鵝星狀病毒XX株的分離鑒定及遺傳特征分析

金前躍，郭永剛，李俊朋，秦保亮，王寅彪，郭振華，王 麗，邢廣旭，鄧瑞廣，張改平,8

(1.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 動(dòng)物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450002； 2.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 中英禽病國(guó)際研究中心，河南 鄭州 450002； 3.江蘇高校動(dòng)物重要疾病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 揚(yáng)州 225009；4.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院 動(dòng)物醫(yī)藥學(xué)院，河南 鄭州 450046； 5.平頂山市農(nóng)業(yè)科學(xué)院 畜牧研究中心，河南 平頂山 467001；6.新鄉(xiāng)市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，河南 新鄉(xiāng) 453003； 7.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院 公共衛(wèi)生學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003；8.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，河南 鄭州 450002)

鵝星狀病毒(Goose astrovirus，GAstV)屬于星狀病毒科(Astroviridae，AstV)、禽星狀病毒屬(Avastrovirus，AAstV)，是一種無(wú)囊膜、單鏈正義RNA病毒[1]。GAstV基因組全長(zhǎng)6.1～7.9 kb，包含5′非翻譯區(qū)(UTR)、3′UTR及多聚腺苷酸(PolyA)尾及3個(gè)開放性閱讀框(ORF)，分別為編碼蛋白酶的ORF1a、編碼RNA聚合酶的ORF1b、編碼衣殼蛋白(Capsid)的ORF2[2-4]。禽星狀病毒主要分為3個(gè)群，分別為禽星狀病毒1群(AAstV-1)、禽星狀病毒2群(AAstV-2)和禽星狀病毒3群(AAstV-3)[5]。GAstV屬于禽星狀病毒1群(AAstV-1)，是一種新發(fā)的星狀病毒。

GAstV主要感染5～20日齡的雛鵝，臨床表現(xiàn)為嚴(yán)重痛風(fēng)癥狀。剖檢病死雛鵝，可見內(nèi)臟器官表面有大量尿酸鹽沉積，部分死亡雛鵝關(guān)節(jié)腔內(nèi)有白色尿酸鹽沉積，死亡率高達(dá)20%～70%[6-10]。

2017年以來(lái)，雛鵝痛風(fēng)病例在山東、江蘇、安徽、河南、遼寧、廣東等主要養(yǎng)鵝地區(qū)不斷出現(xiàn)，且呈上升趨勢(shì)，對(duì)國(guó)內(nèi)養(yǎng)鵝業(yè)造成了巨大影響。國(guó)內(nèi)多家科研單位相繼分離到GAstV，ZHANG等[11]從華南地區(qū)分離到了GD株，YANG等[12]和ZHANG等[13]分別從華北地區(qū)分離到了AstV/SDPY/Goose/1116/17、AAstV/Goose/CHN/2017/SD01株，徐蓉等[14]從華東地區(qū)分離到了JSHA株。河南省多地也出現(xiàn)了雛鵝痛風(fēng)疫情，病死鵝表現(xiàn)出典型的內(nèi)臟痛風(fēng)癥狀，給河南省養(yǎng)鵝產(chǎn)業(yè)造成了重大損失。

為明確GAstV河南流行株的基因組特征，從河南省新鄉(xiāng)市原陽(yáng)縣某鵝場(chǎng)采集了患有痛風(fēng)的病鵝樣品，通過(guò)盲傳和PCR檢測(cè)分離了GAstV，并對(duì)分離毒株進(jìn)行全基因組測(cè)序和遺傳特征分析，為有效防控雛鵝痛風(fēng)疫情提供技術(shù)支持,并為GAstV在河南省的流行病學(xué)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 主要試劑

DME/F12培養(yǎng)基購(gòu)自HyClone公司；青鏈霉素混合液、胰蛋白酶購(gòu)自Solarbio公司；胎牛血清購(gòu)自Gibco公司；Premix ExTaqDNA聚合酶、病毒基因組提取試劑盒(MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.5.0)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScript RT Master Mix)購(gòu)自Takara公司。

1.2 病料和細(xì)胞

患有痛風(fēng)的雛鵝來(lái)源于河南省新鄉(xiāng)市原陽(yáng)縣某鵝場(chǎng)。解剖后，收集肝臟、腎臟等組織，凍存于-40 ℃冰箱。雞肝癌細(xì)胞系(LMH)由本實(shí)驗(yàn)室保存，利用含10%胎牛血清的DME/F12培養(yǎng)基于含5% CO2的37 ℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

1.3 病料的處理

無(wú)菌條件下取適量病料，以1∶3的質(zhì)量體積比加入含青鏈霉素的無(wú)菌磷酸鹽緩沖液(PBS)徹底研磨。將組織研磨液收集于無(wú)菌Eppendorf管中，在-80 ℃和室溫間反復(fù)凍融3次，10 000 r/mim離心15 min，使用0.22 μm的濾器過(guò)濾上清液并凍存于-80 ℃冰箱。

1.4 病毒的分離

待細(xì)胞瓶中的LMH細(xì)胞生長(zhǎng)至約80%時(shí)，棄去培養(yǎng)基并用無(wú)菌PBS清洗3次。使用無(wú)血清DME/F12(含1 mg/L胰酶)培養(yǎng)基將上述處理后的病料研磨液稀釋50倍后接種于細(xì)胞上，在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中孵育1.5 h。然后棄去病毒液，加入含2%胎牛血清的DME/F12(含1 mg/L胰酶)培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)72 h。之后通過(guò)-80 ℃與室溫間反復(fù)凍融，2 000 r/min離心15 min，收集病毒液。無(wú)菌過(guò)濾后，再次接種于LMH細(xì)胞盲傳3代，然后繼續(xù)傳至第6代，獲得穩(wěn)定毒株。

1.5 病毒的鑒定

1.5.1 PCR檢測(cè) 根據(jù)AstV/SDPY/Goose/1116/17毒株(GenBank登錄號(hào)：MH052598.1)的RNA聚合酶基因ORF1b序列設(shè)計(jì)引物。PCR上游引物序列為5′-ACCCCTGGTTATCCAAAATTTAAGT-3′，下游引物序列為5′-CCGCCAGAAGAGAGGCTTGGGCAAC-3′，預(yù)期片段大小為420 bp。

按照病毒核酸提取試劑盒說(shuō)明書提取病毒總RNA，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲取病毒cDNA作為PCR模板。PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性95 ℃ 5 min；變性95 ℃ 30 s，退火58 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 1 min，循環(huán)30次；72 ℃延伸10 min，4 ℃停止反應(yīng)。GAstV ORF1b陽(yáng)性質(zhì)粒與PBS分別作為陽(yáng)性對(duì)照及陰性對(duì)照。采用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行鑒定。

1.5.2 全基因組測(cè)序 按照病毒基因組提取試劑盒說(shuō)明，提取GAstV的全基因組，反轉(zhuǎn)錄后交由杭州聯(lián)川生物進(jìn)行全基因組二代測(cè)序。

1.6 遺傳特征分析

根據(jù)分離毒株的全基因組測(cè)序結(jié)果進(jìn)行遺傳特征分析，主要包括同源性分析、系統(tǒng)進(jìn)化分析、ORF2編碼蛋白氨基酸序列比對(duì)。本研究所用毒株序列信息見表1。

表1 研究所用毒株序列信息

續(xù)表1 研究所用毒株序列信息

1.6.1 同源性分析 利用DNAStar軟件MegAlign中的Clustal W Method模塊，將分離株的全基因組、ORF1b、ORF2的核苷酸及氨基酸序列與GenBank中相關(guān)序列進(jìn)行同源性分析。

1.6.2 系統(tǒng)進(jìn)化分析 將分離株的全基因組序列與GenBank中禽星狀病毒相關(guān)序列進(jìn)行比對(duì)。利用Mega 6.06軟件中的Clustal W程序完成分離株全基因組序列比對(duì)，并采用鄰接法構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹，步長(zhǎng)值(Bootstrap value)設(shè)置為1 000。

1.6.3 ORF2編碼蛋白氨基酸序列比對(duì) 利用DNAStar軟件MegAlign功能的Clustal W Method模塊，將分離毒株與GenBank中GAstV流行毒株的ORF2編碼蛋白氨基酸序列進(jìn)行多重比對(duì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 患痛風(fēng)雛鵝臨床解剖特征

患病雛鵝解剖后可見明顯的全身性痛風(fēng)癥狀，腎臟腫大、發(fā)白，輸尿管、膽囊、關(guān)節(jié)腔內(nèi)都有尿酸鹽沉積，心臟、肝臟、腺胃、腸道也不同程度附著有白色尿酸鹽(圖1)。

2.2 分離毒株P(guān)CR鑒定結(jié)果

將處理過(guò)的病料研磨液接種LMH細(xì)胞(未見明顯的細(xì)胞病變)，收集1—6代病毒液，提取核酸并反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，進(jìn)行PCR檢測(cè)后，均擴(kuò)增得到了420 bp大小的條帶(圖2)，符合預(yù)期大小。表明成功分離了1株GAstV，命名為XX株。

M.DNA Marker；1—6.1—6代收集的病毒液；7.陽(yáng)性對(duì)照；8.陰性對(duì)照

2.3 分離毒株全基因組序列分析

本研究分離的GAstV XX株(GenBank登錄號(hào)：MN337323)的基因組全長(zhǎng)為7 252 bp，包含長(zhǎng)度為245 bp(1—245)的5′UTR和228 bp(7 025—7 252)的3′UTR，ORF包括ORF1a(246—3 350)、ORF1b(3 341—4 891)、ORF2(4 910—7 024)。ORF1a、ORF1b編碼非結(jié)構(gòu)蛋白，包含蛋白酶、RNA聚合酶等，ORF1a和ORF1b之間有10 bp的重疊序列；ORF2編碼病毒結(jié)構(gòu)蛋白，主要包括衣殼蛋白及其表面的刺突蛋白(Spike)。

2.4 分離毒株遺傳特征分析

2.4.1 同源性分析 全基因組及各基因序列的同源性分析結(jié)果(表2)表明，GAstV XX株基因組與導(dǎo)致雛鵝痛風(fēng)的代表性毒株GD、AstV/SDPY/Goose/1116/17、AAstV/Goose/CHN/2017/SD01的核苷酸同源性分別為98.1%、98.7%、98.7%。GAstV XX株的ORF1b、ORF2基因與導(dǎo)致雛鵝痛風(fēng)的代表性毒株GD、AstV/SDPY/Goose/1116/17、AAstV/Goose/CHN/2017/SD01核苷酸同源性為98.6%～ 99.4%，氨基酸同源性為98.6%～ 99.8%?？梢?，GAstV XX株與當(dāng)前導(dǎo)致雛鵝痛風(fēng)的流行毒株同源性較高。

表2 分離毒株與代表性毒株的同源性

2.4.2 系統(tǒng)進(jìn)化分析 為進(jìn)一步確定GAstV XX株與其他毒株的遺傳進(jìn)化關(guān)系，構(gòu)建了基于基因組的系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖3)。系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果顯示，GAstV XX株與當(dāng)前導(dǎo)致雛鵝痛風(fēng)的GD、AstV/SDPY/Goose/1116/17、AAstV/Goose/CHN/2017/SD01等毒株處于同一進(jìn)化分支，屬于禽星狀病毒1群。

圖3 GAstV的系統(tǒng)進(jìn)化分析

2.4.3 ORF2編碼蛋白氨基酸序列比對(duì) GAstV XX株的ORF2編碼蛋白氨基酸序列與其他流行毒株同源性較高，但也存在一些氨基酸位點(diǎn)的突變(表3)。這些突變主要集中在224(T→A)、225(Q→R)、379(P→T)、424(M→I)、464(N→A)、594(S→N)等位點(diǎn)。

表3 ORF2編碼蛋白氨基酸序列比對(duì)

3 結(jié)論與討論

禽星狀病毒可感染鴨[15]、雞[16]、火雞[17]等多種禽類，臨床常表現(xiàn)為肝臟、腎臟及腸道病變，但GAstV感染報(bào)道較少。本次暴發(fā)的GAstV感染可引起雛鵝嚴(yán)重痛風(fēng)癥狀，在禽星狀病毒中尚屬首次發(fā)現(xiàn)，與營(yíng)養(yǎng)性痛風(fēng)不同[18]，其具有極強(qiáng)的傳染性，即使在低蛋白質(zhì)日糧情況下也可發(fā)生。本研究分離了1株GAstV，對(duì)病毒進(jìn)行了全基因組測(cè)序，并對(duì)其遺傳特征進(jìn)行了分析。

前人研究發(fā)現(xiàn)，雞星狀病毒可引起LMH細(xì)胞病變[16]。本研究中，GAstV XX株能在LMH細(xì)胞上穩(wěn)定傳代，但病毒感染不引起細(xì)胞病變，具體原因有待進(jìn)一步研究。通過(guò)全基因組序列分析可知，GAstV XX株基因組全長(zhǎng)7 252 bp，主要編碼ORF1a、ORF1b、ORF2蛋白。GAstV XX毒株與當(dāng)前導(dǎo)致雛鵝痛風(fēng)的流行毒株同源性較高，均在97%以上，與代表性毒株GD、AstV/SDPY/Goose/1116/17、AAstV/Goose/CHN/2017/SD01的基因組核苷酸同源性分別為98.1%、98.7%、98.7%。

系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果表明，GAstV XX株與當(dāng)前導(dǎo)致雛鵝痛風(fēng)的流行毒株處于同一進(jìn)化分支，屬于禽星狀病毒1群，與鴨、火雞、雞星狀病毒進(jìn)化關(guān)系較遠(yuǎn)，存在較大差異。不同鵝源毒株ORF2編碼蛋白氨基酸序列分析表明，各流行毒株之間差異較小，僅存在部分氨基酸位點(diǎn)的突變。