單胺氧化酶熒光探針研究進(jìn)展

王曉鵬， 李永東*， 王建國(guó)

(1． 贛南師范大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院 江西省有機(jī)藥物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 江西 贛州 341000；2． 內(nèi)蒙古大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院 內(nèi)蒙古精細(xì)有機(jī)合成重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 內(nèi)蒙古 呼和浩特 010021)

1 引 言

單胺氧化酶(MAOs)是一類(lèi)黃素酶，主要在線(xiàn)粒體外膜上分布，可催化胺類(lèi)底物氧化成酮或醛，并產(chǎn)生過(guò)氧化氫和氨作為副產(chǎn)物[1-3]。MAOs有兩種亞型：MAO-A和MAO-B。它們雖然有70%的序列同源性[4-7]，但在許多方面存在差異，包括在細(xì)胞和組織中的分布、底物的特異性以及功能上的差異。MAO-A主要分布于兒茶酚胺能神經(jīng)元，代謝多種不同的神經(jīng)遞質(zhì)，并可被氯吉蘭(Clorgyline,CL)選擇性抑制(圖1)。MAO-B主要存在于星形膠質(zhì)細(xì)胞(某些情況下還存在于血清素能神經(jīng)元中)，作用于多巴胺(DA)和β-苯乙胺，可被優(yōu)降寧(Pargyline,PA)、雷沙吉蘭 (Rasagiline,RA)、司來(lái)吉蘭(Selegiline,SE)選擇性抑制。雖然MAO-A和MAO-B對(duì)不同底物的選擇性和特異性不同，但是它們?cè)诰S持生物胺代謝穩(wěn)態(tài)中共同發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。MAOs的過(guò)度激活會(huì)增加神經(jīng)毒性化合物的產(chǎn)生。MAOs功能障礙可引起阿爾茨海默病(AD)、帕金森病(PD)等多種神經(jīng)和精神疾病[8-14]。因此，設(shè)計(jì)開(kāi)發(fā)可靠的、特異性檢測(cè)這兩種同工酶的方法對(duì)于深入理解它們?cè)谏锵到y(tǒng)中的功能及MAOs相關(guān)疾病的臨床診斷和治療都具有重要意義。

圖1 幾種常見(jiàn)的單胺氧化酶抑制劑

迄今為止，科學(xué)家已經(jīng)建立了多種檢測(cè)MAOs活性的方法，如光譜法、生物發(fā)光法、酶聯(lián)免疫分析法、放射性標(biāo)記法及熒光探針?lè)ǖ萚15-18]。其中，熒光探針?lè)ň哂袡z測(cè)成本低、方便快捷、特異性強(qiáng)、靈敏度高、非侵入性等優(yōu)點(diǎn)，非常適用于對(duì)活細(xì)胞或活體小動(dòng)物中的生物酶進(jìn)行實(shí)時(shí)無(wú)損成像[19-24]。目前，MAOs熒光探針的開(kāi)發(fā)已經(jīng)取得了非常多的成果，根據(jù)其作用機(jī)制，我們把這些熒光探針?lè)譃榻Y(jié)合型和反應(yīng)型兩大類(lèi)，如圖2所示。本篇綜述對(duì)這兩大類(lèi)用于檢測(cè)MAOs的熒光探針進(jìn)行了系統(tǒng)詳細(xì)的介紹，闡述了其在MAOs相關(guān)疾病診斷和治療中的應(yīng)用，并進(jìn)一步對(duì)MAOs熒光探針的發(fā)展前景進(jìn)行了展望。

圖2 單胺氧化酶熒光探針示意圖

2 單胺氧化酶熒光探針

2.1 結(jié)合型單胺氧化酶熒光探針

結(jié)合型單胺氧化酶熒光探針一般是根據(jù)酶的抑制劑或天然底物與單胺氧化酶的高親和力設(shè)計(jì)而成的，一般包括三部分：(1)能夠通過(guò)共價(jià)鍵或非共價(jià)鍵與單胺氧化酶的活性位點(diǎn)作用的結(jié)合基團(tuán)；(2)可視化的熒光基團(tuán)；(3)防止熒光基團(tuán)在酶的活性位點(diǎn)產(chǎn)生較大位阻效應(yīng)的鏈接基團(tuán)。2012年，朱勍課題組[25]將2-烷氨基乙酰胺引入熒光素中合成了一個(gè)結(jié)合型單胺氧化酶熒光探針1，為了使熒光素遠(yuǎn)離MAOs結(jié)合位點(diǎn)，他們?cè)跓晒馑夭糠趾?-烷氨基乙酰胺之間引入了一個(gè)長(zhǎng)度為6個(gè)碳原子的烷基鏈。探針1可有效與MAO-A和MAO-B結(jié)合，并抑制其活性，IC50(酶活性被抑制一半時(shí)的抑制劑濃度)值分別為35.1 μmol/L和150.8 μmol/L。探針1可用于在活細(xì)胞內(nèi)標(biāo)記MAOs，在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生明顯的熒光發(fā)射。如圖3所示，探針1對(duì)MAOs的標(biāo)記過(guò)程主要分為三步：(1) 2-烷氨基乙酰胺與MAOs結(jié)合形成穩(wěn)定的化合物b；(2)在堿的作用下，被活化的黃素(Flavin)促使b發(fā)生氧化脫氨反應(yīng)，生成亞胺基化合物c；(3)化合物c被親核性的巰基進(jìn)攻生成d。熒光探針1可以非常方便地對(duì)MAOs進(jìn)行熒光成像，并且也是監(jiān)控MAOs相關(guān)疾病進(jìn)程的一個(gè)非常有前景的選擇。

圖3 (a)探針1的結(jié)構(gòu)；(b)探針1在MCF-7細(xì)胞中的熒光成像；(c)探針1共價(jià)鍵合標(biāo)記MAO的機(jī)理。

同年，Breinbauer等[26]根據(jù)MAOs抑制劑優(yōu)降寧和司來(lái)吉蘭的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)合成了一系列結(jié)合型MAOs熒光探針2～7(P1-P6)，如圖4所示。體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，含甲基取代的叔胺結(jié)構(gòu)的探針2、4、6能夠有效地與MAOs結(jié)合，而不含甲基取代的叔胺結(jié)構(gòu)的3、5、7對(duì)MAOs的標(biāo)記能力很弱。標(biāo)記的機(jī)理是：探針2、4、6叔胺結(jié)構(gòu)的N可被MAOs氧化，進(jìn)而輔酶FAD中的N原子可與氧化的探針發(fā)生Michael加成反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)探針對(duì)MAOs的標(biāo)記。探針2和4可用于研究活細(xì)胞或組織中MAOs的蛋白質(zhì)活性表達(dá)譜，因其出色的選擇性有望用于研究臨床藥物司來(lái)吉蘭的脫靶作用。這是文獻(xiàn)報(bào)道的第一個(gè)可用于標(biāo)記蛋白質(zhì)活性表達(dá)譜的結(jié)合型小分子熒光探針。

圖4 探針2～7的結(jié)構(gòu)

內(nèi)源性MAO-A表達(dá)量比較高時(shí)，探針4對(duì)MAO-B的特異性較弱。另外，探針4雖然能夠穿透細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞，但是其發(fā)光波長(zhǎng)較短，并不適合在細(xì)胞或者組織中對(duì)MAOs進(jìn)行熒光成像。2015年，新加坡國(guó)立大學(xué)姚少欽[27]課題組首次報(bào)道了兼具蛋白質(zhì)表達(dá)譜原位標(biāo)記和活細(xì)胞內(nèi)MAO-B熒光成像能力的小分子熒光探針8(M2)，如圖5(a)所示。探針8對(duì)MAO-B具有較強(qiáng)的特異性，即使在MAO-A過(guò)表達(dá)的情況下，也能保持對(duì)MAO-B的高特異性，探針8對(duì)MAO-B和MAO-A的IC50分別為10.8 nmol/L和379 nmol/L。探針8可采用原位標(biāo)記蛋白質(zhì)表達(dá)譜或活細(xì)胞成像的方式報(bào)告內(nèi)源性MAO-B的活性，并且能夠用于揭示帕金森病動(dòng)物模型中MAO-B表達(dá)水平與多巴胺能神經(jīng)元內(nèi)穩(wěn)態(tài)之間的關(guān)系。

開(kāi)發(fā)具有腫瘤靶向能力的高效抗癌試劑是現(xiàn)代腫瘤學(xué)研究的重要方向之一。近期研究結(jié)果表明，MAO-A水平升高與前列腺癌患者預(yù)后較差具有一定的相關(guān)性。MAO-A可誘導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，并通過(guò)產(chǎn)生大量的活性氧物種(ROS)放大腫瘤的乏氧效應(yīng)[28-31]。因此，開(kāi)發(fā)能夠特異性地靶向腫瘤組織的MAO-A抑制劑對(duì)于這類(lèi)癌癥患者具有重要的意義。Shih等[32]將MAO-A抑制劑氯吉蘭共價(jià)鍵合到近紅外花菁染料上，合成了一個(gè)兼具熒光成像和抗癌能力的熒光探針9(NMI)，如圖5(b)～(d)所示。探針9可抑制MAO-A的活性，IC50值為(3.8±0.3) μmol/L，可抑制前列腺癌細(xì)胞增殖及集落形成，降低轉(zhuǎn)移率和侵襲性。在小鼠前列腺癌異種移植物中，探針9可靶向腫瘤，而不在正常組織中富集，可有效降低腫瘤負(fù)荷。通過(guò)分析發(fā)現(xiàn)，腫瘤標(biāo)本中Ki-67+細(xì)胞和CD31+細(xì)胞明顯減少，說(shuō)明癌細(xì)胞增殖和血管生成變慢，同時(shí)腫瘤樣本中M30+細(xì)胞增多，說(shuō)明細(xì)胞凋亡加快。這使得探針9成為一種診斷和治療前列腺癌的新藥物。

圖5 (a)探針8的結(jié)構(gòu)；(b)探針9的結(jié)構(gòu)；(c)探針9對(duì)C4-2B前列腺癌荷瘤小鼠腫瘤的治療效果；(d)探針9在荷瘤小鼠體內(nèi)前列腺腫瘤的近紅外熒光成像。

聚集誘導(dǎo)發(fā)光(Aggregation-induced emission,AIE)概念自2001年提出以來(lái)，受到了人們的廣泛關(guān)注，近年來(lái)更是取得了長(zhǎng)足的進(jìn)展。AIE分子具有在溶液中不發(fā)光、而在聚集態(tài)或固態(tài)時(shí)具有強(qiáng)發(fā)光的獨(dú)特發(fā)光性質(zhì)，可有效解決傳統(tǒng)發(fā)光團(tuán)因聚集導(dǎo)致的熒光猝滅(Aggregation-caused quenching,ACQ)問(wèn)題。此外，AIE分子通常還具有發(fā)光強(qiáng)、光穩(wěn)定性好及Stokes位移大等性質(zhì)，因此，AIE材料已經(jīng)在化學(xué)/生物傳感[33]、生物成像[34-36]、工程材料等領(lǐng)域[37-47]取得了豐富的研究進(jìn)展。其中，四苯乙烯(TPE)更是作為AIE材料的明星分子被廣泛研究。具有AIE性質(zhì)的熒光團(tuán)(AIEgens)已經(jīng)成為開(kāi)發(fā)新型生物傳感器的一個(gè)強(qiáng)大而通用的平臺(tái)。朱勍課題組聯(lián)合新加坡國(guó)立大學(xué)劉斌教授團(tuán)隊(duì)[48]設(shè)計(jì)并合成了一系列基于TPE的熒光探針，用于檢測(cè)MAOs，如圖6所示。這些探針是基于探針與蛋白質(zhì)之間的特定相互作用而設(shè)計(jì)的，N-甲基苯基吡啶及其類(lèi)似物是MAO-A和MAO-B的抑制劑，對(duì)MAO-A和MAO-B都有很高的親和力，TPE作為4-位苯基吡啶的大取代基，有望使探針對(duì)MAO-A有更強(qiáng)的選擇性。在所開(kāi)發(fā)的6種探針中，探針11在加入MAOs后顯示出明顯的熒光增強(qiáng)，并對(duì)MAO-A表現(xiàn)出較高的特異性。探針11可作為MAO-A的非競(jìng)爭(zhēng)抑制劑，Ki(抑制常數(shù))值為17.1 μmol/L。并且，探針11可以靶向線(xiàn)粒體，特異性地監(jiān)控MCF-7細(xì)胞中的MAO-A活性。

圖6 AIE型MAO熒光探針10～15的結(jié)構(gòu)

雙光子熒光成像技術(shù)因其深的組織穿透深度可有效提高成像質(zhì)量，其近紅外較弱的激發(fā)能量也能有效地降低不必要的組織損傷。2019年，Kim等[49]設(shè)計(jì)合成了一個(gè)雙光子結(jié)合型MAOs熒光探針16(PCP-1)，如圖7所示。他們將MAO-A選擇性抑制劑嗎氯貝胺(moclobemide)共價(jià)鍵合到雙光子熒光團(tuán)上，以此來(lái)提高成像時(shí)的激發(fā)光穿透深度。探針16可特異性地與前列腺癌中過(guò)表達(dá)的MAO-A結(jié)合，產(chǎn)生強(qiáng)熒光發(fā)射，由此可區(qū)分MAO-A過(guò)表達(dá)的前列腺癌細(xì)胞和其他MAO-A低表達(dá)的癌細(xì)胞。同時(shí)，通過(guò)抑制MAO-A的活性，探針16可以有效抑制前列腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖及轉(zhuǎn)移，非常有望作為進(jìn)一步的體內(nèi)成像試劑，設(shè)計(jì)成靶向前列腺癌治療藥物。

圖7 (a)探針16的結(jié)構(gòu)；(b)探針16孵育LNCap細(xì)胞后細(xì)胞遷移24 h后的結(jié)果；(c)Western blot法分析探針16處理后的上皮向間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)相關(guān)標(biāo)志物E-cadherin、N-cadherin和Twist-1的表達(dá)情況。

2.2 反應(yīng)型單胺氧化酶熒光探針

結(jié)合型MAOs熒光探針在應(yīng)用于活體成像時(shí)往往難以準(zhǔn)確設(shè)計(jì)“點(diǎn)亮型”探針，因此，研究相對(duì)較少，發(fā)展也相對(duì)緩慢。而相對(duì)于結(jié)合型MAOs熒光探針，反應(yīng)型MAOs熒光探針則能從根本上克服這一缺陷。反應(yīng)型MAOs熒光探針通常是根據(jù)MAOs與底物的特異性催化反應(yīng)來(lái)設(shè)計(jì)的。將酶特異性的底物與熒光發(fā)色團(tuán)共價(jià)鍵合，當(dāng)MAOs與熒光探針的底物部分反應(yīng)后，導(dǎo)致探針結(jié)構(gòu)改變，就能夠有效地引起熒光團(tuán)的發(fā)光顏色或強(qiáng)度變化，從而起到檢測(cè)和監(jiān)控酶活性的作用。

早在20世紀(jì)末，科學(xué)家們就利用MAOs與底物的特異性反應(yīng)設(shè)計(jì)合成了能夠檢測(cè)MAOs的熒光探針，如圖8(a)所示。1996年，Silverman等[50]報(bào)道了利用E-2,5-二甲氧基桂皮胺鹽酸鹽(探針17)來(lái)直接檢測(cè)MAO-B的活性，探針17具有強(qiáng)熒光，在MAO-B的氧化作用下，氨基被氧化為醛基，熒光減弱，因此可以通過(guò)連續(xù)監(jiān)測(cè)熒光強(qiáng)度隨時(shí)間的減弱來(lái)快速有效地測(cè)定MAO-B的活性。1997年，Panchuk-Voloshina等[51]采用一種間接的方法來(lái)檢測(cè)MAOs的活性，如圖8(b)所示，他們利用商業(yè)化過(guò)氧化氫熒光探針18(Amplex?Red)在辣根過(guò)氧化物酶(HRP)存在的條件下通過(guò)監(jiān)控MAOs催化氧化苯乙胺生成的雙氧水副產(chǎn)物的方法來(lái)間接測(cè)定MAOs的活性，這種方法可檢測(cè)低至1.2×10-5U/mL的MAO-B，并可在牛腦組織勻漿中檢測(cè)MAO-A和MAO-B。然而，探針17的激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)太短，無(wú)法避免生物組織自發(fā)熒光的干擾，而后者為間接測(cè)定法。因此，這兩種方法均不適用于活細(xì)胞或活體組織、小動(dòng)物中MAOs的檢測(cè)。

圖8 探針17(a)和18(b)對(duì)MAO-B的響應(yīng)機(jī)制

為了擴(kuò)展MAOs熒光探針的應(yīng)用范圍，21世紀(jì)初以來(lái)，科學(xué)家們進(jìn)行了大量的探索和不斷的努力，成功開(kāi)發(fā)了眾多性能優(yōu)異的MAOs熒光探針，不斷延長(zhǎng)其激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)，并將其用于更為復(fù)雜的生物體系中。本研究進(jìn)展中，我們根據(jù)這些探針對(duì)MAO-A和MAO-B的特異性進(jìn)行分類(lèi)詳細(xì)介紹。

2.2.1 檢測(cè)MAOs總量的熒光探針

相較于能夠特異性檢測(cè)MAO-A或MAO-B的熒光探針，能夠檢測(cè)MAOs總量的熒光探針設(shè)計(jì)更為簡(jiǎn)單方便，并且也更容易商業(yè)化。2007年，Chang課題組[52]根據(jù)MAOs氧化氨基及隨后的β-消除反應(yīng)設(shè)計(jì)合成了兩個(gè)反應(yīng)型MAOs熒光探針19和20，如圖9(a)所示。探針19和20的激發(fā)和發(fā)射均位于可見(jiàn)光區(qū)域，與MAOs反應(yīng)后，熒光大幅增強(qiáng)，因此可用于活細(xì)胞內(nèi)MAOs的檢測(cè)。

為了避免細(xì)胞和組織自發(fā)熒光的干擾，2010年，Xing課題組[53]基于6-氯-2-(5-氯-2-羥基苯基)-4(3H)-喹唑酮(HPQ)衍生物設(shè)計(jì)合成了一系列反應(yīng)型MAOs熒光探針21～23，如圖9(b)所示。HPQ衍生物一般不溶于水，在固態(tài)具有較強(qiáng)的熒光，具有較大的Stokes位移(110 nm)，能夠有效避免細(xì)胞和組織自身發(fā)光的干擾，因此備受關(guān)注。該課題組將氨丙基基團(tuán)共價(jià)鍵合到HPQ分子中2-羥基上，有效地猝滅了HPQ分子的熒光。當(dāng)MAOs與探針?lè)磻?yīng)后，氨基被氧化并隨后發(fā)生自發(fā)的β-消除反應(yīng)，生成綠色熒光的HPQ沉淀物，可用于活細(xì)胞或組織內(nèi)MAOs的實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)。

圖9 (a)探針19和20的結(jié)構(gòu)及其對(duì)MAO的響應(yīng)機(jī)制；(b)探針21～23的結(jié)構(gòu)以及對(duì)MAOs的響應(yīng)機(jī)制；(c)探針24對(duì)MAOs的響應(yīng)機(jī)制。

朱勍課題組聯(lián)合新加坡國(guó)立大學(xué)姚少欽課題組[55]報(bào)道了第一個(gè)基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移機(jī)制(FRET)設(shè)計(jì)的反應(yīng)型MAOs小分子探針25a和25b，如圖10所示。該體系選用熒光素作為FRET的給體單元，選用具有長(zhǎng)發(fā)射波長(zhǎng)的Cy3作為能量受體單元，分別選用1-甲基-1，2，3，6-四氫吡啶及3-氨基丙基作為MAOs的響應(yīng)單元。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，探針25a對(duì)MAOs的響應(yīng)更加靈敏，并成功用于活細(xì)胞中MAOs活性的檢測(cè)。同年，朱勍課題組[56]還設(shè)計(jì)合成了另外一系列熒光素MAOs熒光探針26a～26d，如圖10所示。其中26a顯示出對(duì)MAOs的高活性，并可用于活細(xì)胞內(nèi)MAOs的活性檢測(cè)。

圖10 探針25～28的結(jié)構(gòu)

發(fā)射波長(zhǎng)位于650 nm以上的近紅外熒光探針能夠有效避免生物組織自發(fā)熒光的干擾，降低光對(duì)細(xì)胞和組織的損傷作用，并增加組織穿透深度。為此，2016年，Li等[57]設(shè)計(jì)合成了兩個(gè)具有近紅外發(fā)射的MAOs熒光探針27和28，如圖10所示。這兩個(gè)探針對(duì)MAOs都具有較高的靈敏度和特異性，Stokes位移可達(dá)227 nm，其中探針27對(duì)MAO-B響應(yīng)的檢測(cè)限為1.2 μg/mL。并且27具有低細(xì)胞毒性，可用于檢測(cè)HeLa細(xì)胞和HepG2細(xì)胞內(nèi)MAOs的活性。

近年來(lái)，隨著MAOs熒光探針技術(shù)的不斷進(jìn)步，人們?cè)絹?lái)越多地運(yùn)用熒光成像來(lái)直觀地觀察和研究MAOs與相關(guān)疾病的形成過(guò)程。2016年，Ahn課題組[58]利用雙光子熒光探針29研究帕金森綜合癥中Aβ斑塊的形成，監(jiān)控帕金森綜合癥的進(jìn)展過(guò)程。如圖11所示，探針29可同時(shí)監(jiān)測(cè)患帕金森綜合癥小鼠腦部MAOs的水平及Aβ斑塊形成之間的關(guān)系。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨著小鼠鼠齡的增加，小鼠腦部Aβ斑塊中及斑塊外部的熒光強(qiáng)度均不斷增強(qiáng)，表明小鼠帕金森綜合癥主要經(jīng)歷3個(gè)進(jìn)程：從出生到三月齡的緩慢啟動(dòng)階段、隨后的侵襲階段及9月齡后的飽和階段。該探針解釋了MAOs水平與小鼠帕金森綜合癥進(jìn)展之間的密切關(guān)系，進(jìn)一步證明MAOs可作為帕金森綜合癥的生物標(biāo)志物。

圖11 (a)探針29的結(jié)構(gòu)及其對(duì)MAOs的響應(yīng)機(jī)制；(b)轉(zhuǎn)基因小鼠和健康小鼠額皮質(zhì)區(qū)熒光成像；(c)圖(b)中Aβ斑塊及背景的平均發(fā)光強(qiáng)度關(guān)系圖；(d)背景熒光強(qiáng)度與斑塊體積關(guān)系圖。

2019年，湖南大學(xué)張曉兵課題組[59]設(shè)計(jì)合成了一種“雙重鎖定”的分子探針30(NML)用于精確成像及肝病區(qū)分，如圖12所示，探針30的第一把鑰匙是亮氨酸氨肽酶(LAP)，第二把鑰匙是MAOs。只有當(dāng)兩把鑰匙同時(shí)存在，相繼與探針30反應(yīng)后才能釋放出強(qiáng)熒光的NF。與單重鎖定的探針相比，探針30在藥物誘導(dǎo)肝臟損傷的熒光成像中表現(xiàn)出更高的準(zhǔn)確性。血清測(cè)定結(jié)果顯示，探針30在小鼠模型中能有效區(qū)分藥物誘導(dǎo)肝臟損傷及CCl4導(dǎo)致的肝硬化。并且，探針30還能用于準(zhǔn)確區(qū)分不同肝病患者的血清樣本，在不同肝臟疾病的診斷中具有廣闊的應(yīng)用前景。

圖12 探針30的結(jié)構(gòu)及其對(duì)MAOs的響應(yīng)機(jī)制

圖13 (a)探針31和32的結(jié)構(gòu)；(b)探針32對(duì)MAOs的識(shí)別機(jī)理。

前述反應(yīng)型MAOs熒光探針大多是采用3-氨基丙基或1-甲基-1，2，3，6-四氫吡啶作為響應(yīng)基團(tuán)的。2020年，川北醫(yī)學(xué)院的劉軍課題組[60]設(shè)計(jì)合成了以哌嗪為響應(yīng)基團(tuán)的反應(yīng)型MAOs熒光探針31和32，如圖13所示。其中探針32對(duì)MAOs的響應(yīng)更靈敏，并且可實(shí)時(shí)響應(yīng)，不需要孵育，如此迅速的響應(yīng)使得該探針顯示出比以往報(bào)道的MAOs熒光探針獨(dú)特的優(yōu)越性。同年，該課題組[61]基于對(duì)MAOs類(lèi)似的檢測(cè)機(jī)理,還設(shè)計(jì)合成了三芳基硼烷類(lèi)MAOs雙光子熒光探針33～35，如圖14所示。其中探針34對(duì)MAOs的響應(yīng)最佳，并可區(qū)分MAOs過(guò)表達(dá)的癌細(xì)胞與MAOs低表達(dá)的其他細(xì)胞。

圖14 探針33～35的結(jié)構(gòu)

2.2.2 特異性檢測(cè)MAO-A的熒光探針

MAO-A和MAO-B雖然都與神經(jīng)退行性疾病、發(fā)育性殘疾及嚴(yán)重智力障礙有關(guān)，但是它們的序列并不完全一致，在細(xì)胞及組織中的分布不同，底物及抑制劑不同。為了進(jìn)一步明確MAO-A和MAO-B的功能差異及其在相關(guān)疾病中所起的作用，非常有必要開(kāi)發(fā)特異性監(jiān)測(cè)MAO-A或MAO-B的熒光探針。

2016年，中科院化學(xué)所馬會(huì)民課題組[62]首次報(bào)道了特異性識(shí)別MAO-A的比率型熒光探針36a和36b，如圖15所示。該體系采用氨基丙基作為MAO-A的響應(yīng)基團(tuán)，具有比率型熒光變化的萘二甲酰亞胺作為熒光基團(tuán)，探針36a和36b與MAO-A作用后可產(chǎn)生藍(lán)色熒光到綠色熒光的比率變化，對(duì)MAO-B基本不響應(yīng)。36a和36b對(duì)MAO-A的檢測(cè)限分別為1.1 ng/mL和10 ng/mL。該課題組通過(guò)分子對(duì)接研究了探針36a對(duì)MAO-A及MAO-B的親和力，結(jié)果表明探針36a與MAO-A對(duì)接打分值(-lgKd)比MAO-B高近一倍，說(shuō)明探針36a與MAO-A的結(jié)合比MAO-B強(qiáng)，并且探針36a與MAO-A存在潛在的氫鍵作用。鑒于其對(duì)MAO-A具有更好的靈敏度，探針36a可用于實(shí)時(shí)檢測(cè)HeLa細(xì)胞和NIH-3T3細(xì)胞中MAO-A的表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，HeLa細(xì)胞中MAO-A的表達(dá)水平比NIH-3T3細(xì)胞中MAO-A表達(dá)水平高1.8倍，與商業(yè)化ELISA試劑盒所得結(jié)果一致。

圖15 (a)探針36a和36b的結(jié)構(gòu)；(b)探針36a和36b對(duì)MAOs響應(yīng)后的熒光比率變化；(c)探針36a在Hela和NIH-3T3細(xì)胞中的熒光成像。

2017年，該課題組[63]根據(jù)MAO-A抑制劑氯吉蘭的結(jié)構(gòu)進(jìn)一步設(shè)計(jì)合成了能夠特異性檢測(cè)MAO-A的熒光探針37～42。如圖16所示，探針39和40表現(xiàn)出對(duì)MAO-A的高特異性響應(yīng)，對(duì)MAO-A和MAO-B的響應(yīng)比分別為42和41倍。探針39可用于區(qū)分MAO-A高表達(dá)的SH-SY5Y細(xì)胞和MAO-B高表達(dá)的HepG2細(xì)胞。2021年，該課題組[64]根據(jù)類(lèi)似的思路開(kāi)發(fā)了兩種水溶性近紅外熒光探針43和44，其發(fā)射達(dá)到了708 nm，可以特異性識(shí)別MAO-A。其中探針43檢測(cè)限為4.5 ng/mL，對(duì)MAO-A的特異性是MAO-B的13倍。探針43已成功應(yīng)用于細(xì)胞、斑馬魚(yú)和荷瘤小鼠中MAO-A熒光成像，在腫瘤MAO-A的活性研究中展示出廣闊的應(yīng)用前景。

圖16 探針37～42的結(jié)構(gòu)

圖17 探針43～44的結(jié)構(gòu)及對(duì)MAO-A的響應(yīng)機(jī)制

隨后，廣西師范大學(xué)的覃江克和李俊課題組[65]根據(jù)相似的設(shè)計(jì)思路，開(kāi)發(fā)了特異性響應(yīng)MAO-A的近紅外熒光探針45～50。如圖18所示，這類(lèi)探針結(jié)構(gòu)中R基團(tuán)與其對(duì)MAOs的選擇性具有至關(guān)重要的作用，當(dāng)R基團(tuán)為Cl時(shí)，探針的靶向單元與MAO-A特異性抑制劑氯吉蘭的結(jié)構(gòu)非常類(lèi)似，因此探針47對(duì)MAO-A具有特異性響應(yīng)。探針46和48分別將R基團(tuán)改為F和Br，結(jié)構(gòu)仍與氯吉蘭相近，因此探針46和48也表現(xiàn)出對(duì)MAO-A的特異性。而探針45的R基團(tuán)為H，對(duì)兩種MAOs均有響應(yīng)。探針49和50的R基團(tuán)為甲基和甲氧基，可能由于空間位阻過(guò)大，導(dǎo)致這兩個(gè)探針對(duì)MAOs均不響應(yīng)。探針47成功用于斑馬魚(yú)及荷瘤小鼠腫瘤部位MAO-A的實(shí)時(shí)熒光成像，將成為深入了解MAO-A生理功能的新工具。同年，該課題組[66]又進(jìn)一步發(fā)展了可靶向線(xiàn)粒體的MAO-A特異性近紅外熒光探針51，如圖19(a)所示。探針51除了具有對(duì)斑馬魚(yú)和荷瘤小鼠中MAO-A特異性實(shí)時(shí)成像能力外，還首次用于檢測(cè)肝臟纖維化組織中MAO-A的活性，有望用作肝臟疾病的新型診斷工具。

2020年，南京工業(yè)大學(xué)的李林[67]聯(lián)合新加坡國(guó)立大學(xué)姚少欽和西北工業(yè)大學(xué)的黃維課題組設(shè)計(jì)開(kāi)發(fā)了用于MAO-A特異性檢測(cè)的雙光子熒光探針52，如圖19(b)所示。探針52的雙光子性質(zhì)使其可用于多種生物樣本中MAO-A的特異性熒光檢測(cè)，如MAO-A高表達(dá)的SY-SY5Y細(xì)胞、荷瘤小鼠及人膠質(zhì)瘤組織等。

圖18 (a)探針45～50的結(jié)構(gòu)和對(duì)MAO-A的響應(yīng)過(guò)程；(b)探針45～50對(duì)MAOs響應(yīng)的熒光強(qiáng)度變化； (c)探針47在斑馬魚(yú)中的熒光成像；(d)探針47在小鼠腫瘤中的熒光成像。

圖19 (a)探針51的結(jié)構(gòu)；(b)探針52的結(jié)構(gòu)及響應(yīng)機(jī)制。

2.2.3 特異性檢測(cè)MAO-B的熒光探針

MAO-B是MAOs的另一個(gè)亞型，通常用作藥物開(kāi)發(fā)的靶標(biāo)。2012年，朱勍課題組[68]利用MAO-B特異性的α-C—O鍵的氧化斷裂策略設(shè)計(jì)合成了一系列MAOs熒光探針53a～53c，如圖20所示。其中探針53a對(duì)MAO-B的響應(yīng)比MAO-A高出22倍。隨后，該課題組利用相同的策略設(shè)計(jì)合成[69]了一系列MAO-B特異性的熒光探針54a～54d，如圖21(a)所示，并將其用于活細(xì)胞中MAO-B的實(shí)時(shí)熒光成像。

圖20 (a)探針53a～53c的結(jié)構(gòu)；(b)探針53a～53c對(duì)MAO-B的選擇性響應(yīng)；探針53a與人MAO-A(c)和MAO-B(d)活性位點(diǎn)的結(jié)合方式。

圖21 (a)探針54a～54d的結(jié)構(gòu)；(b)探針55對(duì)MAO-B的響應(yīng)機(jī)制。

新加坡國(guó)立大學(xué)姚少欽課題組[70]報(bào)道了第一個(gè)可用于特異性檢測(cè)MAO-B的雙光子熒光探針55，如圖21(b)所示。探針55是基于MAO-A和MAO-B的活性部位的差異及分子對(duì)接結(jié)果篩選獲得的。MAO-A的活性部位包含一個(gè)單獨(dú)的體積為0.55 nm3的疏水空腔，而MAO-B的活性部位更長(zhǎng)更狹窄，包含一個(gè)入口空腔和一個(gè)疏水的底物空腔，體積分別為0.290 nm3和0.490 nm3。分子對(duì)接研究結(jié)果表明，探針55可緊密貼合MAO-B的底物空腔，其一級(jí)胺部分面向MAO-B中的輔酶FAD，因此探針55可對(duì)生物樣本中內(nèi)源性MAO-B表現(xiàn)出高靈敏度、高特異性，對(duì)MAO-B具有實(shí)時(shí)成像能力，并且還可用于檢測(cè)帕金森病人樣本中的MAO-B。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，帕金森病人淋巴細(xì)胞中MAO-B的表達(dá)明顯升高。探針55的開(kāi)發(fā)對(duì)帕金森綜合癥的研究具有重要意義。該研究結(jié)果為小分子成像技術(shù)在生物水平上探索MAO-B的化學(xué)和生物學(xué)結(jié)構(gòu)及功能提供了新的起點(diǎn)，也為基礎(chǔ)研究、診斷和藥物發(fā)現(xiàn)提供了有效的工具。

2018年，曲阜師范大學(xué)的陳令新課題組[71]開(kāi)發(fā)了近紅外MAO-B熒光探針56，如圖22所示。他們認(rèn)為該探針對(duì)MAO-B的高特異性可能來(lái)自于探針?lè)肿拥幕瘜W(xué)結(jié)構(gòu)對(duì)酶的空間位阻效應(yīng)。56可通過(guò)比率型近紅外熒光的變化特異性檢測(cè)雙氧水誘導(dǎo)的小鼠老齡化模型中的MAO-B，結(jié)果表明，小鼠模型中MAO-B的水平隨小鼠老齡化程度的增加而顯著升高。2019年，四川大學(xué)余孝其及李坤課題組[72]利用MAO-B催化的級(jí)聯(lián)反應(yīng)設(shè)計(jì)合成了對(duì)MAO-B特異性響應(yīng)的熒光探針57和58，如圖23所示。這兩個(gè)探針對(duì)MAO-B的檢測(cè)限分別為0.6 ng/mL和0.2 ng/mL，并能夠用于人星形膠質(zhì)腫瘤細(xì)胞U87中MAO-B的熒光成像。

圖22 (a)探針56的化學(xué)結(jié)構(gòu)；(b)用探針56評(píng)價(jià)抑制劑小鼠經(jīng)PA和SE處理后的MAO-B水平；(c)從圖(b)中分離得到的新鮮小鼠黑質(zhì)致密部腦組織切片熒光成像圖。

圖23 探針57和58的結(jié)構(gòu)

3 結(jié)論與展望

本文綜述了近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的檢測(cè)MAOs的結(jié)合型和反應(yīng)型熒光探針。有關(guān)MAOs熒光探針的研究雖已取得了長(zhǎng)足進(jìn)步，但仍有許多問(wèn)題有待于科學(xué)家們解決。(1)能夠準(zhǔn)確區(qū)分的MAO-A或MAO-B的熒光探針仍少之又少；(2)具有近紅外發(fā)射波長(zhǎng)對(duì)MAO-A或MAO-B高靈敏度、高選擇性的熒光探針的開(kāi)發(fā)仍極具挑戰(zhàn)性；(3)考慮到AIE探針聚集后仍保持高發(fā)光強(qiáng)度、良好的光穩(wěn)定性及較大的Stokes位移等獨(dú)特的光物理性質(zhì)，開(kāi)發(fā)具有AIE特性的MAOs熒光探針具有廣闊的發(fā)展空間；(4)具有高靈敏度的MAOs診療一體化熒光探針的開(kāi)發(fā)仍然十分有限；(5)MAOs熒光探針在臨床應(yīng)用中的開(kāi)發(fā)尚處于發(fā)展初期。盡管如此，隨著理論化學(xué)的不斷發(fā)展、更加準(zhǔn)確的計(jì)算方法的提出，我們堅(jiān)信，在國(guó)內(nèi)外理論與實(shí)驗(yàn)科學(xué)家的共同努力下，有關(guān)MAOs熒光探針的開(kāi)發(fā)有望更好地闡明MAOs在健康和疾病中的復(fù)雜作用，最終走向臨床應(yīng)用，從而造福人類(lèi)。

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