N-取代苝酰亞胺小分子自組裝形貌及生物學(xué)應(yīng)用研究進展

李凱文，談春霞

(甘肅省中藥質(zhì)量與標準研究重點實驗室, 甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅 蘭州 730000)

具有π共軛體系的3,4,9,10-苝四羧酸二酰亞胺(perylene-3,4,9,10-tetracarboxylic imide，PDI)是結(jié)構(gòu)很好修飾的熒光性染料分子，也是較好的n型有機半導(dǎo)體分子[1]。苝環(huán)結(jié)構(gòu)中同時具有π共軛體系和吸電子性質(zhì)的酰胺基團，因此整個體系具有電子給體-電子受體特征。

基于PDI結(jié)構(gòu)的衍生物及其低聚物通常被報道可以在溶液中自組裝成有序的超分子納米結(jié)構(gòu)，形成有序的超分子聚集體。關(guān)于一些小分子苝酰亞胺衍生物利用自組裝的方式成功構(gòu)筑功能納米結(jié)構(gòu)已被廣泛報道[2]。研究表明，由于具有特定結(jié)構(gòu)的PDI[3-4]在測試環(huán)境中容易產(chǎn)生聚集體，PDI衍生物分子通常會以納米級超分子結(jié)構(gòu)的形式存在于水溶液中(圖1)。另外，還發(fā)現(xiàn)PDI探針在較低的濃度下具有細胞滲透性[5]，在細胞生物醫(yī)學(xué)中具有潛在的應(yīng)用。然而，在分子探針設(shè)計中，水溶性仍然被認為是一個具有挑戰(zhàn)性的目標，這使得合成新型高度水溶性的有機探針具有重大的科學(xué)意義。本文從PDI自組裝形貌、熒光性質(zhì)及其生物學(xué)等方面對具有特殊結(jié)構(gòu)的PDI小分子衍生物進行了選擇性地總結(jié)和歸納。

圖1 N-取代苝酰亞胺衍生物結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1 Scheme of the structure of N-perylene imide derivatives

1 自組裝形貌

苝酰亞胺及其衍生物作為典型的稠環(huán)芳香分子，分子之間存在較強π-π的相互作用。并且通過引入不同的官能團對苝酰亞胺分子結(jié)構(gòu)進行修飾，就可以很好地協(xié)調(diào)各種非共價鍵作用力，包括氫鍵、π-π相互作用、配位鍵、親水/疏水作用、靜電作用力、范德華力等，獲得結(jié)構(gòu)和功能較好的超分子組裝材料[6]。PDI官能化的衍生物在溶液中可以很容易地自組裝成超分子納米結(jié)構(gòu)。在不同自組裝條件下，聚集體形貌有所不同。自組裝過程和聚集體的形貌與衍生物的側(cè)鏈的結(jié)構(gòu)、測試溶劑、溶液的pH等因素有關(guān)。

1.1 側(cè)鏈因素

通過各種光譜技術(shù)收集的結(jié)果顯示所考察的苝酰亞胺衍生物的側(cè)鏈取代基對其結(jié)構(gòu)形態(tài)和光學(xué)性質(zhì)有影響。如圖2所示，化合物1(DP-PDI)，結(jié)構(gòu)中具有短的線性側(cè)鏈取代基均表現(xiàn)出在有機溶劑(乙腈、己烷和甲醇)中聚集的趨勢，并且由于疏水性而形成一維(1D)自組裝(納米線)，線性側(cè)鏈之間的相互作用與苝酐平面之間的π-π相互作用高度協(xié)作。在化合物2(DT-PDI)，具有長的線性側(cè)鏈取代基的情況下，觀察到相似的聚集行為，并形成塊狀聚集體。與線性鏈取代基相反，化合物3(DH-PDI)(具有分支的側(cè)鏈)則形成了零維(0D)自組裝(納米球),這是由于分支鏈的空間位阻而無法沿一個方向生長[7]。

圖2 化合物1,2,3結(jié)構(gòu)示意圖及掃描電鏡照片(a) DP-PDI自組裝環(huán)境：化合物1的氯仿溶液注入到過量的乙醇溶劑中 (b) DT-PDI自組裝環(huán)境：化合物2的氯仿溶液注入到過量的乙醇溶劑中(c) DH-PDI 自組裝環(huán)境：化合物3的氯仿溶液注入到水/甲醇(體積比 35/65)混合溶液中 (d) DH-PDI放大倍數(shù)的圖片F(xiàn)ig. 2 Scheme of compounds 1, 2, 3 and scanning electron micrographs (a) DP-PDI self-assembly: the chloroform solution of 1 was injected into an excess of ethanol solvent; (b) DT-PDI self-assembly: the chloroform solution of 2 was injected into the excess ethanol solvent; (c) DH-PDI self-assembly: the chloroform solution of 3 was injected into the mixed solution of water/methanol (v/v∶35/65) (d) the magnified image of DH-PDI

這樣的聚集體的形貌與我們研究有機-多金屬氧簇化合物的自組裝形態(tài)有相似之處[8-10]：連有疏水基團的衍生物在溶液中自組裝，疏水基團較短時分子之間較強π-π作用力，使得化合物在有機溶劑中自組裝成具有一定長度的一維形貌；如果疏水基團相對較大，在疏水作用、范德華力作用下，化合物在混合溶劑中(含有水)容易形成具有納米尺寸的球形形貌，同時體積較大的基團也妨礙了一維形貌的形成。

1.2 溶劑因素

N-取代苝酰亞胺衍射物在溶液中的自組裝過程及形貌還受到溶劑的影響。在溶液中衍生物的自組裝除了π-π相互作用力外還與氫鍵、親水/疏水作用、靜電作用力等這些重要的非共價鍵力有關(guān)。

早期的文獻[11]報道了丁基取代的苝酰亞胺衍生物4。在氯仿/甲醇溶劑，由于母核的強π-π作用以及側(cè)鏈的疏水作用，形成了結(jié)構(gòu)清晰的一維納米帶狀結(jié)構(gòu)(圖3)。

圖3 丁基取代的苝酰亞胺4的納米帶狀結(jié)構(gòu)Fig.3 TEM image of nano ribbons for compound 4 with butyl-substituted peryleneimide

PDI衍生物5[12]是同時具有氨基和羧基結(jié)構(gòu)的衍生物，在相對非極性的溶劑(THF和CHCl3)中由于π-π緊密堆積成形成較長的纖維的形態(tài)，而在極性更大的溶劑(六氟異丙醇、甲醇、乙腈和丙酮)中，形成了球形形貌，自組裝過程和聚集體形貌都顯示了出對溶劑極性的明顯依賴性。由實驗結(jié)果可以看出，在極性溶劑中，衍生物5中的氨基和羧基更容易與極性溶劑相互作用，在主要的疏水作用下能更有效地聚集，并且隨著溶劑極性的增加，納米結(jié)構(gòu)的尺寸有顯著增加。由于5結(jié)構(gòu)中存在手性基團，在四氫呋喃溶劑中獲得的長3～10 μm的右旋螺旋纖維，在相同的條件下的氯仿溶劑中卻只觀察到了沒有螺旋的細(～2 μm)的纖維，除此之外的其它測試溶劑中，5只得到了納米球狀形貌(圖4)。作者推測在四氫呋喃溶劑中5與溶劑間的氫鍵作用力形成了具有手性結(jié)構(gòu)的形貌。

圖4 化合物5(10 μmol/L)在不同溶劑中的掃描電鏡圖片F(xiàn)ig.4 SEM images of compound 5 (10 μmol/L) in different solvents

在苝環(huán)的海灣處進行取代基修飾的結(jié)構(gòu)，使得分子自組裝過程中依賴苝酐核π-π堆積變得困難。文獻報道的碳酸烯丙酯官能化的苝二酰亞胺衍生物6[13]，可以很容易地在CH3CN中π-π相互作用，自組裝成數(shù)十毫米長的納米棒；在30% H2O、DMSO混合物中，氫鍵、親水作用下自組裝成長度為數(shù)十毫米的納米線；而僅在乙酸乙酯中，由于疏水作用形成納米球。實驗結(jié)果表明：碳酸烯丙酯的引入增加了分子的水溶性，使6可以在含有水的混合溶劑中伸展形成纖維，而在有機溶劑中形成納米球形貌(圖5)。

圖5 化合物6在不同溶劑中的自組裝形貌Fig.5 Self-assembly morphology of compound 6 in different solvents

文獻報道的結(jié)構(gòu)中引入有兩個二茂鐵(Fc)單元的苝酰亞胺母核組成的電子供體-受體分子(D-A)7(PDI-Fc)[14]，是通過基于溶液的自組裝制備的。在制備的過程中通過簡單地調(diào)節(jié)分子的初始濃度來形成定義明確的PDI-Fc納米棒，納米線和微米線。圖6顯示了調(diào)節(jié)溶劑CH2Cl2中PDI-Fc的初始濃度可以得到不同大小和形態(tài)的PDI-Fc自組裝形貌。

圖6 不同初始濃度的PDI-Fc在CH2Cl2溶劑中的自組裝掃描電鏡圖片： (a) 0.2 mM; (b) 1.0 mM; (c) 1.5 mMFig.6 SEM pictures of PDI-Fc Self-assembly in CH2Cl2 solvent with different initial concentrations (a) 0.2; (b) 1.0; (c) 1.5 mM

一種新型的兩親性苝酰亞胺衍生物8：七氟丁基取代的苝酰亞胺二聚體被報道。文獻研究了該二聚體在不同體積比的四氫呋喃/水(THF-H2O)混合溶劑中的自組裝性能[15]。該二聚體在75/25、50/50和25/75(THF/H2O，體積比)混合溶劑中分別自組裝形成微米級的“花”狀聚集體，微米級“蝴蝶結(jié)”聚集體和 “空心球”型納米結(jié)構(gòu)。數(shù)據(jù)顯示混合溶劑系統(tǒng)中的水含量對兩親性的聚集微觀結(jié)構(gòu)(形態(tài))的變化有很大影響。具有兩親性結(jié)構(gòu)的N-取代苝酰亞胺衍生物在含水的混合溶劑中一般不會得到一維形態(tài)，自組裝過程中受到親水/疏水作用力、范德華力等因素的影響形成三維形貌的聚集體，符合兩親性化合物在溶液中的聚集特征[16]。如果在苝酰亞胺母核上引入具有手性結(jié)構(gòu)的基團，自組裝形貌還會具有手性特征。

圖7 化合物8在THF/H2O不同比例(體積比)的混合溶劑中的自組裝掃描電鏡圖片：(a) 75/25 (b) 50/50 (c) 25/75Fig.7 SEM images of compound 8 self-assembly in mixed solvents with different ratios of THF/H2O (a) 75/25 (b) 50/50 (c) 25/75

1.3 手性因素

基于糖基設(shè)計的兩親性苝酰亞胺衍生物9[14]，能夠和溶劑以氫鍵相互作用。苝環(huán)一端是親脂性的烷基鏈，另外一端是具有手性的親水性的多羥基集團。在極性-非極性混合溶劑(氯仿/正辛烷)中，從純氯仿溶劑到混合溶劑體積比為50/50變化中，形成了旋光性左旋螺旋聚集體。在溶解性好/溶解性差的溶劑中該化合物展現(xiàn)了相反的手性聚集行為。從純四氫呋喃溶劑到混合溶劑(四氫呋喃/水)體積比為20/80，形成旋光性右旋螺旋聚集體。透射電鏡的結(jié)果和圓二色光譜測試結(jié)果相吻合(圖8)。

圖8 化合物9手性螺旋納米線的透射電鏡照片，測試溶劑為：(a) 氯仿/正辛烷 (80/20, 體積比)； (b) 四氫呋喃/水 (80/20, 體積比)；(c) 氯仿/正辛烷(50/50, 體積比)；(d) 四氫呋喃/水(50/50, 體積比)Fig.8 TEM images of compound 9 with chiral spiral nanowire obtained in the test solvent (a) chloroform/n-octane (80/20, v/v); (b) Tetrahydrofuran/water (80/20, v/v); (c) chloroform/n-octane (50/50, v/v); (d) Tetrahydrofuran/water (50/50, v/v)

利用分子間非極性共價鍵相互作用設(shè)計的手性不對稱苝酰亞胺衍生物10[15]，一端為非極性的C12烷基鏈，另一端連接3,5-二甲氧基芐基作為手性極性側(cè)鏈。透射電鏡實時監(jiān)測了早期自組裝聚集體的形成。由(S)-構(gòu)型的10在氯仿/乙醇混合溶劑自組裝形成左旋納米管，(R)-構(gòu)型的10在乙腈純?nèi)軇┲械淖越M裝聚集形成右旋納米管，這樣的單手性納米管具有較高的熒光量子產(chǎn)率(> 46%)。實驗得出結(jié)論：利用在分子結(jié)構(gòu)中引入手性集團可以得到具有單一手性的自組裝聚集體。

1.4 pH因素

苝酰亞胺的N端連接兩個臂狀離子化的氨基咪唑基團是新型的衍生物11[16]，其結(jié)構(gòu)中的咪唑集團改善了苝酐類衍生物在水中的溶解度，同時也保留了苝環(huán)母核在溶液中的超分子自組裝的能力。在pH調(diào)節(jié)循環(huán)中，衍生物11水溶液在低pH(4.0)沒有出現(xiàn)聚集，溶液澄清透明，而在高pH(8.0)時產(chǎn)生了聚集體。透射電鏡圖顯示在pH 4.0下只觀察到短的納米帶，在pH 8.0下觀察到長的雜交的納米帶。通過調(diào)節(jié)溶液的pH(從pH 4.0到pH 8.0)，短納米帶可以自組裝形成長的支鏈納米帶。文獻報道這個分子自組裝過程是可逆的，通過調(diào)節(jié)溶液的pH(從pH 8.0到pH 4.0)長的雜支納米帶又可以分解成短的納米帶(圖10)。 不同pH的測試環(huán)境中，親水/疏水作用、靜電作用力、范德華力等形成自組裝聚集體的主要因素不同，出現(xiàn)了在pH調(diào)節(jié)循環(huán)中可逆的聚集過程現(xiàn)象。

圖9 化合物10的結(jié)構(gòu)示意圖(左圖) (a) (S)-構(gòu)型CD圖；(b)(R)-構(gòu)型CD圖, 測試濃度：0.1 mmol/L,測試溶劑：氯仿/乙醇(c)(S)-構(gòu)型透射電鏡圖(d)(R)-構(gòu)型透射電鏡圖Fig.9 Scheme of compound 10 (left); right: (a) (S)-CD spectra (b) (R) -CD spectra, measured in a mixed solvent of 0.1 mL of chloroform/ethanol mixed solvent (c) TEM image of nanotubes of (S)-10 (d) TEM image of the and (R)-10

圖10 化合物11的結(jié)構(gòu)示意圖以及在不同pH環(huán)境中的自組裝形貌Fig.10 Scheme of compound 11 and its self-assembly morphology in different pH environments

兩種全甲基化的環(huán)糊精連接在苝酰亞胺母核氮原子上形成了新的水溶性衍生物12[17]。該衍生物在水溶液中具有很強的π-π聚集特點，顯示出pH依賴的聚集行為和熒光性質(zhì)(圖11)。12在堿性環(huán)境下的結(jié)構(gòu)為中性形式的12-1，相對于有機溶劑其在水中的更強π-π堆積作用。酸性環(huán)境下質(zhì)子化形式的12-1H2，因為質(zhì)子化亞氨基之間的靜電排斥作用在苝酰亞胺母核的π-π堆疊中起到不利的作用，分子呈現(xiàn)單體和少量的低聚物存在形式。盡管如此，單體和12-1H2的低聚物顯示出熒光性能優(yōu)于中性形式，這是由于有效抑制了亞氨基的分子內(nèi)電子轉(zhuǎn)移過程所造成的。

圖11 化合物12在不同pH環(huán)境下的結(jié)構(gòu)示意圖(左圖) (a)，(b)均為12中性形式的透射電鏡和掃描電鏡照片 (c) 12質(zhì)子化形式的透射電鏡照片 (d) 12的pH依賴的聚集行為和熒光性質(zhì)示意圖，以上測試環(huán)境為水溶液Fig.11 Scheme of compound 12 in different pH environments (left); (a) and (b) are TEM and SEM pictures of compound 12 with the neutral form; (c) TEM pictures of compound 12 with the protonated form; (d) A schematic diagram of the pH-dependent aggregation behavior and fluorescence properties of 12, all measured in aqueous solution

2 N-取代苝酰亞胺衍生物的熒光性質(zhì)在生物學(xué)方面的應(yīng)用

苝酰亞胺被認為是一個封閉的發(fā)色團，存在S0→S1的躍遷，熒光量子產(chǎn)率幾乎是定量的，且產(chǎn)率與壽命也不受氧的影響。人們在N端進行著各種嘗試，引入對物質(zhì)有識別作用的基團，利用苝類衍生物具有的熒光性質(zhì)[18]產(chǎn)生具有特定結(jié)構(gòu)的金屬離子識別探針、熒光分子開關(guān)等[19-21]。PDI衍生物特有的熒光性質(zhì)可以應(yīng)用于細胞熒光成像、熒光標記和熒光載體等生物學(xué)檢測方面[22]。然而由于苝核在溶液中的堆積作用，溶液中形成分子聚集體的同時常常伴隨著熒光淬滅。有學(xué)者研究表明: 苝酰亞胺的熒光發(fā)射峰與取代基的位置有關(guān)[23]。 在酰亞胺結(jié)構(gòu)中的N原子上引入不同的取代基，并不會影響苝酰亞胺的紫外吸收和熒光發(fā)射峰的位置，但是可能會影響到該類衍生物的熒光量子產(chǎn)率。

文獻報道由單甘露糖修飾的含有雙甲基取代的環(huán)糊精結(jié)構(gòu)的苝酰亞胺衍生物13[24]表現(xiàn)出有效的光動力治療活性[25](圖12)。研究了其對人乳腺癌細胞(MCF-7)，宮頸癌細胞(Hela)，肺癌細胞(A549)和肝癌細胞(HepG2)細胞的光動力療法活性?；衔锉憩F(xiàn)出強大的光動力療法活性，其半數(shù)最大抑制濃度(IC50)分別為3.96、16.79、6.62和5.14 mmol/L，作為一種新型PDI分子表現(xiàn)出很高的光細胞毒性和活細胞成像應(yīng)用。

圖12 化合物13的結(jié)構(gòu)示意圖以及細胞成像Fig.12 Scheme of compound 13 and cell imaging

用烷氧基硅烷基團改性的兩種苝酰亞胺衍生物14和15與二氧化硅形成的納米粒子[26]，可有效地內(nèi)化到HEK293細胞中，且毒性低，并且具有很高的光穩(wěn)定性，在表達高水平熒光蛋白和/或與不同熒光染料共染的細胞中，兩種蛋白通常在光譜的可見光區(qū)域內(nèi)發(fā)射(圖13)。

圖13 烷氧基硅烷基團改性的兩種苝酰亞胺衍生物14、15結(jié)構(gòu)示意圖Fig.13 Scheme of t two perylene imide derivatives 14, 15 modified by alkoxysilane groups

水溶性的苝酰亞胺陽離子有很強的單體熒光性，如果在水溶液中自組裝聚集后，則熒光強度顯著下降(圖14)。文章中作者以含有苝酰亞胺骨架的季銨鹽16構(gòu)建了PDI-DNA絡(luò)合物[27]，通過DAN鏈斷裂檢測博來霉素(BLM)的方法。PDI基團對熒光團修飾的DNA片段具有較高的熒光淬滅效率，該方法顯示了低背景熒光和高靈敏度，BLM檢出限為0.2 nmol/L。

圖14 PDI-DNA絡(luò)合物通過DNA鏈斷裂檢測BLM的示意圖Fig.14 Scheme of PDI-DNA complex detecting BLM by DNA strand breaks

在苝核的“海灣”位置引入取代基，可以減少苝核在溶液中的進一步堆積，引起紫外吸收峰和熒光發(fā)射峰位置的紅移，因此能有效避開細胞的熒光背景，進而提高其在生物學(xué)檢測方面的應(yīng)用。近幾年，合成的基于苝酰亞胺核的樹狀大分子結(jié)構(gòu)中，由內(nèi)向外引入疏水基團，最外層為親水基團。這些衍生物顯示出強烈的紅色熒光，具有較高的水溶性、較好的光穩(wěn)定性、較低的細胞毒性和高的熒光量子產(chǎn)率。這部分在“海灣”位置改造苝酰亞胺和的樹狀苝核分子化合物的熒光性質(zhì)及其應(yīng)用將另外撰文討論。

3 結(jié)論及展望

文章介紹了基于苝酰亞胺骨架，通過共價鍵形成的具有特殊結(jié)構(gòu)的衍生物。聚集體在溶液中通過非共價鍵作用力形成了各種超分子組裝材料。調(diào)控衍生物分子結(jié)構(gòu)中側(cè)鏈或手性基團可以得到具有特定形貌的聚集結(jié)構(gòu)，在有機溶劑、混合溶劑、水溶液中還需要充分考慮到溶劑和pH環(huán)境的影響。通過協(xié)調(diào)好這幾種作用力和因素從而獲得結(jié)構(gòu)致密、功能優(yōu)良的超分子材料。各種連接在苝酰亞胺發(fā)色團骨架上的衍生物可以調(diào)節(jié)母核的熒光性質(zhì)，進而獲得多功能的熒光材料。水溶性的苝酰亞胺衍生物改變了該類染料難溶于水的缺陷，能夠?qū)⒛负颂赜械臒晒庑再|(zhì)用于生物學(xué)性質(zhì)測試。綜上所述，基于苝酰亞胺結(jié)構(gòu)，通過修飾母核上連接的取代基的結(jié)構(gòu)或是設(shè)計連接特定基團，可以增強其生物兼容性基團，得到更多的結(jié)構(gòu)豐富、性能優(yōu)越的納米分子材料，將其特有的熒光性質(zhì)應(yīng)用于生物體檢測和成像、以及藥物載體等方面。但是，仍然存在一些問題，例如水溶液中PDI的熒光量子產(chǎn)率低，未來將探索更簡單，更具選擇性和更具體的合成策略。 最終樹狀聚合物的無毒和多功能化仍是生物應(yīng)用中的挑戰(zhàn)。 如何在各個領(lǐng)域應(yīng)用熒光性能并探索以PDI為核心的樹枝狀聚合物的巨大潛力，將成為未來的熱門研究領(lǐng)域。