MiR-548d-3p調(diào)節(jié)過氧化氫刺激下人圓錐角膜成纖維細胞IL-1β的表達

王思佳，宋一菲，李曉娜，侯心淏，宋 婕，楊紀忠，

賀 瑞3b，陳維毅1，姚 蔚4

(1.太原理工大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院，太原 030024；2.韋仕敦大學(xué) 理學(xué)院，加拿大 倫敦 N6A 3K7；3.山西省眼科醫(yī)院 a.角膜病科，b.準分子激光室，太原 030002；4.山西醫(yī)科大學(xué) 口腔醫(yī)學(xué)院，太原 030001)

圓錐角膜(keratoconus，KC)是一種以角膜基質(zhì)變薄、失去正?；《榷l(fā)生錐形變形為特征的眼科臨床常見的致盲疾病，在全球范圍內(nèi)的患病率約為1/2 000.除遺傳因素外，揉眼、佩帶角膜接觸鏡、紫外線等環(huán)境因素在圓錐角膜疾病的發(fā)生、發(fā)展中也發(fā)揮了重要作用[1-2]。

氧化應(yīng)激是指體內(nèi)氧化與抗氧化作用失衡的一種狀態(tài)。正常生理條件下，細胞新陳代謝會不斷產(chǎn)生活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS)和活性氮自由基(reactive nitrogen species，RNS)等，自由基的產(chǎn)生和消除處于動態(tài)平衡狀態(tài)。當(dāng)細胞受到如紫外線、藥物等過度刺激時，體內(nèi)會產(chǎn)生過多的自由基，超出自身清除的能力，氧化與抗氧化系統(tǒng)平衡失調(diào)，致使氧化應(yīng)激的發(fā)生[3]。角膜是位于眼球前壁的一層透明無血管組織，基質(zhì)組織更新代謝的速率較慢。由于長期暴露于體表，吸收了絕大部分進入眼睛的紫外光線，使其更容易受到自由基的破壞，引起氧化應(yīng)激水平升高[4]。健康角膜中由超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶和谷胱甘肽還原酶組成的酶抗氧化系統(tǒng)，可有效地消除氧化副產(chǎn)物。有研究發(fā)現(xiàn)，圓錐角膜抗氧化系統(tǒng)異常時，體外培養(yǎng)的圓錐角膜患者的角膜細胞、角膜組織及血清中氧化應(yīng)激標志物和總氧化水平顯著增高[5-8]。前期研究發(fā)現(xiàn)人正常角膜和圓錐角膜細胞中超氧化物歧化酶-2、抗氧化酶血紅素氧合酶-1和NADPH氧化還原酶3種抗氧化酶的表達存在差異[9]。以上研究表明氧化應(yīng)激參與了圓錐角膜的發(fā)生、發(fā)展過程。

盡管圓錐角膜一直以來被定義為非炎癥進行性的角膜病變，但越來越多的實驗研究表明圓錐角膜與炎癥密切相關(guān)。與正常角膜對照發(fā)現(xiàn)，圓錐角膜患者淚液和血清中腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor，TNF-α)、細胞間黏附分子-1(intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1)、血管細胞黏附分子(vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1)、白介素(interleukin，IL)-1/-4/-5/-6/-8/-17等炎性因子表達均顯著升高[10-12]。氧化應(yīng)激可引起機體中炎癥介質(zhì)的過度釋放，過度或慢性炎癥刺激會引起組織蛋白酶表達增加，降解細胞外基質(zhì)，破壞組織結(jié)構(gòu)和微環(huán)境，使組織穩(wěn)態(tài)失衡。氧化應(yīng)激、炎性因子共同參與了圓錐角膜的發(fā)生、發(fā)展[13]。前期實驗對體外培養(yǎng)的圓錐角膜患者角膜成纖維細胞添加100 μmol/L過氧化氫處理4 h后發(fā)現(xiàn)，圓錐角膜成纖維細胞中炎性因子IL-1β/-6/-8、ICAM-1和基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)-1/-2/-3基因表達顯著上調(diào)，其中IL-1β上調(diào)幅度最大[13]。IL-1β能誘導(dǎo)許多炎癥相關(guān)基因的表達，在急性炎癥中被視為一種重要的免疫成分。如PM2.5可作用于肺上皮細胞，促進ROS的釋放，直接引起上皮細胞氧化損傷，促進巨噬細胞、肺泡上皮細胞中IL-1β、IL-6、TNF-α等炎性因子的分泌；氧化應(yīng)激也可刺激心肌細胞中IL-1β表達升高，從而誘發(fā)心肌炎癥反應(yīng)[14-15]。但圓錐角膜中IL-1β表達調(diào)控機制尚不清楚。

微小RNA(microRNA，miRNAs)是一類由21-25個核苷酸組成的內(nèi)源性非蛋白編碼單鏈RNA，作為重要的基因表達調(diào)控因子，miRNAs通過3′-UTR(untranslated region)端互補結(jié)合降解mRNA或抑制 mRNA的翻譯，在轉(zhuǎn)錄后水平對靶基因的表達進行調(diào)控。研究發(fā)現(xiàn)多種miRNAs在角膜組織中表達豐富，miRNAs的異常表達也在眼部疾病的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后中起重要作用[16-17]。此外，miRNAs參與調(diào)控機體內(nèi)氧化應(yīng)激水平，如在一定濃度過氧化氫誘導(dǎo)的人晶狀體上皮細胞氧化應(yīng)激中miR-34a表達水平顯著增加，下調(diào)miR-34a表達后可增加人晶狀體上皮細胞存活率[18]；miR-506/miR-124通過靶向KLF4和KLF5抑制過氧化氫誘導(dǎo)的人心肌細胞中ROS表達[19]。機體內(nèi)多種炎癥反應(yīng)與miRNAs密切相關(guān)，實驗研究表明miRNAs可通過直接靶定或靶定其他通路調(diào)控IL-1β、IL-8、IL-6、TNF-α和ICAM-1等多種炎性因子的表達[20]。MiRNAs是否參與了圓錐角膜成纖維細胞中IL-1β的表達調(diào)控有待深入研究。

本文通過生物信息學(xué)方法預(yù)測與IL-1β靶定的MiRNAs，研究過氧化氫刺激下人圓錐角膜成纖維細胞中MiRNAs對IL-1β及下游與基質(zhì)重塑相關(guān)基因的表達的影響，探討MiRNAs在圓錐角膜發(fā)生、發(fā)展中的調(diào)控作用，為圓錐角膜發(fā)病機制及診治提供新的潛在靶點。

1 實驗材料與方法

1.1 主要試劑

DMEM/F-12基礎(chǔ)培養(yǎng)基(Hyclone，美國)，胰蛋白酶(Gibico，美國)，Ⅱ型膠原酶(Sigma，美國)，過氧化氫(上海碧云天)，TRIZOL及Prime-ScriptTMRT reagent Kit檢測試劑(Takara，大連)，293T細胞株(來自中國科學(xué)院細胞庫)，lip-2000轉(zhuǎn)染試劑(Invitrogen，美國)，Dual-Luciferase 報告基因檢測系統(tǒng)試劑盒(promega，美國)。

1.2 人圓錐角膜成纖維細胞的提取及培養(yǎng)

實驗所需的人圓錐角膜成纖維細胞(hKCFs)取自山西省眼科醫(yī)院角膜術(shù)后廢棄病理組織。機械剝離角膜上皮和內(nèi)皮層，磷酸緩沖鹽溶液反復(fù)清洗后，用質(zhì)量濃度1 mg/mL Ⅱ型膠原酶的培養(yǎng)基消化，直至組織塊完全消失，鏡下可見單個細胞時終止消化。2 000 r/min離心5 min，棄上清，加入適量細胞培養(yǎng)基，吹勻后移入培養(yǎng)瓶中，37 ℃、體積分數(shù)5% CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.3 過氧化氫處理

采用100 μmol/L過氧化氫處理細胞12 h，以未做任何處理的細胞作為對照。處理結(jié)束后，磷酸緩沖鹽溶液清洗，用TRIZOL裂解細胞，用于RNA的提取。

1.4 IL-1β相關(guān)靶定miRNAs的預(yù)測

通過miRBase(http://www.mirbase.org/)和TargetScan(http://www.targetscan.org/)數(shù)據(jù)庫預(yù)測IL-1β相關(guān)靶定的miRNAs.對所得出的候選基因進行綜合分析，篩選出綜合得分較高的靶基因進行進一步研究。

1.5 熒光實時定量PCR(qRT-PCR)檢測炎性因子基因和MiRNAs表達

收集細胞裂解液，分別使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒提取mRNA，用Mir-XTM miRNA First-Strand Synthesis Kit試劑盒提取MiRNA，并進行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA.熒光實時定量PCR按照TB GreenTMPremic Ex TaqTMⅡ說明書操作，基因表達以GAPDH為內(nèi)參基因，MiRNA表達分析以U6為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCT法對基因表達進行相對定量分析。使用引物序列見表1.

表1 人目標基因引物序列Table 1 Human target gene primer sequence

1.6 熒光素酶報告基因檢測

本實驗使用的pmirGLO雙熒光素酶報告質(zhì)粒購于上海吉瑪公司，用PCR擴增包含MiR-548d-3p結(jié)合位點的野生型(WT)和含突變位點的IL-1β(MUT)片段，然后分別連接到pmirGLO載體，將pmirGLO-IL-1β WT或pmirGLO-IL-1β MUT與MiR-548d-3p及相應(yīng)對照轉(zhuǎn)染到293T細胞中。48 h后棄上清，細胞用磷酸緩沖鹽溶液清洗后加入PLB裂解液裂解細胞，收樣，所得細胞用于雙熒光素酶系統(tǒng)檢測。使用Dual-Luciferase 報告基因檢測系統(tǒng)試劑盒檢測螢熒光素酶活性，螢火蟲熒光素酶活性值(LUC)與海腎熒光素酶活性值(RLUC)的比值為相對熒光素酶活性。

1.7 MiR-548d-3p mimics及inhibitor的轉(zhuǎn)染

將MiR-548d-3p mimics(模擬物)、inhibitor(抑制劑)和NC(陰性對照)miRNA以20 μmol/L濃度通過lip-2000分別轉(zhuǎn)染到hKCFs中。在37 ℃、體積分數(shù)5% CO2條件下培養(yǎng)6～8 h后，用含抗生素的完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48 h后收樣。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

實驗結(jié)果以均值±標準差表示，采用SPSS 20.0統(tǒng)計分析軟件中的單因素方差分析法對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)處理，P<0.05認為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 IL-1β相關(guān)靶定MiRNAs的篩選

通過miRBase和TargetScan數(shù)據(jù)庫篩選出了8種與IL-1β有靶定關(guān)系的MiRNAs，即miR-21-5p，miR-24-3p，miR-26b-3p，miR-27b-5p，miR-181d-5p，miR-383-3p，MiR-548d-3p，miR-4700-3p，靶定位點如表2所示。

表2 IL-1β 3′UTR與相關(guān)MiRNAs靶定位點Table 2 Predicted MiRNAs binding sites in 3′UTR of IL-1β

2.2 過氧化氫刺激下調(diào)hKCFs中MiR-548d-3p和miR-4700-3p表達

100 μmol/L過氧化氫處理hKCFs 12 h，采用實時熒光定量PCR檢測氧化應(yīng)激對細胞中miRNAs基因表達的影響(圖1).與對照組比較，過氧化氫刺激下hKCFs中miR-21-5p和miR-181a-5p的表達無顯著變化(P>0.05)；miR-27b-5p的表達顯著增加，為對照組的2.14倍(P<0.05)；miR-24-3p、miR-26b-3p、miR-383、MiR-548d-3p和miR-4700-3p的表達下降，分別減少8%、32%、33%、40%、74%(P<0.05).其中MiR-548d-3p和miR-4700-3p表達與IL-1β呈負相關(guān)且下降最為顯著。

2.3 過氧化氫刺激下hKCFs中IL-1β、MiR-548d-3p和miR-4700-3p基因表達隨時間的變化

如圖2(a)所示，與0 h對照組相比，IL-1β的表達在過氧化氫刺激6 h、12 h和 24 h后均顯著增加，分別為對照組的22倍、33倍和20倍(均P<0.05).圖2(b)結(jié)果顯示，與0 h對照組相比，MiR-548d-3p的表達在過氧化氫刺激6 h、12 h和24 h后均顯著下降，分別減少了65%、92%和94%(均P<0.05).圖2(c)結(jié)果顯示，與0 h對照組相比，miR-4700-3p的表達只在過氧化氫刺激12 h和24 h后下降，分別減少了73%和61%(P<0.05)，但下降幅度均低于MiR-548d-3p.結(jié)果顯示在hKCFs中MiR-548d-3p與IL-1β負相關(guān)性更為明顯。

2.4 MiR-548d-3p與IL-1β存在靶定關(guān)系

如圖3所示，雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灲Y(jié)果顯示，MiR-548d-3p結(jié)合IL-1β 3′UTR 轉(zhuǎn)染后熒光素酶的活性下降了21%，表明MiR-548d-3p能夠作用于IL-1β 3′UTR區(qū)域；而將IL-1β 3′UTR區(qū)域進行突變后，熒光素酶的活性較野生型增加15%(P<0.05)，與對照組相比無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05).說明此突變位點可能為兩者結(jié)合的位點。因此，可以確定IL-1β是MiR-548d-3p的靶點，即 MiR-548d-3p參與了氧化應(yīng)激條件下hKCFs中IL-1β基因表達的調(diào)控。

*表示與各自對照組比較P<0.05圖1 過氧化氫對人圓錐角膜成纖維細胞中miRNAs基因表達的影響Fig.1 Gene expression of miRNAs in hKCFs exposed to H2O2

*表示分別與0 h對照組比較P<0.05圖2 過氧化氫刺激下人圓錐角膜成纖維細胞IL-1β(a)，MiR-548d-3p(b)和miR-4700-3p(c)基因表達隨時間的變化Fig.2 Gene expression of L-1β (a), MiR-548d-3p (b) and miR-4700-3p (c) with time in hKCFs exposed to H2O2

*表示與mimics NC比較P<0.05；#表示與IL-1β MUT mimics比較P<0.05圖3 雙熒光素酶報告基因表明MiR-548d-3p與IL-1β存在靶定關(guān)系Fig.3 Luciferase reporter assays showed that IL-1β is an authentic target ofMiR-548d-3p

2.5 MiR-548d-3p通過靶向IL-1β參與了過氧化氫刺激下MMP-1、MMP-3及CollagenI α2基因的表達調(diào)控

100 μmol/L過氧化氫處理細胞 12 h后，將MiR-548d-3p轉(zhuǎn)染到細胞中，48 h后收樣。QRT-PCR結(jié)果顯示，與各自mimics NC相比，對照組和過氧化氫組中MiR-548d-3p基因表達均顯著上升，分別為各自mimics NC的6 510倍和83 453倍(均P<0.05)；與各自inhibitor NC相比，對照組和過氧化氫組中MiR-548d-3p基因表達均顯著下降，分別減少了85%和19%(均P<0.05)，如圖4(a)-(b)所示。

轉(zhuǎn)染后IL-1β基因表達結(jié)果如圖4(c)-(d)所示。與對照組中mimics NC相比，過氧化氫組中IL-1β基因表達顯著上升，增加了23%(P<0.05)；與各自 mimics NC相比，對照組和過氧化氫組中IL-1β基因表達均顯著下降，分別減少了8%和59%(均P<0.05).與對照組中inhibitor NC相比，過氧化氫組中IL-1β基因表達顯著下降，減少了17%(P<0.05)；與各自inhibitor NC相比，對照組和過氧化氫組中IL-1β基因表達均顯著上升，分別增加了15%和36%(均P<0.05).MiR-548d-3p調(diào)控了IL-1β的表達。

圖4(e)-(g)顯示，MMP-1，MMP-3的表達隨MiR-548d-3p表達的升高而降低，CollagenI-α2的表達隨MiR-548d-3p表達的升高而升高。對照組和過氧化氫組中MMP-1基因表達均顯著下降，與mimics NC相比分別減少了20%和42%(均P<0.05)；對照組和過氧化氫組中MMP-3基因表達均顯著下降，與mimics NC相比分別減少了11%和58%(均P<0.05).隨MiR-548d-3p表達升高，對照組和過氧化氫組中CollagenI-α2基因表達均顯著增加，分別增加了16%和33%(均P<0.05).

NC為negative control；圖(a)-(d)中，*表示與各自mimics NC或 inhibitor NC比較P<0.05，#表示與對照組mimics NC或inhibitor NC比較P<0.05；圖(e)-(g)中，*表示與各自mimics NC比較P<0.05，#表示與對照組mimics NC比較P<0.05圖4 過氧化氫刺激下MiR-548d-3p mimics和inhibitor對人圓錐角膜成纖維細胞MiR-548d-3p, IL-1β, MMP-1, MMP-3, Collagen I-α2基因表達的影響Fig.4 Effects of MiR-548d-3p mimics and inhibitor on the gene expression of MiR-548d-3p, IL-1β, MMP-1, MMP-3, and Collagen I-α2

3 討論

作為一種在臨床中較為常見的致盲性疾病，圓錐角膜嚴重影響了患者的正常生活。目前圓錐角膜的發(fā)病機制尚不清楚，越來越多的研究表明，圓錐角膜不單純是遺傳性疾病，紫外線照射、慢性機械性損傷引起的氧化應(yīng)激等環(huán)境因素也在圓錐角膜的發(fā)病中發(fā)揮著重要作用[2]。

有數(shù)據(jù)顯示在衰老的人角膜成纖維細胞中IL-1β的表達和分泌水平明顯高于正常人角膜成纖維細胞；而對比正常人角膜和圓錐角膜患者的原代角膜基質(zhì)細胞的基因表達后，同樣發(fā)現(xiàn)IL-1β在圓錐角膜中的表達明顯升高。作為重要的炎癥調(diào)控因子，IL-1β的異常表達是多種角膜疾病的誘因[21-22]。IL-1β參與角膜損傷后的炎癥反應(yīng)和傷口愈合，研究發(fā)現(xiàn)IL-1β能夠抑制角膜上皮干細胞的增殖和干性并促進其分化[23]；過表達IL-1β還誘導(dǎo)了角膜上皮干細胞和內(nèi)皮細胞的衰老和凋亡[24]。本課題組的前期研究發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激對hKCFs中炎性因子及基質(zhì)重塑相關(guān)基因表達影響顯著，其中IL-1β上調(diào)幅度最大，提示IL-1β可能參與圓錐角膜疾病的發(fā)生、發(fā)展[25]。

RNA測序和多重質(zhì)譜分析顯示，圓錐角膜中膠原合成和成熟途徑以及分解代謝途徑發(fā)生變化，與正常角膜相比，圓錐角膜中Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白顯著減少[26-27]。Ⅰ型膠原是構(gòu)成角膜基質(zhì)的主要組分，在抵抗角膜變形中發(fā)揮重要作用。MMPs是一組降解膠原的酶類，在組織重塑和損傷修復(fù)中起重要作用，其表達增加可引起角膜基質(zhì)降解，與圓錐角膜的發(fā)生密切相關(guān)[28]。氧化應(yīng)激可通過上調(diào)多種MMPs的表達，參與皮膚損傷與動脈粥樣硬化等過程，前期研究發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激可顯著上調(diào)圓錐角膜成纖維細胞中MMP-1/-3的表達[29]。在前交叉韌帶成纖維細胞中，IL-1β的存在能促進MMP-1/-2/-3的表達[30]。本研究發(fā)現(xiàn)，hKCFs中IL-1β的表達MMP-1和-3趨勢一致，提示IL-1β促進了圓錐角膜MMP-1和-3的表達。

有研究發(fā)現(xiàn)，miRNAs在細胞生長、增殖、分化和凋亡等幾乎所有重要的生物學(xué)過程中都起著至關(guān)重要的作用，至少有30種miRNAs在角膜、晶狀體、視網(wǎng)膜等眼部組織中特異性表達，并與眼部疾病密切相關(guān)[31]。本研究發(fā)現(xiàn)，在過氧化氫刺激下，hKCFs中miR-24-3p，miR-26b-3p，miR-27b-5p，miR-383，MiR-548d-3p，miR-4700-3p等的基因表達存在差異，這些miRNAs可能與圓錐角膜發(fā)病有關(guān)。其中，MiR-548d-3p的表達在過氧化氫刺激6 h、12 h和24 h后均顯著下降，miR-548是一個超靈長類特異性miRNA基因家族，廣泛分布于幾乎所有的人類染色體上，尤其是6、8和X染色體。有研究表明造血干細胞中miR-548的過表達會抑制IL-1、IL-6和IL-8的釋放[32]。本文驗證了MiR-548d-3p與IL-1β之間存在靶定關(guān)系。在氧化應(yīng)激條件下，MiR-548d-3p模擬物可顯著下調(diào)hKCFs中IL-1β、MMP-1和MMP-3表達，上調(diào)CollagenI-α2表達。提示MiR-548d-3p在圓錐角膜的氧化應(yīng)激損傷介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)中發(fā)揮了重要作用。

綜上所述，本研究表明MiR-548d-3p可能通過靶定IL-1β進而調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激條件下hKCFs中MMP-1、MMP-3和CollagenI-α2的表達。提示當(dāng)圓錐角膜處于氧化應(yīng)激狀態(tài)時，可考慮針對關(guān)鍵的miRNA進行抗炎治療，降低角膜組織降解的風(fēng)險，減緩或組織圓錐角膜擴張的進程。