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    黃芪、紫錐菊、當(dāng)歸等中藥組方對雞免疫功能的影響

    2021-07-22 09:50:52華詩卉周柏汝張延龍姜承言姚瑞珂李敬雙
    飼料工業(yè) 2021年13期
    關(guān)鍵詞:免疫增強(qiáng)效價黃芪

    ■華詩卉 周柏汝 張延龍 姜承言 姚瑞珂 李敬雙 于 洋

    (錦州醫(yī)科大學(xué),遼寧錦州 121001)

    免疫增強(qiáng)劑是一些單獨(dú)使用即能引起機(jī)體出現(xiàn)短暫的免疫功能增強(qiáng)作用的物質(zhì),有的與抗原同時使用。在畜禽生產(chǎn)中常將免疫增強(qiáng)劑與疫苗同時使用,以達(dá)到增強(qiáng)免疫功能、延長免疫時間的效果[1]。目前常用的免疫增強(qiáng)劑主要是化學(xué)性免疫增強(qiáng)劑,其藥物殘留量大,易影響食品安全。中藥免疫增強(qiáng)劑藥物殘留量小,安全性高,特別是復(fù)方中藥免疫增強(qiáng)劑通過藥物配伍藥效更佳,越來越受到科研人員的重視。

    黃芪、紫錐菊、當(dāng)歸、枸杞、金銀花、熟地和甘草都是我國傳統(tǒng)的中藥,廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)和獸醫(yī)臨床。本研究根據(jù)單味中藥的性能和功效,按照中醫(yī)理論,辨癥施治的原則進(jìn)行組方,添加雛雞日糧中。檢測中藥組方對新城被病毒(NDV)抗體效價、免疫器官指數(shù)、脾淋巴細(xì)胞增殖、脾淋巴細(xì)胞分泌細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-4(IL-4)和壞死因子-α(TNF-α)的影響。為復(fù)方中藥免疫增強(qiáng)劑的開發(fā)和在飼料添加劑中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

    1 材料

    1.1 試驗(yàn)動物

    1 日齡海蘭褐公雞雛,由錦州鴻強(qiáng)牧業(yè)有限公司提供。

    1.2 疫苗

    雞新城疫弱毒疫苗,遼寧省益康生物股份有限公司生產(chǎn),批號19306002。

    1.3 藥品

    當(dāng)歸(產(chǎn)地甘肅岷縣);黃芪、枸杞和甘草(產(chǎn)地甘肅省寧夏);紫錐菊(產(chǎn)地河北省保定);金銀花(山東省平邑縣);熟地(河南省焦作);鹽酸左旋咪唑粉(四川省飛天動物藥業(yè)有限公司生產(chǎn),批號200901)。

    1.4 主要試劑

    IL-4和TNF-α試劑盒(武漢純度生物科技有限公司生產(chǎn));雞新城疫病毒血凝抑制試驗(yàn)(HI)抗原(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所生產(chǎn));磷酸鹽緩沖溶液(PBS)、RPMI-1640培養(yǎng)液、胎牛血清(FBS)、氯化銨(NH4Cl)和三羥甲基氨基甲烷(Tris)(北京索萊寶科技有限公司生產(chǎn));二甲基亞砜(DMSO)、四甲基偶氮唑鹽(MTT)、臺盼藍(lán)(Trypan Blue),上海展云化工有限公司生產(chǎn)。

    2 方法

    2.1 復(fù)方中藥的制備

    黃芪、紫錐菊、當(dāng)歸、枸杞、金銀花、熟地和甘草按質(zhì)量分?jǐn)?shù),分別占30%、20%、10%、10%、10%、10%和10%,每味中藥用中藥粉碎機(jī)充分粉碎后過80 目篩,按比例混合裝袋備用。

    2.2 試驗(yàn)動物分組與飼養(yǎng)方法

    試驗(yàn)設(shè)5 個組,1 組為空白對照組,2 組為陽性對照組,3、4 組和5 組分別為添加不同濃度復(fù)方中藥組。每組30只雞雛,自由采食、飲水,7日齡用雞新城疫弱毒疫苗進(jìn)行免疫,操作按照疫苗說明書進(jìn)行,按說明書2倍用量。1組飼料不加藥物,2組在飼料中加鹽酸左旋咪唑粉(0.1 g/kg),3、4 組和5 組在飼料中加入不同濃度(5、10 g/kg和15 g/kg)復(fù)方中藥。

    2.3 NDV抗體效價的檢測

    28 日齡,每組隨機(jī)抽取20 只雞,采用血凝(HA)和血凝抑制(HI)檢測NDV抗體效價,按照姚火春[2]方法操作。

    2.4 免疫器官指數(shù)的檢測

    28 日齡,每組隨機(jī)抽取20 只雛雞,檢測胸腺、法氏囊和脾臟指數(shù),按照李金鳳等[3]的方法操作。

    2.5 脾淋巴細(xì)胞增殖和細(xì)胞因子分泌的檢測

    28 日齡,每組隨機(jī)抽取5 只雛雞,無菌操作取出脾臟分離淋巴細(xì)胞,制成淋巴細(xì)胞懸液,MTT 法檢測脾淋巴細(xì)胞增殖,ELISA 法檢測IL-4 和TNF-α的分泌,按照仇真毓等[4]試驗(yàn)方法操作。

    2.6 統(tǒng)計學(xué)分析

    數(shù)據(jù)用“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±S)”表示,用統(tǒng)計軟件SPSS 13.0進(jìn)行一維方差分析組間差異。小寫字母表示差異顯著P<0.05,大寫字母表示差異極顯著P<0.01。

    3 結(jié)果與分析

    3.1 復(fù)方中藥對NDV抗體效價的影響(見圖1)

    圖1 復(fù)方中藥對NDV抗體效價的影響

    由圖1可知,1組NDV抗體效價極顯著低于2 組、3 組和4 組(P<0.01),顯著低于5 組(P<0.05),2 組與4 組之間差異不顯著(P>0.05),表明復(fù)方中藥能夠提高NDV抗體效價,4組效果最佳。

    3.2 復(fù)方中藥對免疫器官指數(shù)的影響(見圖2)

    由圖2可知,1組胸腺指數(shù)、法氏囊指數(shù)和脾指數(shù)均極顯著低于2、3、4、5 組(P<0.01),胸腺指數(shù)2 組與3、4 組差異均不顯著(P>0.05),法氏囊指數(shù)和脾指數(shù)2 組與4 組差異不顯著(P>0.05),表明復(fù)方中藥能夠促進(jìn)免疫器官的發(fā)育,4組效果最佳。

    圖2 復(fù)方中藥對免疫器官指數(shù)的影響

    3.3 復(fù)方中藥對脾淋巴細(xì)胞增殖的影響(見圖3)

    由圖3 可知,1 組脾淋巴細(xì)胞刺激指數(shù)均極顯著低于2、3、4、5 組(P<0.01),2 組與4 組差異不顯著(P>0.05),表明復(fù)方中藥能夠促進(jìn)脾淋巴細(xì)胞增殖,4 組效果最佳。

    2.4 復(fù)方中藥對脾淋巴細(xì)胞細(xì)胞因子分泌量的影響(見圖4)

    圖4 復(fù)方中藥對脾淋巴細(xì)胞細(xì)胞因子分泌量的影響

    由圖4 可知,1 組IL-4 和TNF-α分泌量均極顯著低于2、3、4、5 組(P<0.01),IL-4 分泌量2 組與4 組差異不顯著(P>0.05),TNF-α分泌量2 組與3、4 組差異不顯著(P>0.05),表明復(fù)方中藥能夠促進(jìn)脾淋巴細(xì)胞IL-4和TNF-α的分泌,以4組效果最佳。

    4 討論

    4.1 復(fù)方中藥免疫調(diào)節(jié)作用效果分析

    黃芪、紫錐菊、當(dāng)歸、枸杞、金銀花、熟地和甘草都是我國傳統(tǒng)的中藥。黃芪可以補(bǔ)氣升陽,主要成分含有多糖類、黃酮類和三萜類等,具有增強(qiáng)免疫、抗腫瘤、抗病毒等功效[5]。紫錐菊被西方國家稱為萬能的免疫草藥,主要成分含有多糖類、黃酮類和多酚類等,成為國際上熱門的免疫促進(jìn)劑和免疫調(diào)節(jié)劑[6]。當(dāng)歸為補(bǔ)血之圣藥,主要成分含有揮發(fā)油、有機(jī)酸、多糖、黃酮等,具有增強(qiáng)免疫、抗腫瘤、抗氧化等功效[7]。枸杞可以補(bǔ)氣強(qiáng)精,滋補(bǔ)肝腎,主要成分是枸杞子色素,具有提高機(jī)體免疫力、抗炎等作用[8]。金銀花清熱解毒,涼散風(fēng)熱,主要含有黃酮類、綠原酸類和皂苷類等成分,被譽(yù)為“清熱解毒之良藥”[9]。熟地可以補(bǔ)腎填精,養(yǎng)血滋陰,主要成分是多糖、5-羥甲基醛糖和氨基酸,具有抗氧化、增強(qiáng)免疫力、抗腫瘤等功效[10]。甘草可以補(bǔ)脾益氣,清熱解毒,主要成分含有多糖類、黃酮類和三萜類等,具有增強(qiáng)免疫、抗炎、抗腫瘤、抗病毒等功效[11]。本研究按照中醫(yī)和中獸醫(yī)理論,辨癥施治的原則,依據(jù)黃芪、紫錐菊、當(dāng)歸、枸杞、金銀花、熟地和甘草的性能與功效,按質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別占30%、20%、10%、10%、10%、10%和10%進(jìn)行組方,達(dá)到補(bǔ)氣升陽、補(bǔ)腎填精、健脾養(yǎng)血、強(qiáng)筋健骨、清熱解毒的效果,從而發(fā)揮免疫功效。

    4.2 復(fù)方中藥對雞免疫功能的影響

    4.2.1 復(fù)方中藥對NDV抗體效價的影響

    抗體效價的高低直接反應(yīng)機(jī)體的體液免疫狀態(tài)[12]。靳雙星等[13]利用黃芪、板藍(lán)根、連翹、茯苓、山楂、枳實(shí)和白術(shù)制成復(fù)方中藥合劑,利用7、10日齡和14 日齡未免疫AA 肉雞,各日齡均設(shè)復(fù)方中藥制劑低、中、高劑量組(飲水中加入5、10 mL/L和15 mL/L),連用21 d。7、10日齡和14日齡的雞分別用NDClone-30 疫苗滴、鼻點(diǎn)眼,ND 油乳劑滅活苗頸部皮下注射,IBD疫苗滴口。21、28日齡和35日齡采用瓊脂擴(kuò)散沉淀反應(yīng)測定抗體效價,結(jié)果復(fù)方中藥制劑能提高NDV和IBDV 抗體效價。本研究結(jié)果復(fù)方中藥能夠提高NDV 抗體水平,與上述結(jié)果是一致的,說明復(fù)方中藥可以調(diào)節(jié)機(jī)體的體液免疫功能。

    4.2.2 復(fù)方中藥對脾淋巴細(xì)胞功能的影響

    淋巴細(xì)胞是機(jī)體重要的免疫活性細(xì)胞,只有受到抗原刺激才能活化。細(xì)胞分裂增殖、產(chǎn)生抗體和分泌細(xì)胞因子是淋巴細(xì)胞活化的重要標(biāo)志。淋巴細(xì)胞增殖是衡量機(jī)體免疫調(diào)節(jié)功能強(qiáng)弱的重要指標(biāo)[14]。顧歡歡等[15]用42日齡肉雞分離脾淋巴細(xì)胞,用淫羊藿多糖選用5 個濃度(1 500.00、1 250.00、625.00、312.50 μg/mL和156.25 μg/mL)單獨(dú)和協(xié)同脂多糖(LPS)刺激,用MTT法測定淋巴細(xì)胞增殖率,結(jié)果淫羊藿多糖可刺激脾臟淋巴細(xì)胞增殖。IL-4是Th2型細(xì)胞因子,誘導(dǎo)幼稚輔助性T細(xì)胞分化成Th2細(xì)胞[16],對疫苗免疫應(yīng)答具有調(diào)節(jié)作用,是衡量疫苗免疫的重要指標(biāo)[17]。TNF-α是Th1型細(xì)胞因子,影響細(xì)胞的正常生長、增殖、分化和凋亡,從而影響機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)活性功能[18]。靳二輝等[19]將女貞子、枸杞、當(dāng)歸、金銀花、熟地、淫羊藿和黃芪粉碎制成復(fù)方制劑,應(yīng)用于1日齡AA肉仔雞,復(fù)方制劑設(shè)3個劑量組(日糧中添加5、1 g/kg和1 g/kg),21 和42 日齡ELISA 法檢測血清中細(xì)胞因子的分泌,結(jié)果表明復(fù)方制劑能夠促進(jìn)INF-γ、IL-4 和IL-12 的分泌。仇真毓等[4]將洋蔥槲皮素添加到雛雞日糧中,洋蔥槲皮素設(shè)4個不同濃度組(1、2、4 g/kg和8 g/kg),30日齡ELISA法檢測TNF-α的分泌,結(jié)果洋蔥槲皮素能夠促進(jìn)TNF-α的分泌。本研究結(jié)果復(fù)方中藥能夠刺激脾淋巴細(xì)胞增殖,促進(jìn)脾淋巴細(xì)胞IL-4 和TNFα的分泌,與上述結(jié)果是一致的,說明復(fù)方中藥能夠活化淋巴細(xì)胞,從而發(fā)揮淋巴細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)活性。

    4.2.3 復(fù)方中藥對免疫器官發(fā)育的影響

    免疫器官的重量可用于評價雛雞的免疫狀態(tài)[20]。呂樹臣等[21]將黃芪、黃柏、甘草、防風(fēng)和蒲公英按不同百分比(25%、25%、10%、10%和20%)制成復(fù)合型中藥添加劑,用21 日齡貴妃雞,復(fù)合型中藥添加劑設(shè)3 個劑量組(日糧中添加5、10 g/kg 和15 g/kg),試驗(yàn)期為91 d,結(jié)果復(fù)合型中藥添加劑能夠提高雞胸腺、法氏囊和脾的重量。本研究結(jié)果復(fù)方中藥能夠提高胸腺、法氏囊和脾指數(shù),與上述結(jié)果是一致的,說明復(fù)方中藥能夠促進(jìn)免疫器官的發(fā)育,從而提高機(jī)體的免疫功能。

    5 結(jié)論

    復(fù)方中藥能夠促進(jìn)雞抗體的產(chǎn)生,促進(jìn)免疫器官的發(fā)育,刺激脾淋巴細(xì)胞的增殖和細(xì)胞因子的分泌,從而提高雞的免疫功能,10 g/kg的添加量效果最佳。

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