基于仿生DNA酶的腫瘤診療研究進(jìn)展

王勝峰，周文虎

（1. 中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院藥學(xué)部，湖南 長沙 410013；2. 中南大學(xué)湘雅藥學(xué)院，湖南 長沙 410013）

腫瘤是一種嚴(yán)重危害人類健康的重大疾病，發(fā)病率逐年增加[1]，但隨著病理學(xué)、醫(yī)學(xué)、藥學(xué)等多學(xué)科的發(fā)展，腫瘤的死亡率逐步得到有效控制，呈現(xiàn)逐年下降的趨勢[2]。目前，抗腫瘤藥物的研發(fā)已取得重大突破，但腫瘤治愈率依然較低，這與腫瘤的異質(zhì)性和復(fù)雜性有關(guān)。腫瘤具有獨特的病理生理特性，使其對多種腫瘤治療方法存在抗性。與此同時，腫瘤的早期癥狀一般不明顯，大部分腫瘤患者發(fā)現(xiàn)患病時已到中晚期。如果能早期診斷并及時治療，腫瘤患者的治愈率可顯著提高，且可明顯降低治療費用[3]。為此，腫瘤的早期診斷和治療引起研究者的廣泛關(guān)注，“腫瘤診療”的概念也應(yīng)運而生，其旨在協(xié)同實現(xiàn)腫瘤的早期診斷與精準(zhǔn)治療，為抗腫瘤研究提供新思路[4-5]。

為此，已有多種腫瘤診斷及預(yù)后的生物標(biāo)志物被發(fā)現(xiàn)[6]，其中腫瘤相關(guān)mRNA是研究熱點，其可通過小干擾RNA（small interference RNA，siRNA）進(jìn)行調(diào)控[7]，siRNA技術(shù)也于2006年獲得諾貝爾生理學(xué)獎。然而，siRNA在實際應(yīng)用中存在諸多瓶頸，如體內(nèi)易降解、免疫原性以及脫靶效應(yīng)等[8]。因此，發(fā)展可替代siRNA的RNA干擾（RNAi）工具，已成為領(lǐng)域內(nèi)的重要研究工作。核酶是具有催化活性的RNA，主要參與RNA的加工與成熟?；赗NA與DNA的結(jié)構(gòu)相似性，研究者們致力于探索是否存在具有催化活性的DNA。盡管在自然界中尚未發(fā)現(xiàn)此類DNA，但通過Selection技術(shù)，獲得一系列酶活性的DNA序列，并將其命名為DNA酶（DNAzyme）[9]。目前，已發(fā)現(xiàn)多種不同催化活性的DNA酶[10]。因此，DNA酶具有仿生特性，能模擬生物體內(nèi)核酶活性。

其中，具有RNA切割活性的DNA酶最為引人注目，能催化目標(biāo)RNA在特定位點水解，因其具有易合成修飾、廉價低毒、高特異性和高穩(wěn)定性的優(yōu)勢而備受青睞[11]。相比于siRNA，該DNA酶在RNAi的應(yīng)用中獨具優(yōu)勢。從化學(xué)角度看，以DNA為結(jié)構(gòu)骨架的DNA酶比siRNA穩(wěn)定106倍[12]。此外，DNA具有更低的免疫原性，且通過理性設(shè)計，可極大降低DNA酶對mRNA沉默的脫靶效應(yīng)。為此，DNA酶的催化活性被廣泛用作診斷性生物傳感器[13-14]，以及基于基因調(diào)控的治療藥物[15-16]。與此同時，利用其金屬依賴性活性，DNA酶已被應(yīng)用于構(gòu)建智能藥物遞送系統(tǒng)，實現(xiàn)藥物的刺激響應(yīng)釋放。然而，由于DNA酶的負(fù)電荷和親水性，無法自由通過體內(nèi)多重生物屏障。近年來，研究者們將納米材料與DNA酶結(jié)合，解決DNA酶在體內(nèi)應(yīng)用中的一系列瓶頸，已取得重要進(jìn)展[17]。本綜述首先闡述DNA酶的相關(guān)信息，包括其篩選過程、切割RNA的機(jī)制及代表性的DNA酶，進(jìn)一步介紹DNA酶在RNA干擾、腫瘤多模塊治療、腫瘤聯(lián)合診療以及刺激響應(yīng)藥物遞送中的應(yīng)用，并展望DNA酶在本領(lǐng)域內(nèi)的應(yīng)用潛力及發(fā)展方向。

1 DNA酶的篩選、RNA切割機(jī)制以及代表性 的RNA水解酶

目前自然界中還沒有發(fā)現(xiàn)DNA酶，DNA酶可通過體外Selection技術(shù)獲得，其基本過程（見圖1a）如下[9]：設(shè)計一段文庫DNA，該DNA包括聚合酶鏈反應(yīng)（polymer chain reaction，PCR）片段，互補(bǔ)配對片段、切割位點（含有1個RNA堿基）以及文庫片段（含有50個隨機(jī)DNA序列，即N50，每個堿基都有A/T/C/G 4種可能，因此文庫的容量為450）。如圖1b所示，DNA酶的篩選過程可分為5個步驟：1）在金屬離子作用下，切割rA位點的文庫（即具有RNA切割活性的DNA酶）可實現(xiàn)自我切割而變短；2）通過聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）收集這些序列；3）通過PCR對活性序列進(jìn)行擴(kuò)增；4）進(jìn)一步通過PCR對活性序列進(jìn)行擴(kuò)增；5）DNA分離純化，再生文庫序列以進(jìn)行下一輪選擇[18]。通過反復(fù)篩選和擴(kuò)增的循環(huán)過程（5～10輪），最終可從DNA隨機(jī)文庫中獲得DNA酶。值得注意的是，目前大多數(shù)DNA酶的篩選過程中，均需加入金屬離子作為特定的輔因子，以增強(qiáng)切割效率，這也模擬體內(nèi)大多數(shù)生物酶（包括核酶與蛋白酶）依賴金屬離子的特性。因此，目前篩選獲得的DNA酶均需依賴特定金屬離子激活。筆者本課題組前期開展大量工作，篩選并獲得一系列依賴于特定金屬離子的DNA酶，包括Na+[19]、Ca2+[20]、Mg2+[21]、Cr3+[22-23]、鑭系金屬[24]等。

篩選得到的DNA酶由2部分組成：底物結(jié)合臂和催化活性中心序列。底物結(jié)合臂在Waston Crick配對基礎(chǔ)上識別并結(jié)合至底物鏈上，可將DNA酶定向至切割位點；催化活性中心序列則在輔因子（金屬離子）存在的情況下形成了具有催化能力的特定二級結(jié)構(gòu)，通過破壞磷脂雙鍵來切割底物[25]。切割RNA機(jī)制如圖1c所示：通過去質(zhì)子化的水合金屬離子作為路易斯堿來實現(xiàn)RNA核苷酸2′-OH的去質(zhì)子化，使其成為更強(qiáng)的內(nèi)部親核基團(tuán)攻擊磷酸根中心，而游離金屬離子可以直接穩(wěn)定高負(fù)電荷的過渡態(tài)，從而切割底物鏈產(chǎn)生1個2′-3′環(huán)狀磷酸酯和1個5′-OH末端[26]。DNA酶對底物鏈的催化活性具有底物識別廣泛性、切割位點特異性、金屬離子依賴性等特點。目前，由于缺乏DNA酶的晶體結(jié)構(gòu)，金屬輔酶在DNA酶催化反應(yīng)的具體機(jī)制還不明確，但普遍認(rèn)為金屬離子的作用包括：1）穩(wěn)定DNA酶活性中心的空間構(gòu)象；2）直接參與催化反應(yīng)的過程[18,27]。

然而，通過Selection技術(shù)篩選獲得的大部分DNA酶只能切割嵌入單個RNA位點的DNA底物，如NaA43、Ce13d、EtNa等，主要用于特定金屬離子的檢測；在所報道的DNA酶中，僅有10-23型DNA酶和8-17型DNA酶可實現(xiàn)全RNA的定點切割。這2種酶能在RNA特定位點水解磷酸骨架（見圖1c），實現(xiàn)對RNA的切割，因而稱之為RNA水解酶，已廣泛應(yīng)用于基因RNAi的疾病治療[28-29]。如圖2所示，10-23型DNA酶是第10輪選擇性篩選后的第23個克隆，其結(jié)構(gòu)中包括15個核苷酸的催化活性中心和兩側(cè)的底物結(jié)合臂。在高濃度Mg2+存在下，10-23型DNA酶的催化效率與蛋白酶相當(dāng)，而且其顯著優(yōu)點是幾乎能切割任意靶RNA中的嘌呤-嘧啶連接，但是不同切割位點的切割效率不同，效率由高到低依次為GU、AU、GC、AC[30]。8-17型DNA酶是第8輪選擇性篩選后的第17個克隆，其結(jié)構(gòu)中包括13個核苷酸的催化活性中心，它由1個短的內(nèi)莖環(huán)和1個含有4個核苷酸的不配對區(qū)域組成。相對于10-23型DNA酶，8-17型DNA酶切割底物的多樣性相對較差，因為它要求在切割位點旁邊有1個G·T擺動配對[31]。在Mg2+存在下，8-17型DNA酶的切割效率比10-23型DNA酶更高[32]。

圖1 通過體外Selection技術(shù)獲得DNA酶的過程[18]Figure 1 The process of DNAzyme in vitro selection[18]

圖2 可實現(xiàn)全RNA定點切割的2種DNA酶的二級結(jié)構(gòu)Figure 2 Secondary structures of two DNAzymes that could cleave all-RNA substrates

2 DNA酶在基因沉默中的應(yīng)用

基因沉默是指生物體中特定基因在內(nèi)部或外在干擾下表達(dá)下調(diào)的現(xiàn)象，通過基因沉默技術(shù)探索疾病的發(fā)病機(jī)制與治療方法是目前生物醫(yī)學(xué)研究的熱點。相比于以RNA為結(jié)構(gòu)骨架的siRNA及微小核糖核酸（microRNA，miRNA）等RNAi工具，DNA酶在基因沉默應(yīng)用上有諸多優(yōu)勢，如穩(wěn)定性高、成本低、對目標(biāo)mRNA的切割不依賴于細(xì)胞內(nèi)分子機(jī)器等，是極具潛力的RNAi工具。截至目前，大量研究已經(jīng)表明DNA酶可作為多種疾病潛在的治療劑，已應(yīng)用于抗病毒、抗腫瘤、抗炎、抗菌以及抗動脈粥樣硬化等治療研究[16,33-35]。目前也已經(jīng)有一系列DNA酶進(jìn)入臨床試驗階段（見表1），至少有3種10-23型DNA酶在250例以上的腫瘤和其他疾病患者中進(jìn)行評估，目前沒有嚴(yán)重不良事件的報道。

表1 進(jìn)入臨床試驗的DNA酶Table 1 DNAzymes in clinical trial

靶向癌基因c-JunmRNA的DNA酶（DZ13）是首個進(jìn)入臨床試驗階段的DNA酶，用于結(jié)節(jié)性基底細(xì)胞癌的治療[36]。該I期臨床試驗招募9例患者，接受瘤內(nèi)注射DZ13，所有受試者均順利完成試驗。瘤內(nèi)注射DZ13后2周，患者經(jīng)手術(shù)切除腫瘤，并通過免疫組化和組織學(xué)方法與干預(yù)前的活檢結(jié)果進(jìn)行比較，結(jié)果表明經(jīng)DZ13治療后腫瘤組織中的c-Jun基因表達(dá)水平降低，且有5例患者腫瘤浸潤深度下降。此外，DZ13增加腫瘤細(xì)胞內(nèi)一系列凋亡標(biāo)志物的水平，也刺激炎癥和免疫細(xì)胞的浸潤。因此，DZ13被認(rèn)為是對基底細(xì)胞癌和c-Jun基因調(diào)控相關(guān)疾病具有潛力的基因治療手段。

3 DNA酶在腫瘤多模塊治療中的應(yīng)用

然而，基于DNA酶的RNAi在實際應(yīng)用中存在諸多爭議：其一是DNA酶的金屬離子依賴性，即只有在特定的金屬輔離子存在下，DNA酶才能被激活，且在一定范圍內(nèi)切割活性與金屬離子濃度呈正相關(guān)[41-42]，然而在人體生理條件下，相應(yīng)的金屬輔離子不足，導(dǎo)致DNA酶體內(nèi)切割效率較低；其二是DNA酶無法自由穿透細(xì)胞膜，細(xì)胞攝取率低。近年來研究者們做大量的工作來提高DNA酶的遞送效率和細(xì)胞內(nèi)的切割活性，如開發(fā)智能金屬納米儲庫、增強(qiáng)DNA酶的細(xì)胞攝取以及原位產(chǎn)生金屬輔離子來激活DNA酶，提高DNA酶的基因沉默效率[43-45]。同時，融入其他治療方式（如化療及光熱治療等），實現(xiàn)腫瘤多模塊治療與協(xié)同增效。

筆者課題組設(shè)計一系列基于DNA酶的腫瘤多模塊治療納米系統(tǒng)，包括基因/化學(xué)療法、化學(xué)/基因/光熱療法等以協(xié)同增強(qiáng)抗腫瘤活性。例如，在氧化鋅（zinc oxide，ZnO）納米核表面通過氧化自聚的方式形成聚多巴胺（polydopamine，PDA）外殼，并分別通過物理吸附和共價結(jié)合將多柔比星（doxorubicin，DOX）和氨基修飾的DNA酶裝載到PDA外殼上，以構(gòu)建整合化學(xué)療法（如DOX）、基因療法（如DNA酶）和光熱療法（如PDA）于一體的腫瘤多模塊治療納米系統(tǒng)（見圖3）。在該體系中，ZnO納米核充當(dāng)原位釋放金屬輔因子Zn2+的儲庫，進(jìn)入細(xì)胞后有效激活DNA酶沉默Survivin基因以提高腫瘤細(xì)胞對DOX的化療敏感性；PDA外殼具有優(yōu)異的近紅外光吸收能力和強(qiáng)大的光熱轉(zhuǎn)換效率，實現(xiàn)光熱治療；同時，PDA還可清除ZnO產(chǎn)生的活性氧從而降低ZnO的毒性，以提高載體的生物相容性；該體系經(jīng)靜脈注射后可被動富集于腫瘤部位，通過近紅外光照射，實現(xiàn)腫瘤多模塊治療（見圖3）[46]。與此設(shè)計類似，筆者課題組還利用金屬有機(jī)框架、MnO2納米片等納米金屬儲庫，構(gòu)建多種DNA酶遞送系統(tǒng)，這些設(shè)計的共同思路是實現(xiàn)DNA酶的有效跨細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運、胞內(nèi)激活以及與小分子化療藥物共遞送，被稱之為“三位一體”的DNA酶遞送策略，從而實現(xiàn)腫瘤的化療/基因治療/光熱療法的聯(lián)合治療[47-49]。

圖3 共載DOX與DNA酶的核殼納米粒用于化療/基因/光熱聯(lián)合治療示意圖Figure 3 Core-shell nanoparticles co-delivery DOX and DNAzyme for tumor chemo/gene/photothermal therapy

4 DNA酶在腫瘤聯(lián)合診療中的應(yīng)用

目前，可同時實現(xiàn)檢測和調(diào)控腫瘤相關(guān)基因的診療一體化智能體系已引起研究者的廣泛關(guān)注。其中，腫瘤的多模式成像在腫瘤診療中獨具優(yōu)勢，可實現(xiàn)腫瘤的多信號源顯像，從而提高腫瘤診斷的精確性與靈敏度。例如，劉曉慶課題組設(shè)計使用PDA-Mn2+的多功能納米載體（MnPDA），并通過化學(xué)鍵將DNA酶接載于載體表面，用于多模式成像引導(dǎo)下的基因調(diào)控和光熱療法[50]（見圖4a）。MnPDA可作為DNA酶的有效載體進(jìn)入腫瘤細(xì)胞并保護(hù)DNA酶免于降解，在胞內(nèi)谷胱甘肽（glutathione，GSH）作用下原位產(chǎn)生游離Mn2+來激活DNA酶以發(fā)揮基因調(diào)控。此外，該納米系統(tǒng)利用載體固有的光熱性能來實現(xiàn)光熱療法，并充當(dāng)光聲成像和核磁共振成像的造影劑從而為基因治療和光熱療法提供多模式的成像指導(dǎo)，以實現(xiàn)診療一體化。

DNA酶在納米材料上的物理吸附也可實現(xiàn)其在診斷及治療上的應(yīng)用。很多納米材料具有熒光淬滅能力，將光敏劑Ce6或熒光素FAM修飾于DNA酶末端，吸附于納米粒表面導(dǎo)致熒光被淬滅，識別目標(biāo)mRNA后DNA酶從納米載體表面釋放而恢復(fù)熒光，同時實現(xiàn)基因的檢測與沉默[51]。Tan課題組將DNA酶吸附于MnO2納米片表面并遞送入細(xì)胞，MnO2原位產(chǎn)生Mn2+增強(qiáng)DNA酶的切割活性，同時，通過在DNA酶的末端修飾Ce6，實現(xiàn)光動力治療協(xié)同抗腫瘤以及光敏劑熒光示蹤的診療一體化（見圖4b）[52]。

筆者課題組將多種功能核酸的優(yōu)點有機(jī)結(jié)合，設(shè)計了一種串聯(lián)功能核酸的多功能生物傳感器（aptamer-tethered，DNAzyme-embedded molecular beacon，ADB），通過將核酸適配體（aptamer，Apt）和DNA酶序列整合到分子信標(biāo)（molecular beacon，MB）結(jié)構(gòu)中，以實現(xiàn)同時檢測和調(diào)控腫瘤相關(guān)基因（見圖4c）[53]。在該結(jié)構(gòu)中，Apt負(fù)責(zé)對腫瘤細(xì)胞的特異性識別并將生物傳感器遞送到腫瘤細(xì)胞中，MB將開啟的熒光信號用于目標(biāo)基因的實時定量監(jiān)測，并且嵌入式DNA酶在胞內(nèi)Mg2+的激活下，實現(xiàn)對目標(biāo)mRNA的切割。因此，這類多種功能核酸的新穎組合可同時實現(xiàn)目標(biāo)基因的可視化與基因沉默。

在該研究基礎(chǔ)上，筆者課題組另外設(shè)計一種嵌入DNA酶催化活性中心序列的分子信標(biāo)（DNAzyme-embeded molecular beacon，DMB），并將其包載于ZIF-8納米粒中以構(gòu)建納米熒光探針[54]，其中DMB作為生物傳感器識別并檢測目標(biāo)基因，ZIF-8作為傳感器的遞送載體和金屬輔因子Zn2+的儲庫（見圖4d）。ZIF-8響應(yīng)腫瘤細(xì)胞內(nèi)酸性微環(huán)境而分解，釋放DMB與Zn2+；DMB識別靶mRNA，開啟熒光信號，并在Zn2+的激活下對mRNA進(jìn)行調(diào)控。本研究提供一種集基因檢測和調(diào)控于一體的多功能納米診療平臺。

圖4 DNA酶在腫瘤聯(lián)合診療中的應(yīng)用Figure 4 Application of DNAzyme in tumor theranostics

5 DNA酶在刺激響應(yīng)藥物遞送中的應(yīng)用

DNA酶的切割活性具有金屬離子依賴性，已被應(yīng)用于構(gòu)建智能藥物遞送系統(tǒng)，以實現(xiàn)藥物的刺激響應(yīng)釋放。Willner課題組在利用DNA酶實現(xiàn)刺激響應(yīng)藥物遞送方面做大量的工作。例如，首次提出DNA酶“cage”的概念，選取一系列熒光染料或化療藥物作為模型，包封在介孔二氧化硅（SiO2）的孔徑中，然后通過DNA酶對介孔進(jìn)行封堵（見圖5a）[55-56]。在目標(biāo)金屬Mg2+或Zn2+的存在下，DNA酶被激活以切割底物，破壞帽蓋結(jié)構(gòu)從而釋放孔徑中的內(nèi)容物。這種納米系統(tǒng)的邏輯門操作提升診療平臺的可控性，其中目標(biāo)金屬激活DNA酶釋放熒光染料以產(chǎn)生可檢測的熒光信號，而釋放的藥物可實現(xiàn)疾病的治療。

Willner課題組也嘗試使用pH或金屬離子響應(yīng)性的DNA酶作為鎖定結(jié)構(gòu)，使用“點擊化學(xué)”方法構(gòu)建刺激響應(yīng)性核酸功能化的金屬有機(jī)框架納米粒（NMOF）（見圖5b）[57]。第1種pH響應(yīng)性NMOF裝載熒光染料或化療藥物DOX，并通過pH響應(yīng)性DNA酶結(jié)構(gòu)作為蓋帽部分將其鎖定于NMOF中，在酸性環(huán)境下蓋帽部分解鎖從而釋放內(nèi)容物。第2種金屬離子響應(yīng)性NMOF同樣裝載熒光染料或DOX，并以Mg2+或Pb2+依賴性DNA酶組成的復(fù)合結(jié)構(gòu)作為蓋帽部分，在目標(biāo)金屬離子存在下，DNA酶被激活從而解鎖蓋帽以釋放孔徑中的內(nèi)容物。相比于圖5a的設(shè)計，該研究在納米載體表面修飾可特異性識別腫瘤細(xì)胞的核酸適配體，從而提高腫瘤靶向效率。

圖5 DNA酶在刺激響應(yīng)藥物遞送中的應(yīng)用Figure 5 Application of DNAzymes in stimulus-responsive drug delivery

6 結(jié)語與展望

隨著DNA體外篩選技術(shù)的發(fā)展，一系列具有RNA切割活性的DNA酶相繼被發(fā)現(xiàn)，并廣泛應(yīng)用于腫瘤的診斷與治療研究中。DNA酶是極具潛力的RNAi工具，目前的臨床試驗結(jié)果表明DNA酶在基因治療中具有良好安全性和耐受性。相比于siRNA等，DNA酶具有穩(wěn)定性高、特異性好、價格低廉、無免疫原性等優(yōu)勢。但是DNA酶無法自由穿透細(xì)胞膜，且體內(nèi)的激活能力有限，因此其RNAi能力飽受爭議。為此，在基于仿生DNA酶的腫瘤診療應(yīng)用中，需要理性設(shè)計納米載體以實現(xiàn)DNA酶的體內(nèi)靶向遞送及靶部位激活。與此同時，聯(lián)合DNA酶與其他治療方式的腫瘤多模塊協(xié)同增效，及DNA酶介導(dǎo)的刺激響應(yīng)藥物釋放是未來重要的研究方向。基于DNA酶的診療一體化研究方興未艾，通過引入熒光染料或其他影像造影劑可為疾病治療提供可視化引導(dǎo)，據(jù)此構(gòu)建診療一體化探針有助于治療進(jìn)展的實時監(jiān)測。期待性能更優(yōu)的DNA酶被發(fā)現(xiàn)，并設(shè)計合理的遞送系統(tǒng)，實現(xiàn)DNA酶的臨床轉(zhuǎn)化。