Plackett-Burman聯(lián)用響應(yīng)面法優(yōu)化超聲波-酸法提取狐臭柴果膠工藝

李揚(yáng),楊寧線,謝國(guó)芳,王艷秋,陽(yáng)嬌,張明生*

1(貴州大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,貴州 貴陽(yáng),550025) 2(山地植物資源保護(hù)與種質(zhì)創(chuàng)新教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,貴州 貴陽(yáng),550025)

果膠是植物初生細(xì)胞壁和中層細(xì)胞膜中的一類(lèi)復(fù)合多糖,為復(fù)雜的天然高分子聚合物。果膠的相對(duì)分子質(zhì)量為10 000～400 000其主要成分為由α-1,4-糖苷鍵鏈接的半乳糖醛酸與鼠李糖、半乳糖、阿拉伯糖等中性糖形成的聚合物。根據(jù)酯化程度的不同,果膠可分為高酯化度果膠(酯化度>50%)和低酯化度果膠(酯化度<50%)[1-2]。果膠具有凝膠、增稠和乳化等多種功能,是一種安全、實(shí)用的食品添加劑,可以從植物特定部位提取,如蘋(píng)果皮、香蕉皮和葵花籽盤(pán)等[3-5]。然而,有關(guān)狐臭柴葉片果膠提取的研究還很有限。

狐臭柴(PremnapuberulaPamp)屬馬鞭草科豆腐柴屬的落葉灌木,在我國(guó)主要分布于貴州、廣東、廣西、四川、重慶、云南等省區(qū),生長(zhǎng)于海拔500～1 200 m的常綠闊葉林下或路邊灌木林中[6]。安全性評(píng)估表明,豆腐柴屬植物的葉片既可用于功能食品開(kāi)發(fā)又可作為提取果膠的材料,產(chǎn)品安全且具有較高營(yíng)養(yǎng),還能發(fā)揮保健作用[7]。本課題組前期工作中已建立狐臭柴種苗繁育技術(shù)[8]和種植示范基地,其果膠的開(kāi)發(fā)利用是后續(xù)的重點(diǎn)工作。

目前,植物中果膠的提取方法有酸提醇沉法、草酸銨法、酶法、堿法、離子交換法、微波法、超聲波法等[9-12]。酸提醇沉法較為常規(guī),在果膠工業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用較多[13]。本研究采用了超聲波輔助與酸提醇沉結(jié)合的方法提取狐臭柴葉片果膠,利用超聲波的空化效應(yīng)促使植物組織破壁、內(nèi)含物充分溶出,之后通過(guò)低成本酸液提取果膠。本研究采用超聲波輔助法,在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上,運(yùn)用Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)合Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化提取條件以提高果膠得率,并對(duì)果膠的分子結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)進(jìn)行分析,建立果膠高效提取優(yōu)化工藝,以期為狐臭柴果膠產(chǎn)業(yè)化開(kāi)發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實(shí)驗(yàn)材料：狐臭柴(P.puberulaPamp)野生資源來(lái)自貴州省務(wù)川仡佬族苗族自治縣,經(jīng)貴州大學(xué)熊源新教授鑒定,已在貴州大學(xué)實(shí)驗(yàn)基地人工種植多年,狐臭柴葉片集中在8月份采摘。

檸檬酸,天津市永大化學(xué)試劑有限公司；D-(+)-半乳糖醛酸、D-葡萄糖、L-鼠李糖、D-半乳糖、D-阿拉伯糖、D-葡萄糖醛酸、D-甘露糖、D-木糖、L-巖藻糖,上海源葉生物科技有限公司；鹽酸羥胺、肌醇、酚酞、柑橘皮果膠,生工生物工程(上海)股份有限公司；1,1-二苯基-2-苦基肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH),東京化成工業(yè)株式會(huì)社；以上均為分析級(jí)。食品級(jí)果膠,河南萬(wàn)邦實(shí)業(yè)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

L18-Y68型破壁機(jī),山東九陽(yáng)股份有限公司；H4-20KR冷凍離心機(jī),湖南可成儀器設(shè)備有限公司；101-3A型電熱鼓風(fēng)干燥箱,天津市泰斯特儀器有限公司；超聲波細(xì)胞破碎儀,南京舜瑪儀器設(shè)備有限公司；Agilent 1260 Infinity 高效液相色譜儀、7890A-5975C氣質(zhì)聯(lián)用儀,美國(guó)安捷倫科技有限公司；Nicolet iS50傅里葉變換紅外光譜儀,美國(guó)賽默飛世爾科技公司；TAXT plus質(zhì)構(gòu)儀,英國(guó)Stable Micro System公司；SepectraMax 190型微孔板檢測(cè)系統(tǒng),美國(guó)美谷分子儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 葉片果膠提取工藝及果膠得率計(jì)算

取-80 ℃冰箱保存的凍葉于料理機(jī)加入酸提液打成勻漿,在設(shè)計(jì)的酸液pH、液料比、超聲時(shí)間、超聲功率、提取溫度和提取時(shí)間的條件下,用檸檬酸溶液提取5 g樣品,先使用超聲波細(xì)胞破碎儀處理樣品,再放入水浴鍋中隔水浸提,提取完成后6 000 r/min離心10 min,取上清液。加入1.2倍體積無(wú)水乙醇密封靜置6 h,用100目過(guò)濾網(wǎng)過(guò)濾,沉淀物再加20 mL 體積分?jǐn)?shù)為95%乙醇進(jìn)行脫色處理,攪拌均勻,密封靜置1 h后用100目過(guò)濾網(wǎng)過(guò)濾,取沉淀物于40 ℃鼓風(fēng)干燥后磨粉,所得干燥品為果膠干粉,果膠提取率按公式(1)計(jì)算：

(1)

式中：m,果膠干燥品質(zhì)量,g；m0,葉片質(zhì)量,g。

1.3.2 葉片果膠單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

設(shè)定酸液pH 2.00、液料比12∶1、超聲時(shí)間15 min、超聲功率500 W、提取溫度80℃、提取時(shí)間90 min，固定此水平值，分別考查酸液pH(1.5、1.75、2.00、2.25、2.50)、液料比(8∶1、10∶1、12∶1、14∶1、16∶1)、超聲時(shí)間(5、10、15、20、25 min)、超聲功率(300、400、500、600、700 W)、提取溫度(70、75、80、85、90 ℃)、提取時(shí)間(30、60、90、120、150 min)對(duì)果膠得率的影響。

1.3.3 葉片果膠提取Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)前期單因素預(yù)試驗(yàn)結(jié)果,對(duì)酸液pH、液料比、超聲時(shí)間、超聲功率、提取溫度和提取時(shí)間共6個(gè)因素進(jìn)行考查,每個(gè)因素選取高低2個(gè)水平,另設(shè)3個(gè)虛擬列,設(shè)計(jì)N=12的Plackett-Burman試驗(yàn)(表1)。

表1 果膠提取Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素及水平

1.3.4 葉片果膠提取Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在1.3.3試驗(yàn)基礎(chǔ)上,以pH、液料比、超聲功率和提取時(shí)間為自變量,通過(guò)Box-Behnken設(shè)計(jì)4因素3水平的響應(yīng)面試驗(yàn)(表2),以果膠提取率為響應(yīng)值,考查各因素對(duì)于響應(yīng)值的影響程度,以得出最佳工藝條件。

表2 果膠提取Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平

1.3.5 葉片果膠半乳糖醛酸含量和酯化度測(cè)定

果膠的半乳糖醛酸采用咔唑-硫酸法[14]測(cè)定;果膠的酯化度采用滴定法[15]測(cè)定。

1.3.6 葉片果膠分子質(zhì)量與單糖組成測(cè)定

果膠分子質(zhì)量測(cè)定方法：采用高效凝膠滲透色譜法測(cè)定果膠樣品的分子質(zhì)量分布,色譜檢測(cè)條件：RI示差折光檢測(cè)器；PL aquagel-OH MIXED 8 μm色譜柱；流動(dòng)相：0.1 mol/L NaNO3溶液；流速1 mL/min；柱溫30 ℃。稱(chēng)取果膠樣品2 mg,溶于1 mL去離子水中,經(jīng)0.45 μm水相微孔濾膜過(guò)濾后吸取100 μL樣品溶液依照色譜條件進(jìn)樣。

果膠酸水解物和衍生物的制備方法參考晉睿沖[16]的方法,使用面積歸一法[17]計(jì)算果膠中的單糖比例。

色譜條件：DB-5石英毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm,0.25 μm)；升溫程序：柱初始溫度140 ℃。以4 ℃/min升到240 ℃,進(jìn)樣口溫度250 ℃,載氣流速1 mL/min,分流比為50∶1。質(zhì)譜條件：離子源溫度230 ℃,電離方式為EI,電子能量70 eV,掃描質(zhì)量范圍29～450 amu。

1.3.7 葉片果膠紫外及紅外光譜分析

紫外光譜分析：配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.25%的果膠溶液,取適量溶液于石英比色皿中,使用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行掃描,掃描波長(zhǎng)為200～400 nm,掃描頻率為2 nm/s。

紅外光譜分析：將果膠粉末樣品直接放在ATR晶體上,壓力塔加壓測(cè)試。用傅里葉紅外光譜儀進(jìn)行掃描,波譜的分辨率為4 cm-1,掃描100次,波譜的掃描范圍為4 000～500 cm-1。

1.3.8 葉片果膠凝膠質(zhì)構(gòu)測(cè)定

果膠的凝膠制備方法：分別取狐臭柴葉片、柑橘標(biāo)準(zhǔn)品果膠和食品級(jí)果膠樣品0.3 g到50 mL燒杯,加21 g蔗糖一起溶于去離子水,調(diào)整最后體積為30 mL。使用2 mol/L的檸檬酸調(diào)節(jié)pH至4.8,90 ℃隔水加熱30 min,溶液在室溫靜置24 h至形成凝膠。

果膠的凝膠質(zhì)構(gòu)測(cè)定參考MARIY等[18]的方法。凝膠的質(zhì)構(gòu)測(cè)定條件：壓縮測(cè)試使用柱形探頭,采用TPA模式(下壓5 mm,觸發(fā)力2 g,測(cè)前速度、測(cè)試速度和測(cè)后速度均為0.5 mm/s),獲得硬度、彈性、黏性、咀嚼性、恢復(fù)力等指標(biāo)。

1.3.9 葉片果膠抗氧化性測(cè)定

參考趙磊等[19]的方法,采用體外抗氧化DPPH法測(cè)定果膠和維生素C的抗氧化活性,結(jié)果用EC50表示,即DPPH自由基清除率達(dá)到50%所需要的樣品濃度。

1.3.10 數(shù)據(jù)處理

使用Design-Expert 10軟件分析測(cè)試結(jié)果,以?xún)?yōu)化每個(gè)因素的最佳條件,并根據(jù)預(yù)測(cè)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2016和Origin 2018進(jìn)行分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同因素對(duì)葉片果膠提取率的影響

單因素試驗(yàn)表明,果膠提取率隨pH增大先升高后降低,在pH為1.75時(shí)果膠提取率達(dá)到最大值(圖1-a),這可能是由于酸性環(huán)境加大了果膠在提取液中的溶解性,但酸度過(guò)高會(huì)降解果膠分子從而使提取率降低；果膠提取率隨液料比的增加先升高后降低,但減幅平緩(圖1-b),這是因?yàn)橐毫媳忍r(shí),溶液密度大,提取液與葉片不能充分反應(yīng),在液料比為12∶1時(shí)果膠提取率達(dá)到最大值；提取率隨超聲時(shí)間的延長(zhǎng)而先升高后降低,變化較為平緩,在超聲時(shí)間為10 min時(shí)果膠提取率達(dá)到最大值(圖1-c),這可能是由于超聲時(shí)間過(guò)長(zhǎng),破壞了果膠的大分子結(jié)構(gòu),使提取液中的果膠不能完全在乙醇溶液中析出；提取率隨超聲功率的增大而先升高后降低,變化較為平緩,在超聲功率為400 W時(shí)果膠提取率達(dá)到最大值(圖1-d),這可能是由于隨著超聲波的功率加大,空化作用增強(qiáng),使葉片細(xì)胞內(nèi)容物更加充分析出,但超聲波功率過(guò)大,過(guò)強(qiáng)的破碎效應(yīng)使提取液中雜質(zhì)增多,果膠中的半乳糖醛酸含量降低,故提取率降低；提取溫度在70～85 ℃范圍內(nèi),果膠提取率隨溫度升高而升高,這與分子熱運(yùn)動(dòng)加劇和檸檬酸的解離程度增強(qiáng)有關(guān),提取溫度85 ℃時(shí),果膠提取率達(dá)到最大(圖1-e),當(dāng)提取溫度>85 ℃時(shí),提取率下降,這可能是因?yàn)闇囟忍嵘茐牧斯z結(jié)構(gòu),致使果膠降解所致；提取率隨提取時(shí)間的延長(zhǎng)而先升高后降低,最優(yōu)的提取時(shí)間是90 min(圖1-f)。

a-pH；b-液料比；c-超聲時(shí)間；d-超聲功率；e-提取溫度；f-提取時(shí)間

2.2 影響葉片果膠提取率的關(guān)鍵因素

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,通過(guò)Plackett-Burman試驗(yàn)和方差分析(表3、表4),從pH、液料比、超聲時(shí)間、超聲功率、提取溫度和提取時(shí)間6個(gè)因素中篩選獲得影響果膠提取率的關(guān)鍵因素。

表3 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)及果膠提取率

利用Design-Expert 10軟件對(duì)表3數(shù)據(jù)進(jìn)行處理,模型F值為56.36,模型極顯著(P<0.01),表明該模型具有重要意義,R2=0.915 9,說(shuō)明91.59%的試驗(yàn)數(shù)據(jù)可用該模型解釋。提取率影響因素依次為X1>X6>X4>X2>X5>X3,其中X1、X6對(duì)提取率影響極顯著(P<0.01),X4對(duì)提取率影響顯著(P<0.05),X2對(duì)提取率的影響接近顯著水平(表4)。因此,選取pH、反應(yīng)時(shí)間、超聲功率與液料比4個(gè)因素進(jìn)行Box-Behnken試驗(yàn)。

表4 果膠提取Plackett-Burman試驗(yàn)方差分析

2.3 葉片果膠提取的最優(yōu)條件

2.3.1 Box-Behnken試驗(yàn)優(yōu)化果膠提取工藝

表5 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及果膠提取率響應(yīng)值

表6 果膠提取Box-Behnken試驗(yàn)方差分析

2.3.2 各因素交互作用對(duì)果膠得率影響的響應(yīng)面分析

采用Design-Expert 10軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行響應(yīng)面圖繪制,通過(guò)響應(yīng)面圖可直觀地分析各因素及因素相互之間的交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響。各因素之間響應(yīng)面3D圖和等高線圖能直觀反映出其相互作用的強(qiáng)弱,響應(yīng)面曲面坡度越陡峭,等高線圖越偏橢圓形,因素之間交互作用越存在顯著性差異,反之則表示兩因素的交互作用無(wú)顯著性差異。

圖2顯示了pH、反應(yīng)時(shí)間、超聲功率和液料比中任意2個(gè)變量取0水平時(shí)其余2個(gè)變量對(duì)果膠得率的影響。3D響應(yīng)面圖均成拋物狀,曲面有最高點(diǎn),容易出現(xiàn)最大值。由圖2可知,AB的響應(yīng)面曲線最陡,且等高線密集,因此AB的交互作用對(duì)狐臭柴果膠得率的影響最為顯著；依次類(lèi)推,其次是CD與AC響應(yīng)曲面,CD與AC的交互作用對(duì)狐臭柴果膠得率也有一定的影響；BD、BC和AD的響應(yīng)曲面較為平緩,等高線疏松,BD、BC和AD的交互作用對(duì)狐臭柴果膠得率的影響較小。交互作用對(duì)果膠得率的影響大小順序?yàn)椋篈B>CD>AC>BD>BC>AD。

a-pH與反應(yīng)時(shí)間；b-pH與超聲功率；c-pH與液料比；d-反應(yīng)時(shí)間與超聲功率；e-反應(yīng)時(shí)間與液料比；f-超聲功率與液料比

2.3.3 最佳條件的預(yù)測(cè)及驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

通過(guò)回歸模型的預(yù)測(cè)得到超聲波輔助-酸法提取果膠的最佳工藝為：pH 1.90、反應(yīng)時(shí)間95.87 min、超聲功率436.92 W、液料比12.54∶1。此時(shí)果膠的理論得率最大為11.71%。由于實(shí)驗(yàn)的客觀條件和便于操作性,把最優(yōu)條件修正為：pH 1.9、反應(yīng)時(shí)間95.0 min、超聲功率450.0 W、液料比12.5∶1。在此條件下進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證,狐臭柴果膠平均得率為(11.53±0.16)%,與理論預(yù)測(cè)值(11.71%)誤差值僅為1.54%,證實(shí)了該模型的有效性。

2.4 葉片果膠純度與酯化度判斷

果膠的主要組成成分為半乳糖醛酸,所以半乳糖醛酸含量可以反映果膠的純度,經(jīng)測(cè)定,狐臭柴葉片果膠的半乳糖醛酸含量為(70.64±0.06)%,符合GB 25533—2010《食品添加劑果膠》[20]要求(半乳糖醛酸含量>65%)。酯化度為(77.77±0.21)%,為高酯果膠(酯化度>50%)。

2.5 葉片果膠分子質(zhì)量大小、單糖組成與結(jié)構(gòu)域分析

超聲波-酸法提取的葉片果膠的重均分子質(zhì)量(Mw)為87.90 kDa,數(shù)均分子質(zhì)量(Mn)為56.06 kDa,分子質(zhì)量分布(Mw/Mn)為1.57。此方法所提取果膠分子質(zhì)量偏小但分布較為均一,可能是由于在超聲波作用下分子片段被隨機(jī)打斷,導(dǎo)致分子質(zhì)量減小。

從單糖混合標(biāo)準(zhǔn)衍生物以及果膠中性單糖衍生物的選擇離子總離子流圖(圖3)可以看出,各類(lèi)型果膠中中性單糖衍生物整體均能達(dá)到基線分離,且峰型尖銳對(duì)稱(chēng),滿(mǎn)足定性定量。

a-9種單糖混標(biāo)；b-果膠水解物

果膠主要包括4個(gè)結(jié)構(gòu)域：同聚半乳糖醛酸(homopolygalacturonic acid，HG)，鼠李糖半乳糖醛酸聚糖I型(rhamnose galacturonosan type I，RG-I)、鼠李糖半乳糖醛酸聚糖Ⅱ型(rhamnose galacturonosan type Ⅱ，RG-II)和木糖半乳糖醛酸聚糖(xylose galacturonic glycan，XG)[21]。HG是果膠的主要結(jié)構(gòu),由線性半乳糖醛酸鏈組成,也稱(chēng)為果膠主鏈[22]；RG-I與RG-II稱(chēng)為果膠側(cè)鏈[23]。果膠的單糖組成對(duì)其性質(zhì)和生物活性具有重要影響,側(cè)鏈的存在往往限制了鏈間的相互作用,進(jìn)而影響凝膠形成過(guò)程中鏈間的結(jié)合[24-25]。

通過(guò)分析果膠的離子流圖,狐臭柴果膠中含有鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖、木糖、葡萄糖和果糖,各單糖的摩爾百分含量分別為：12.08%、15.99%、14.82%、12.93%、6.28%、31.29%、6.29%。由單糖組分可以得出,狐臭柴果膠中含有HG、RG-I和RG-II這3種結(jié)構(gòu),可能還有XG結(jié)構(gòu)。本研究中,超聲波輔助酸提法提取的果膠鼠李糖含量較低,可以反映出RG-I與RG-II兩種側(cè)鏈含量較低,這可能是狐臭柴果膠凝膠性能較好的重要原因。

2.6 葉片果膠光譜特征

2.6.1 葉片與標(biāo)品果膠紫外特征比較

紫外光譜可以快速準(zhǔn)確地測(cè)定果膠特征,狐臭柴果膠與柑橘標(biāo)品果膠曲線趨勢(shì)相似,但狐臭柴果膠在260和280 nm周?chē)形辗?說(shuō)明狐臭柴粗品果膠中可能含有少量核酸和蛋白質(zhì)(圖4-a)。

2.6.2 葉片果膠官能團(tuán)分析

紅外光譜可以檢測(cè)化合物官能團(tuán)組成,可以準(zhǔn)確判斷化合物的分類(lèi)。狐臭柴果膠的紅外光譜圖通過(guò)與化學(xué)專(zhuān)業(yè)數(shù)據(jù)庫(kù)中果膠紅外光譜圖的特征峰比對(duì)發(fā)現(xiàn)[26],其譜峰位置、譜峰透過(guò)率、半峰寬和峰差相似,由此可以認(rèn)為紅外光譜圖符合常規(guī)果膠光譜特征(圖4-b)。

a-紫外光譜圖；b-紅外光譜圖

在4 000～1 330 cm-1特征頻率區(qū)：3 285 cm-1周?chē)尸F(xiàn)下降的糖類(lèi)O—H強(qiáng)烈伸縮振動(dòng)曲線,在O—H伸縮振動(dòng)頻率區(qū)會(huì)出現(xiàn)多個(gè)吸收峰,這些吸收峰往往重疊在一起,形成寬的吸收帶；在2 929 cm-1處表現(xiàn)出糖類(lèi)C—H中等強(qiáng)度的伸縮振動(dòng)；在1 486～1 318 cm-1出現(xiàn)了幾個(gè)吸收峰,表現(xiàn)出糖類(lèi)C—H的變角振動(dòng),CH3和CH2變角振動(dòng)頻率位于高頻一側(cè),CH變角振動(dòng)頻率位于低頻一側(cè)。在1 330～400 cm-1的指紋區(qū)：1 179～1 009 cm-1之間的譜帶表現(xiàn)出糖類(lèi)C—OH和C—O—C的吸收峰,但因?yàn)檫@2個(gè)基團(tuán)在同一區(qū)間,所以無(wú)法進(jìn)行明確的歸屬；1 009～842 cm-1之間出現(xiàn)了幾個(gè)吸收峰表現(xiàn)出糖類(lèi)C—O—C的對(duì)稱(chēng)伸縮振動(dòng)。這些吸收峰均屬多糖化合物所特有的特征性吸收峰[27],可以判定所提取的為果膠。

2.7 葉片與其他果膠質(zhì)構(gòu)比較

狐臭柴鮮葉果膠與食品級(jí)果膠、柑橘果膠標(biāo)準(zhǔn)品和狐臭柴干葉果膠的凝膠質(zhì)構(gòu)比較發(fā)現(xiàn),狐臭柴果膠所制凝膠的硬度、黏性與咀嚼性高于同樣條件下其他幾種果膠所制凝膠,有非常好的凝膠、增稠作用,狐臭柴果膠的恢復(fù)力低于其他果膠,彈性大小相似(表7)。

表7 果膠的凝膠質(zhì)構(gòu)

2.8 葉片果膠與維生素C抗氧化活性能力比較

DPPH是一種比較穩(wěn)定的自由基,在波長(zhǎng)517 nm處有特征吸收峰,常用于評(píng)價(jià)抗氧化成分的自由基清除能力。DPPH自由基清除劑能提供氫并形成穩(wěn)定的非自由基分子[28]。研究表明,果膠等多糖類(lèi)物質(zhì)具有自由基清除能力,可能是因?yàn)槠鋵儆跉涔w物質(zhì),與自由基反應(yīng)可以生成更穩(wěn)定的產(chǎn)物并終止自由基鏈反應(yīng)[29]。體外抗氧化DPPH法測(cè)定果膠和維生素C的抗氧化活性結(jié)果表明,狐臭柴中提取的果膠有一定的DPPH自由基清除能力,果膠的線性方程為y=0.001 3x+0.149 9(R2=0.992 2),代入方程得出果膠的EC50值為(269.31±0.26)μg/mL；維生素C的線性方程為y=0.00 19x+0.201 7(R2=0.998 5),代入方程得出維生素C的EC50值為(157±0.14)μg/mL。EC50值越低,該物質(zhì)清除自由基的能力越強(qiáng),狐臭柴果膠的EC50是維生素C的兩倍左右,具有計(jì)量依賴(lài)的關(guān)系[30]。蘋(píng)果、柑橘果膠同樣具有抗氧化能力[31-32],但經(jīng)過(guò)比較發(fā)現(xiàn),狐臭柴果膠抗氧化能力強(qiáng)于這2種果膠。

3 結(jié)論

目前對(duì)狐臭柴果膠提取的相關(guān)研究非常少,只有本實(shí)驗(yàn)室前期對(duì)狐臭柴干葉和鮮葉酸提法的工藝進(jìn)行研究,但沒(méi)有對(duì)狐臭柴果膠的分子結(jié)構(gòu)與理化性質(zhì)等做評(píng)價(jià)[33-34]。在本研究中,狐臭柴葉片未經(jīng)脫水干燥,直接進(jìn)行果膠提取,所得果膠不僅凝膠、增稠功能強(qiáng)于干葉提取果膠,而且工藝上省去了鮮葉烘干為干葉再磨粉的步驟,操作工藝簡(jiǎn)化、果膠品質(zhì)提升,為狐臭柴的資源利用提供了新途徑。

在本試驗(yàn)中,首先采用單因素試驗(yàn),分析考查不同因素對(duì)果膠提取率的影響,確定合適的條件范圍,再利用Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)合Box-Behnken響應(yīng)面法對(duì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明,關(guān)鍵因素為pH、液料比、超聲功率、反應(yīng)時(shí)間,利用Design-Expert軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析,得出最佳工藝條件：pH 1.90、反應(yīng)時(shí)間95.87 min、超聲功率436.92 W、液料比12.54∶1,此時(shí)果膠的理論得率最大為11.71%?；趯?shí)驗(yàn)的客觀條件和便于操作性,把最優(yōu)條件修正為：pH 1.9、反應(yīng)時(shí)間95.0 min、超聲功率450.0 W、液料比12.5∶1,此時(shí)果膠提取率11.53%。狐臭柴果膠是一種較為均一的低分子質(zhì)量果膠,通過(guò)對(duì)單糖成分分析,狐臭柴果膠中單糖的摩爾百分含量為：12.08%鼠李糖、15.99%阿拉伯糖、14.82%半乳糖、12.93%甘露糖、6.28%木糖、31.29%葡萄糖、6.29%果糖,狐臭柴果膠側(cè)鏈含量低,凝膠性較好。通過(guò)紫外與紅外光譜分析,狐臭柴果膠符合果膠特征,可以推斷出所測(cè)樣品為純度比較高的果膠粗產(chǎn)品。測(cè)定提取的果膠的理化性質(zhì)：半乳糖醛酸含量為70.64%,符合其含量≥65%的要求；酯化度為77.77%,為高酯果膠；凝膠質(zhì)構(gòu)結(jié)果表明,狐臭柴果膠有很好的凝膠、增稠功能；狐臭柴果膠DPPH清除率EC50為(269.31±0.26)μg/mL,有良好的抗氧化活性。果膠作為膠凝劑、增稠劑和穩(wěn)定劑,廣泛應(yīng)用于食品醫(yī)藥中[35]。狐臭柴果膠相對(duì)食品果膠其膠凝、增稠作用更加優(yōu)越,非常適合工業(yè)開(kāi)發(fā)利用,具有作為功能成分在食品和醫(yī)藥領(lǐng)域進(jìn)一步發(fā)展的潛力。