熒光成像在腫瘤切除手術(shù)中得到了廣泛應(yīng)用，但其仍然存在特異性低、清除率高、半衰期短等問題。為了解決這些問題，Cheng小組同通過簡單的一步油包水乳液法合成了ICG-聚己內(nèi)酯(PCL)膠束，由于納米顆粒獨(dú)特的藥代動(dòng)力學(xué)特性及滲透保留效應(yīng)，這種熒光膠束可在腫瘤部位至少保留4天，且與游離ICG相比，其信噪比可增加5倍以上(圖5A)[21]。為了打破ICG成像深度的限制，Changalvaie等[22]將目光轉(zhuǎn)向可避免光散射且可突破光學(xué)成像深度的光聲成像，該團(tuán)隊(duì)首次將ICG的J聚集體封裝在丙交酯-乙交酯-b-聚(乙二醇)(PLGA-b-PEG)中合成ICGJ@PEI。在該設(shè)計(jì)中，J聚集體展現(xiàn)出比單ICG更強(qiáng)的光穩(wěn)定性和更遠(yuǎn)的發(fā)射，同時(shí)脂質(zhì)體的靜電力吸附可以防止ICG降解，此外，分子還可與表皮生長因子受體(EGFR)特異性單克隆抗體結(jié)合，提高分子的癌細(xì)胞靶向性(圖5B)[22]。除了封裝ICG，合成性能更強(qiáng)的衍生物也有利于光聲成像。有研究顯示，ICG的衍生物IR820含有兩個(gè)磺酸基團(tuán)，擁有更強(qiáng)的蛋白質(zhì)結(jié)合能力，與人血清白蛋白結(jié)合后，IR820單鍵旋轉(zhuǎn)被限制，熒光迅速增強(qiáng)[23]。因此，該絡(luò)合物被用于監(jiān)測(cè)血管系統(tǒng)、淋巴引流系統(tǒng)及腫瘤血管，并可作為一種多功能雙模態(tài)成像探頭，對(duì)荷瘤小鼠進(jìn)行近紅外及光聲成像[23]。與此同時(shí)，還有一些研究者致力于改善近紅外信號(hào)收集系統(tǒng)，如Hu等[24]開發(fā)了一種高靈敏度、高分辨率的多譜熒光成像儀，并證明了該儀器可以進(jìn)行多窗口成像，指導(dǎo)腫瘤切除手術(shù)。

圖5 (A)與ICG及ICG-PCL膠束作用后，皮下A549肺腫瘤小鼠的熒光圖像[21]；(B)ICGJ@PEI存在時(shí)，乳腺癌細(xì)胞的光聲圖像[22]

2.2 腫瘤治療

傳統(tǒng)的癌癥治療手段包括外科手術(shù)、化療、放療等，但這些方法的毒副作用強(qiáng)，治療效果不理想[25]。近年來，一些新興治療策略的發(fā)展為癌癥的有效治療提供了新途徑，例如，在近紅外光照射下，利用光轉(zhuǎn)換產(chǎn)生的高溫或活性氧破壞癌細(xì)胞結(jié)構(gòu)的光熱療法(PTT)及光動(dòng)力療法(PDT)。

由于ICG是一種幾乎無毒的近紅外臨床造影劑，與現(xiàn)有光敏劑相比，其組織穿透性更強(qiáng)，因此也被用于各種腫瘤的PDT及PTT。Tamai等[25]利用超碳酸鹽磷灰石(sCA)裝載ICG，并通過EPR效應(yīng)使其聚集在腫瘤部位。結(jié)果顯示，注射4 h并經(jīng)近紅外光輻射后，與純ICG組相比，其在腫瘤中的熒光信號(hào)增長了4倍，活性氧產(chǎn)率也更高，經(jīng)19天治療后小鼠腫瘤體積大大減小，僅為對(duì)照組的1/6。然而，隨著研究的深入，科學(xué)家發(fā)現(xiàn)PDT光敏劑產(chǎn)生的大量活性氧有可能會(huì)損傷腫瘤周圍的正常組織，且現(xiàn)有激光的穿透力不夠強(qiáng)，PDT對(duì)腫瘤的治療效果不徹底。因此，一些研究人員積極尋找并陸續(xù)開發(fā)了具有高抗癌效率的PTT試劑。2019年，Gao等[26]將ICG、疏水熱休克蛋白(HSP)、抑制劑GA、親水葡萄糖氧化酶GOx封裝在熱敏脂質(zhì)體中，合成了低溫PTT粒子，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：靜脈注射脂質(zhì)體(GOIGLs)后，近紅外激光觸發(fā)ICG的光熱效應(yīng)導(dǎo)致溫度上升，GOx、ICG、GA會(huì)被快速釋放，隨后，GA進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)并與癌細(xì)胞中過表達(dá)的熱激蛋白HSP90結(jié)合，進(jìn)而抑制細(xì)胞的耐熱性，提高光熱治療效率。同時(shí)，GOx促進(jìn)葡萄糖消耗、催化H2O2生成羥基自由基，前者導(dǎo)致三磷酸腺苷(ATP)供應(yīng)減少，抑制HSP；后者產(chǎn)生的羥基自由基進(jìn)一步破壞癌細(xì)胞。由于熱激蛋白抑制劑的引入，這一光熱療法在低溫下展現(xiàn)出高轉(zhuǎn)換效率?？紤]在上述方法中ICG利用效率不夠高，光漂白速率過快，Yeroslavsky等[27]進(jìn)一步合成了封裝包括ICG在內(nèi)的兩種近紅外染料的聚(乙二醇)-嵌段-聚(ε-己內(nèi)酯)(PCL-PEG)基膠束(IIPM)。由于染料間的熒光共振能量轉(zhuǎn)移可以減少供體的激發(fā)態(tài)壽命，降低其光分解效率，因此，在近紅外光輻射下，該膠束在體內(nèi)穩(wěn)定積累，并展現(xiàn)出高效的抑癌能力(圖6)[27]。

圖6 (A)MCF-7細(xì)胞與IIPM孵育后的存活率；(B)注射IIPM小鼠的活體成像[27]

除上述方法外，將依靠自身免疫系統(tǒng)抑制或殺死癌細(xì)胞的免疫治療法與PDT、PTT等結(jié)合，以組建聯(lián)合抗癌平臺(tái)的策略也得到了快速發(fā)展。例如，Chen等[28]利用ICG、咪喹莫特及PLGA，設(shè)計(jì)了一種集PTT與免疫檢查點(diǎn)封鎖(ICB)功能為一體的納米粒子PLGA-ICG-R837，該粒子不僅能夠有效治療癌癥，還可抑制轉(zhuǎn)移、防止腫瘤復(fù)發(fā)(圖7)。為了進(jìn)一步提高腫瘤小鼠生存率，Wang等[29]將二硬脂酰磷脂酰乙醇胺DSPE-PEG-馬來酰亞胺和ICG組裝到上轉(zhuǎn)換納米顆粒中，并加載光敏劑玫瑰紅，合成了新型光觸發(fā)抗原捕獲納米平臺(tái)。一方面，該粒子聯(lián)合了光熱、光動(dòng)力和免疫學(xué)治療，為轉(zhuǎn)移性腫瘤的治療提供了一種新的途徑;另一方面其還促進(jìn)了小鼠的長期免疫記憶功能，有效延長了小鼠壽命。2020年，F(xiàn)eng等[30]報(bào)道了ICG模板自組裝納米藥物策略，該研究顯示，紫杉醇與ICG形成的納米粒子被腫瘤細(xì)胞有效攝取后，ICG利用PDT誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞免疫原性死亡，而紫杉醇則抑制調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞與免疫檢查點(diǎn)封鎖治療結(jié)合后，腫瘤經(jīng)21天的治療即可消失。

圖7 (A)在808 nm激光(0.5 W·cm-2)照射下，注射PLGA-ICG-R837、PLGA-ICG及PBS的荷瘤小鼠的光熱圖像；(B)腫瘤小鼠經(jīng)治療后，其繼發(fā)腫瘤生長曲線[28]

3 總結(jié)與展望

ICG作為一種近紅外熒光染料，已被廣泛用于血管造影、肝膽手術(shù)切除等臨床領(lǐng)域。近年來，由于其特殊的光學(xué)性質(zhì)，ICG還在各類腫瘤的診斷與治療方案中嶄露頭角。相當(dāng)數(shù)量的研究表明，ICG既可指導(dǎo)腫瘤手術(shù)，還能抑制腫瘤細(xì)胞的生長。因此，相信在未來，將ICG骨架進(jìn)行改造，有可能得到更具穿透性的近紅外Ⅱ區(qū)熒光染料，進(jìn)而滿足日益增長的疾病診斷分辨率要求，此外，具有生物相容性的ICG還可被用于生物體內(nèi)細(xì)菌，尤其是耐藥細(xì)菌的診療，這將為提高人口健康水平做出更大的貢獻(xiàn)。