椰子SUT基因家族的生物信息學及其表達分析

姚慧玲 范海闊 劉蕊 肖勇

(1海南大學 海南?？?70228;2中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院椰子研究所 海南文昌571339)

蔗糖是絕大部分高等植物葉肉細胞都能夠生產(chǎn)的重要光合產(chǎn)物，是植物中糖運輸最為主要的形式，與植株的多種生理代謝活動存在緊密關聯(lián)，并在一定程度上決定了作物產(chǎn)量［1］。如果這種糖類在韌皮部進行長距離運輸，其應用的途徑主要包括兩條，分別為共質體和質外體［2］，其中后者在絕大部分植物的蔗糖運輸中具有不可忽視的地位。相關數(shù)據(jù)顯示，如果選擇質外體途徑，蔗糖轉移至篩管分子-伴胞復合體必須依托于多種蛋白，其中較有代表性的包括SWEET（Sugars will eventually be exported transporters）蛋白、蔗糖轉運蛋白等［3］。

蔗糖轉運蛋白（Sucrose Transporter，SUT）屬于易化子（Major facilitator superfamily，MFS）超家族［4］。菠菜SoSUT是非常具有代表性的植物SUT基因，通常來講，它與單子葉蔗糖轉運蛋白編碼基因存在緊密關聯(lián)，擁有該基因的作物較多，其中比較具有典型意義的包括水稻［5］、高粱［6］、玉米［7］等，此外，雙子葉蔗糖轉運蛋白編碼基因對于蔗糖轉運蛋白也非常重要，包含該基因的作物包括擬南芥［8］、陸地棉［9］等。水稻OsSUT分屬于單子葉SUT基因家族，其總共涵蓋5個蔗糖轉運基因。相關數(shù)據(jù)顯示，OsSUT1在多種植物部位都存在表達的情況［10-11］，其中比較主要的包括葉片、葉鞘等，而且它很大程度上決定了籽粒的充實情況［12］。另外，OsSUT3～5在蔗糖供應方面具有不可忽視的作用，它能夠為生長組織所需這趟的生產(chǎn)提供保障［5］，所以對植物SUT基因家族展開研究具有重要的價值。

椰子是一類十分具有經(jīng)濟價值的水果，全球大概有90個國家種植這種作物，當前種植面積大概1 200萬hm2，大概有8 000萬人從事與該作物相關的行業(yè)［13］。目前鮮見椰子SUT基因家族的相關報道。本文重點通過生物信息學對椰子SUT基因家族進行鑒定，對其展開綜合性的研究，主要涉及內(nèi)含子與外顯子結構、系統(tǒng)發(fā)育樹等多個方面，為進一步探討椰子CnSUT基因家族在其生長發(fā)育階段發(fā)揮的生物學功能提供參考。

1 材料與方法

1.1 椰子CnSUT基因家族的搜索與鑒定

從（GIGA）nDB（http：//gigadb.org/da‐taset/100347）下載椰子轉錄組序列、Ensembl plant（https：//plants.ensembl.org/index.html）下載水稻和擬南芥（全基因組序列中Su‐crose Transporter基因家族的蛋白序列信息。另外，本文通過SSH Secure Shell Client將水稻OsSUT基因家族蛋白序列與椰子轉錄組序列信息展開tblastn比對，e值設為1e-10，繼而獲取所需的CDs序列信息。將獲取的序列信息展開后續(xù)處理，應用MEGA工具對獲取的CDs序列進行翻譯，從而得到蛋白序列，通過HMMER（https：//www.ebi.ac.uk/Tools/hmmer/）配置的功能對CnSUT基因家族中不涵蓋結構域的序列進行預測，進而對CnSUT基因家族的成員進行鑒定。

1.2 椰子Cn S U T基因家族的蛋白理化性質分析

通 過ExPASy-ProtParam（https：//web.ex‐pasy.org/protparam/）對CnSUT基因家族蛋白質的各項理化性質進行運算，其中比較具有代表性的包括氨基酸數(shù)、親水指數(shù)等，然后在WOLF PSORT（https：//wolfpsort.hgc.jp/）對其完成亞細胞定位的預測。

1.3 椰子Cn S U T基因家族蛋白結構分析

通過NCBI的CDART（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/lexington/lexington.cgi？cmd=rps）和Smart（http：//smart.embl.de/）預測氨基酸的保守結構域；TMHMM Server v.2.0在線軟 件 （http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）對SUT蛋白的跨膜結構域展開研究，重點應用GeneDoc對24個CnSUT基因家族成員的蛋白序列進行分析，之后在網(wǎng)上下載保守結構域，進而繪制相應的logo，再利用MEME（https：//memesuite.org/meme/tools/meme）對比研究CnSUT家族蛋白的保守基序；除此之外，可通過SOPMA（https：//npsa-prabi. ibcp. fr/ cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html）對目標蛋白質實現(xiàn)二級結構預測

1.4 椰子Cn S U T基因家族進化樹分析

在網(wǎng)上下載椰子CnSUT基因家族成員內(nèi)含子與外顯子的有關信息，之后利用GSDS（https：//www.mybiosoftware.com/gsds-2-0-gene-struc‐ture-display-server.html）預測其整體結構，并結合預測的結果繪制相應的組成圖。在MEGA工具中應用鄰接法構建標準化的系統(tǒng)發(fā)育進化樹，并對其進行聚類分析。

1.5 椰子CnSUT基因家族在不同組織中的表達量分析

通過NCBI獲取椰子葉片（SRR1063404、SRR1063407、SRR1125016、SRR1173229、SRR1273180）與椰子胚（SRR1273070）、胚乳（SRR1265939）及胚愈傷組織（SRR1137438）的轉錄組數(shù)據(jù)。除此之外，本部分對CnSUT家族成員的RPKM（Reads Per Kilobase per Million mapped reads）展開系統(tǒng)性的分析，然后把全部資料錄入Mev工具（http：//mev.tm4.org/），并繪制標準化的圖像。

2 結果與分析

表1 椰子SUT家族成員基本信息

2.1 椰子Cn S U T基因家族的鑒定及理化性質與亞細胞定位

通過水稻OsSUT基因家族的序列和擬南芥At‐SUT基因家族的序列進行比較，進而獲取5條椰子基因序列，之后將其翻譯為蛋白質序列，并通過HMMER對其進行預測，得到的數(shù)據(jù)顯示，5條序列都存在結構域，根據(jù)其基因ID排序將其名稱設定為CnSUT1～CnSUT5（表1）。其氨基酸數(shù)處于446～605個，而對于CnSUT3和CnSUT5，其氨基酸總量最多能夠達到605 aa；基因分子量達到極小值的是CnSUT4，達到極大值的是CnSUT3；等電點主要處于6.3～9.37，CnSUT3和CnSUT5的PI未超過7，屬于典型的酸性蛋白質；余下的PI都超過7，屬于典型的堿性蛋白質。親水性指數(shù)主要處于0.334～0.603，為疏水性蛋白。亞細胞定位發(fā)現(xiàn)CnSUT基因家族位于質膜。

2.2 椰子CnSUT基因家族蛋白結構分析

Smart結果分析顯示，CnSUT基因家族是非常重要的蔗糖/H+共轉運體（圖1）?？缒そY構域研究顯示，椰子CnSUT蛋白總共涵蓋8～11個跨膜結構域，絕大部分CnSUT蛋白都存在10個跨膜結構域，主要涉及CnSUT1、CnSUT5等多種類型，此外，CnSUT4總共含有8個跨膜結構域，而CnSUT3涵蓋了11個跨膜結構域（圖2）；CnSUT蛋白都涵蓋于質膜，這個結果與亞細胞定位預測結果一致。

圖1 椰子SUT家族成員蛋白結構域分析

為深入探究椰子CnSUT基因家族蛋白所表現(xiàn)出的各項生物學特性，充分應用MEME工具，將10個保守motif作為主要條件展開統(tǒng)計計算，結果（圖3）表明，全部CnSUT家族成員都涵蓋多個基序，其中比較具有代表性的包括motif 1、motif 7等，它們都是CnSUT最保守的部分，其中有兩個成員涵蓋motif 1、motif 6、motif10等多個基序；進化分析結果（圖4）發(fā)現(xiàn)，同一亞族成員的保守基序類型存在非常高的共通性，而且CnSUT3和CnSUT5所對應的保守基序類型不存在任何差異。

圖2 椰子SUT蛋白的跨膜結構分析

圖3 椰子SUT基因家族motif分析

通過SOPMA對CnSUT基因家族蛋白質的二級結構進行預測，結果（表2）顯示，椰子CnSUT基因家族蛋白質存在多樣性的結構，其中比較具有典型意義的包括α-螺旋、無規(guī)卷曲等。CnSUT1、CnSUT2的蛋白質二級結構主要特點為α-螺旋＞無規(guī)卷曲＞β-折疊＞β-轉角，而CnSUT3、CnSUT4和CnSUT5的蛋白質二級結構主要特點為無規(guī)卷曲＞α-螺旋＞β-折疊＞β-轉角。綜上，α-螺旋和無規(guī)卷曲是該蛋白最為核心的結構。

2.3 椰子CnSUT基因家族結構及進化樹分析

GSDS結果（圖5）分析顯示，CnSUT家族成員外顯子的總量為4～14個，其中CnSUT2、CnSUT3、CnSUT5表現(xiàn)出一定的特殊性——都涵蓋14個外顯子。MEGA系統(tǒng)發(fā)育進化樹分析結果（圖6）顯示，其主要涉及CnSUT基因家族、AtSUT基因家族等類型。為了深入研究CnSUT家族成員、OsSUT基因家族存在的具體關聯(lián)，對多種植物的SUTs建立標準化的系統(tǒng)發(fā)育樹，之后對其展開綜合性分析，結果（圖6）顯示，亞組數(shù)量為5個，SUT1亞組內(nèi)全部為AtSUT家族，椰子CnSUT基因家族共涵蓋2個成員。SUT3主要涉及到水稻OsSUT基因家族，相應的成員數(shù)量為2，還關聯(lián)椰子CnSUT家族，相應的成員數(shù)量為1。而SUT5只涵蓋OsSUT基因家族成員。因此，椰子CnSUT基因家族都可以劃分3個亞族，SUT2、SUT3和SUT4。另外，椰子CnSUT基因家族與水稻OsSUT基因家族存在較近的親緣關系，而擬南芥則位列其次。

圖4 椰子SUT家族成員保守基序分布

2.4 椰子CnSUT基因家族表達量分析

在對椰子CnSUT基因家族基因號進行有效檢測之后，獲取椰子CnSUT基因家族在多種組織內(nèi)的FPKM值，之后通過lg函數(shù)對FPKM值展開處理，將處理的結果導入TBtools工具內(nèi)，以此建立完善的基因表達譜（圖7），結果表明，各類CnSUT基因家族成員在胚愈傷組織中均有表達，這表明其基因有較高的概率參與植物生長初期的分化。此外，CnSUT1表達水平相對較低，特別是在葉片內(nèi)其表達不多，重點在胚、胚愈傷等特定組織內(nèi)表達，這表明它與幼苗的生長具有緊密關聯(lián)，CnSUT3在多個部位表達量都較高，這表明它在椰子生長的整體周期都有作用；而CnSUT2和CnSUT4在所有部位表達量不存在任何差異，這表明其在椰子的生長周期中發(fā)揮的作用高度一致。

表2 椰子SUT基因家族的蛋白質二級結構對比分析

圖5 椰子SUT家族成員基因結構分布

圖6 椰子SUT家族成員系統(tǒng)進化樹分析

3 討論與結論

GPH（Glycoside-Pentoside-Hexuronide/cat‐ion symporter family）家族成員的來源非常復雜，其中比較具有代表性的包括細菌、真核生物等，蛋白結構能夠表現(xiàn)出相對較高的疏水性，序列具有許多保守性較強的氨基酸［14］，它的結構模型與MFS結構域非常相近。此外，其功能是將蔗糖轉移至韌皮部，從而實現(xiàn)養(yǎng)分的長途運輸［15］。結合數(shù)據(jù)庫提供的資料進行分析，GPH家族是非常重要的MFS超家族［16］，可以對CnSUTs的功能特性展開深入分析，CnSUTs是糖轉運蛋白中不可或缺的部分，其都屬于GPH/陽離子同向轉運蛋白家族，但不具備MFS結構域。然而各成員通常具有一定區(qū)別，比如，各成員涵蓋的跨膜結構總量不一致，主要處于8～11（圖2）。此外，亞細胞定位預測結果表明，各類CnSUTs通常處于質膜，有一定概率屬于膜結合蛋白。結合氨基酸序列建立標準化的系統(tǒng)進化樹，得到的結果表明，其家族成員能夠劃分為5個亞家族，與前人研究結果一致［17］。另外，SUT基因在多種類型的組織中都有分布，他們不但在“源”器官中發(fā)揮作用，并且對于“庫”器官的調(diào)控也非常重要，缺乏它就無法滿足蔗糖供給［14］。椰子SUTs家族與雙子葉擬南芥不存在緊密關聯(lián)，而CnSUT3和OsSUT4表現(xiàn)出較強的同源性，因此推測其作用相差不大。CnSUT3和CnSUT5與OsSUT4大多數(shù)情況下劃分至SUT2亞族，它是一類重要的蔗糖轉運蛋白［18］。相關數(shù)據(jù)顯示，在水稻萌發(fā)的胚內(nèi)OsSUT4的表達情況與另外的OsSUTs具有明顯區(qū)別，通過GUS染色法對OsSUT4的啟動子展開研究，可以發(fā)現(xiàn)該基因在黏糊層與胚內(nèi)都存在表達，因此可以推測OsSUT4在蔗糖轉移至萌發(fā)胚的環(huán)節(jié)中發(fā)揮了關鍵性作用［19］。由此可見，CnSUT3和OsSUT4參與了胚乳轉化成萌發(fā)胚的過程。

圖7 椰子SUT基因家族在不同組織器官中的表達譜分析

CnSUT1和CnSUT4與OsSUT2具有相對較高的同源性，CnSUT1、CnSUT4和OsSUT2都屬于SUT4，其亞族重點在庫器官內(nèi)表達，其中比較具有典型意義的包括次級葉脈、花和果實等［20］。因此可以推斷，CnSUT1和CnSUT4在初始階段的蔗糖積累中發(fā)揮了重要作用。

CnSUT2、OsSUT1和OsSUT3具有相對較強的同源性。對于椰子蔗糖轉運蛋白基因家族而言，CnSUT2主要分布于特定的分支，可以推測，CnSUT2與另外的成員具有比較明顯的功能差異。OsSUT1對葉片中碳水化合物含量不存在明顯影響。除此之外，OsSUT3能夠在多種庫器官內(nèi)高水平表達，但是它在種子內(nèi)的表達水平卻非常低［21］。在水稻幼葉中，OsSUT3能夠進行高水平的表達，其重點是為植物提供不可或缺的能量。水稻的穎果發(fā)育主要涉及到兩個部分：第一部分為細胞分化；第二部分涉及兩個環(huán)節(jié)，其分別為籽粒灌漿伸長與穎果增重。根據(jù)OsSUTs采用的主要表達模式，可以猜測OsSUT3的高表達能夠在上述2個環(huán)節(jié)中發(fā)揮銜接的作用［22］。所以，可推測CnSUT2能夠在幼葉發(fā)育的多個階段中發(fā)揮功能。