植物蛋白-益生菌復(fù)合制劑對小鼠鉛毒性的緩解作用

馬申嫣,王晶,朱家民,曹江,翟齊嘯,張灝,趙建新,田豐偉,陳衛(wèi)

(江南大學(xué) 食品學(xué)院,江蘇 無錫,214122)

鉛是一種有蓄積性毒性的非必需金屬,在土壤、空氣和水中均能穩(wěn)定存在。鉛通過消化道進(jìn)入機(jī)體后,一部分可通過尿液和糞便排泄排出體外,剩余部分則被腸道吸收后隨血液循環(huán)作用于各個(gè)靶器官。鉛在體內(nèi)能與酶官能團(tuán)及高親和力金屬結(jié)合蛋白(如鉛結(jié)合蛋白和金屬硫蛋白)相互作用,進(jìn)而介導(dǎo)鉛與酶的相互作用[1]。同時(shí),鉛還能和人體多種必需微量元素競爭腸道吸收位點(diǎn)、酶作用靶點(diǎn)等誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生大量活性氧,破壞蛋白質(zhì)、核酸和脂質(zhì),導(dǎo)致細(xì)胞死亡[2],從而引起相關(guān)疾病發(fā)生。

目前公認(rèn)的鉛中毒螯合劑主要有依地酸二鈉鈣和二巰基琥珀酸,但伴有中性粒細(xì)胞減少、腸胃不適、必需礦物質(zhì)排泄以及腎功能障礙等副作用[3-4],故不適合長期高劑量服用。植物乳桿菌CCFM8661是江南大學(xué)食品生物技術(shù)中心研發(fā)團(tuán)隊(duì)從泡菜中篩選到的一株益生菌,并通過生理特性、動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)以及細(xì)胞實(shí)驗(yàn)三方面對其進(jìn)行了緩解鉛毒性功能評價(jià)及其機(jī)制解析,發(fā)現(xiàn)CCFM8661對鉛的吸附具有高效性和穩(wěn)定性,同時(shí),其對鉛的耐受能力較強(qiáng),可通過保護(hù)腸道屏障和緩解脂質(zhì)過氧化反應(yīng)減少鉛對機(jī)體的損傷[5-6]。

植物蛋白主要包括從豆類和水稻中提取的大豆蛋白及大米蛋白,由于其氨基酸組成、營養(yǎng)素組成以及其他活性物質(zhì),不僅營養(yǎng)充足,同時(shí)還具有多種功效,可以調(diào)節(jié)糖尿病、心臟病、慢性腎病以及重金屬損傷等多種急性和慢性疾病[7-9]。同時(shí),重金屬可以與大米蛋白上的巰基結(jié)合,從而降低重金屬的生物利用率[10]。研究表明,植物乳桿菌發(fā)酵植物類食品,可以提高植物乳桿菌的活力和食物的抗氧化能力[11],植物蛋白和植物乳桿菌共培養(yǎng)可能會提高菌體活性,進(jìn)而提升其功能特性。通過不同植物蛋白與CCFM8661進(jìn)行復(fù)配,探究不同復(fù)配方式對其鉛毒性緩解能力的影響。同時(shí),市面上缺乏具有排鉛功能的復(fù)合膳食補(bǔ)充劑產(chǎn)品,本研究在發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌CCFM8661具有緩解鉛毒性的基礎(chǔ)上,開發(fā)提高其鉛毒性緩解功效的新膳食配方,以期為市場應(yīng)用提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

將78只3周齡的雄性C57BL/6 J小鼠隨機(jī)分為8組,如表1所示?？瞻捉M實(shí)驗(yàn)動(dòng)物正常飲食飲水,每天灌胃0.2 mL脫脂乳溶液；染鉛組、CCFM8661組、CCFM8661+大豆蛋白、CCFM8661+大米蛋白、大豆蛋白組、大米蛋白組和DMSA高劑量組飲用醋酸鉛溶液(鉛離子質(zhì)量濃度為1 g/L),持續(xù)8周,第9周換成普通飲水[12]。前8周飲用鉛水同時(shí),染鉛組、二巰丁二酸(dimercaptosuccinic acid,DMSA)組每天灌胃0.2 mL脫脂乳,CCFM8661組每天灌胃0.2 mL活菌數(shù)為1×109CFU的菌懸液；CCFM8661+大豆蛋白組每天灌胃0.2 mL活菌數(shù)為1×109CFU的菌懸液,大豆蛋白灌胃劑量為8 g/kg；大豆蛋白組每天灌胃0.2 mL,其大豆蛋白灌胃劑量為8 g/kg；CCFM8661+大米蛋白組每天灌胃0.2 mL活菌數(shù)為1×109CFU的菌懸液,大米蛋白灌胃劑量為8 g/kg；大米蛋白組每天灌胃0.2 mL,其大米蛋白灌胃劑量為8 g/kg。第9周普通飲水同時(shí),DMSA組每天灌胃0.2 mL,質(zhì)量濃度為10 mg/mL的DMSA溶液,其他組均灌胃等體積的PBS溶液。本實(shí)驗(yàn)中,CCFM8661、大豆蛋白、大米蛋白的給藥劑量在前人研究的基礎(chǔ)上,結(jié)合相關(guān)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行了調(diào)整[13-15]。在實(shí)驗(yàn)的前期、中期、后期分別單獨(dú)收集每只小鼠的糞便,實(shí)驗(yàn)結(jié)束前進(jìn)行行為學(xué)實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,犧牲小鼠并采集血液和組織樣品,置于-80 ℃儲存。

表1 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案

1.2 小鼠行為學(xué)指標(biāo)的測定

1.2.1 小鼠避暗實(shí)驗(yàn)

參照FERLEMI等[16]與LU等[17]的方法,測定小鼠的避暗潛伏期(小鼠第1次完全進(jìn)入暗室的時(shí)間)與進(jìn)入暗室的次數(shù)(錯(cuò)誤次數(shù))。

1.2.2 小鼠水迷宮實(shí)驗(yàn)

參照RIBES等[18]的報(bào)道進(jìn)行測定,記錄小鼠1 min內(nèi)的游泳軌跡,以用于考察小鼠對原平臺的記憶。

1.3 小鼠糞便、血液及組織中鉛含量的測定

按照ZHAI等[19]的方法稱取適量糞便、血液、組織樣品置于微波消解罐,加入適量濃硝酸,使用微波消解系統(tǒng)進(jìn)行消化后,再使用石墨爐或火焰原子吸收分光光度計(jì)測定樣品中鉛含量。

1.4 小鼠組織氧化應(yīng)激指標(biāo)測定

按試劑盒說明書要求,對小鼠肝臟、腎臟中SOD活性和MDA含量進(jìn)行檢測。

1.5 小鼠組織細(xì)胞因子及免疫球蛋白含量測定

取小鼠空腸及結(jié)腸,研磨離心后取上清液,按照試劑盒說明書測定TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8和sIgA的含量。

1.6 小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)組成分析

參考MAO等[20]的研究,在實(shí)驗(yàn)結(jié)束前,每只小鼠分別收集500 mg糞便,并對其糞便菌群提取測定。參照毛丙永[21]的方法,對下機(jī)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。在Qiime平臺計(jì)算樣品的α多樣性和β多樣性。

2 結(jié)果與討論

2.1 CCFM8661+植物蛋白膳食補(bǔ)充劑對小鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力的影響

如圖1所示,染鉛組進(jìn)入暗室的時(shí)間與空白組有顯著差異,說明鉛暴露可損傷機(jī)體的神經(jīng)系統(tǒng)。大豆蛋白及CCFM8661+大豆蛋白有提高避暗潛伏期的趨勢,但并不具備顯著性,說明這2種膳食干預(yù)方法不能顯著緩解鉛暴露對小鼠學(xué)習(xí)及記憶能力的干擾。而膳食干預(yù)組中CCFM8661(99.04 s)及CCFM8661+大米蛋白(176.16 s)可提高避暗潛伏期,有效緩解鉛暴露對小鼠智力的損害,其中CCFM8661+大米蛋白效果最優(yōu),甚至顯著高于DMSA藥物治療組。說明相比于單菌或單一膳食成分,大米蛋白與植物乳桿菌CCFM8661復(fù)配具有更強(qiáng)的緩解鉛的神經(jīng)毒性作用的效果。

1-空白組；2-染鉛組；3-DMSA組；4-CCFM8661；5-CCFM8661+大豆蛋白；6-CCFM8661+大米蛋白；7-大豆蛋白組；8-大米蛋白組

水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明DMSA藥物治療組、CCFM8661組、大豆蛋白組、大米蛋白組、CCFM8661+大豆蛋白及CCFM8661+大米蛋白都可以有效縮短逃逸潛伏期,提高穿越平臺的次數(shù)以及在目的象限的停留時(shí)間(圖2)。其中,CCFM8661+大豆蛋白及CCFM8661+大米蛋白緩解神經(jīng)毒性效果最佳。

1-空白組；2-染鉛組；3-DMSA組；4-CCFM8661；5-CCFM8661+大豆蛋白；6-CCFM8661+大米蛋白；7-大豆蛋白組；8-大米蛋白組a-第6天的逃逸潛伏期；b-第6天穿越平臺次數(shù)；c-第6天目的象限與其他象限的時(shí)間比

2.2 CCFM8661+植物蛋白膳食補(bǔ)充劑對小鼠機(jī)體鉛含量的影響

如圖3所示,相比于鉛造模組,大豆蛋白、大米蛋白、植物乳桿菌 CCFM8661以及CCFM8661+大米蛋白組均可以顯著增加糞便中鉛含量,表明其可促進(jìn)機(jī)體鉛排泄。同時(shí),除大米蛋白組的血鉛含量、大豆蛋白組和大米蛋白組的肝臟鉛含量有下降趨勢但不明顯外,其余膳食干預(yù)組小鼠血液及組織中的鉛含量均顯著下降,其中CCFM8661+大豆蛋白和CCFM8661+大米蛋白緩解鉛毒性的效果最顯著。CCFM8661+大豆蛋白在降低血鉛、肝鉛、腦鉛含量方面與DMSA藥物治療組效果相當(dāng),CCFM8661+大米蛋白在緩解血液鉛含量方面與DMSA給藥組達(dá)到相同水平,同時(shí)2種復(fù)合膳食補(bǔ)充劑緩解腎臟鉛毒性的能力顯著高于DMSA給藥組。表明大豆蛋白和大米蛋白與CCFM8661進(jìn)行復(fù)配可以顯著降低鉛在體內(nèi)的蓄積。

1-空白組；2-染鉛組；3-DMSA組；4-CCFM8661；5-CCFM8661+大豆蛋白；6-CCFM8661+大米蛋白；7-大豆蛋白組；8-大米蛋白組a-血液中的鉛含量；b-肝臟中的鉛含量；c-腦中的鉛含量；d-腎臟中的鉛含量；e-糞便中的鉛含量

研究表明,植物乳桿菌發(fā)酵豆乳可有效增強(qiáng)益生菌的活力,提高發(fā)酵豆乳中的礦物質(zhì)和異黃酮的生物利用度,改善機(jī)體異常氧化應(yīng)激及腸道菌群組成[22]。益生菌發(fā)酵后的大豆蛋白在微生物酶的作用下,被降解成許多具有新功能的多肽和生物活性物質(zhì),從而降低大豆蛋白的免疫反應(yīng)性[23],提高營養(yǎng)利用率[24]。本研究中的植物乳桿菌CCFM8661和植物性膳食成分大豆蛋白、大米蛋白復(fù)配可能也能通過相似機(jī)制產(chǎn)生相互作用,從而提高CCFM8661緩解鉛毒性的效果。

2.3 CCFM8661+植物蛋白膳食補(bǔ)充劑對小鼠組織氧化應(yīng)激水平的影響

由圖4可知,鉛中毒導(dǎo)致小鼠肝臟及腎臟中MDA含量升高、SOD活性下降。藥物治療及膳食成分干預(yù)均能顯著降低肝臟及腎臟中的MDA含量,其中CCFM8661+大米蛋白效果最明顯；此外,補(bǔ)充DMSA及所有膳食成分均能夠使小鼠肝臟中SOD活性顯著提高,其中大米蛋白復(fù)配CCFM8661效果最顯著,而腎臟中SOD活性在DMSA藥物治療組、CCFM8661+大豆蛋白組及CCFM8661+大米蛋白組均表現(xiàn)出顯著提升,其中大豆蛋白與大米蛋白和CCFM8661的復(fù)配效果最顯著。

1-空白組；2-染鉛組；3-DMSA組；4-CCFM8661；5-CCFM8661+大豆蛋白；6-CCFM8661+大米蛋白；7-大豆蛋白組；8-大米蛋白組a-肝臟MDA含量；b-肝臟SOD活性；c-腎臟MDA含量；d-腎臟SOD活性

綜合以上研究結(jié)果,CCFM8661+大米蛋白對恢復(fù)鉛中毒引起的異常的氧化應(yīng)激反應(yīng)效果最明顯。這可能因?yàn)榇竺椎鞍准捌溲苌乃猱a(chǎn)物和特定的多肽組分具有強(qiáng)大的抗氧化等生物活性功能[25-26],而且植物乳桿菌CCFM8661在鉛誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激中發(fā)揮了顯著的保護(hù)作用[13],故與單一組分相比,大米蛋白與植物乳桿菌CCFM8661復(fù)配能夠更顯著的緩解鉛中毒引起的脂質(zhì)過氧化并提高SOD活性。

2.4 CCFM8661+植物蛋白膳食補(bǔ)充劑對小鼠腸道免疫功能的影響

鉛暴露可以通過加劇炎癥反應(yīng)破壞免疫屏障,進(jìn)而損傷機(jī)體腸道物理屏障,加速重金屬鉛進(jìn)入機(jī)體。CCFM8661+植物蛋白對小鼠腸道免疫指標(biāo)的影響見圖5和圖6。結(jié)果表明鉛暴露會增加小鼠腸道IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α含量,同時(shí)降低sIgA含量；除空腸中大豆蛋白組和大米蛋白組的TNF-α含量,以及結(jié)腸中的大米蛋白組和CCFM8661+大米蛋白組的IL-1β含量無顯著變化外,所有膳食干預(yù)組均顯著降低了炎癥因子含量并增加了sIgA含量。

1-空白組；2-染鉛組；3-DMSA組；4-CCFM8661；5-CCFM8661+大豆蛋白；6-CCFM8661+大米蛋白；7-大豆蛋白組；8-大米蛋白組a-IL-1β含量；、b-IL-6含量；c-IL-8含量；d-TNF-α含量；e-sIgA的含量

1-空白組；2-染鉛組；3-DMSA組；4-CCFM8661；5-CCFM8661+大豆蛋白；6-CCFM8661+大米蛋白；7-大豆蛋白組；8-大米蛋白組a-IL-1β含量；、b-IL-6含量；c-IL-8含量；d-TNF-α含量；e-sIgA的含量

在結(jié)腸中,大豆蛋白復(fù)配CCFM8661相比于單一CCFM8661及大豆蛋白對IL-1β、IL-6和TNF-α的恢復(fù)效果更顯著,并與DMSA藥物治療恢復(fù)至相同水平；同時(shí),相比于單獨(dú)灌胃CCFM8661和大米蛋白,灌胃CCFM8661+大米蛋白可以顯著降低IL-6的含量,并在恢復(fù)IL-6、IL-8、sIgA和TNF-α含量方面的效果與DMSA一致或更強(qiáng)。而在空腸中,與灌胃單一組分的膳食成分相比,CCFM8661+大豆蛋白和大米蛋白膳食補(bǔ)充劑顯著降低了促炎因子IL-6、IL-8和TNF-α的含量,與DMSA給藥組相同,恢復(fù)至空白組水平。以上結(jié)果說明CCFM8661+大豆蛋白和CCFM8661+大米蛋白可顯著緩解鉛暴露引起的炎癥反應(yīng),保護(hù)腸道免疫屏障。

研究表明,富含異黃酮的大豆蛋白可以使血漿和肝臟中的TNF-α、IL-1β降低,緩解脂肪肝小鼠的肝臟炎癥[27]。大米蛋白水解物可通過抑制TNF-α的釋放顯示出顯著的抗炎和免疫特性,且補(bǔ)充大米蛋白水解物與TNF-α、IL-6和IL-1β的降低呈劑量依賴關(guān)系[28]。此外,益生菌已經(jīng)被證實(shí)能夠調(diào)節(jié)腸道炎癥,本研究表明相比于單一組分,益生菌分別與大豆蛋白和大米蛋白復(fù)配的膳食補(bǔ)充劑能夠更加有效緩解鉛中毒引起的腸道炎癥反應(yīng)。

2.5 CCFM8661+植物蛋白膳食補(bǔ)充劑對小鼠腸道菌群的影響

由圖7可知,經(jīng)分析有變化的特定門水平發(fā)現(xiàn),染鉛組可顯著降低了小鼠Actinobacteria和Bacteroidetes的相對豐度,提高了Proteobacteria的豐度,這與ZHAI等[29]的研究結(jié)果一致。DMSA給藥組可以恢復(fù)鉛暴露引起的菌群紊亂至正常水平,抑制鉛中毒現(xiàn)象。補(bǔ)充CCFM8661+大豆蛋白和CCFM8661+大米蛋白可以使Bacteroidetes和Proteobacteria的含量恢復(fù)至空白組水平,與DMSA給藥組呈現(xiàn)相同的趨勢,說明2種復(fù)合膳食補(bǔ)充劑可能通過改善菌群結(jié)構(gòu)保護(hù)腸道健康。

1-空白組；2-染鉛組；3-DMSA組；4-CCFM8661；5-CCFM8661+大豆蛋白；6-CCFM8661+大米蛋白；7-大豆蛋白組；8-大米蛋白組a-Actinobacteria的相對豐度；b-Bacteroidetes的相對豐度；c-Proteobacteria的相對豐度

針對小鼠的腸道菌群在屬水平上的組成進(jìn)行進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)(圖8),鉛暴露能顯著降低了Allobaculum和Bacteroides的相對豐度。MENG等[30]研究報(bào)道銅暴露小鼠中Allobaculum、Bacteroides的相對豐度減少,表明腸道免疫反應(yīng)異常,這與本研究研究結(jié)果一致。作為腸道菌膜屏障的組成部分,鉛暴露后,參與哺乳動(dòng)物結(jié)腸中黏膜相關(guān)代謝的Bacteroides和Allobaculum等在腸道中的含量下降,為腸球菌、腸桿菌等致病菌的侵襲和定殖提供了機(jī)會,致病菌產(chǎn)生過量內(nèi)毒素,導(dǎo)致腸道生態(tài)失調(diào),形成惡性循環(huán)[31]。與鉛造模組相比,補(bǔ)充CCFM8661+大豆蛋白和CCFM8661+大米蛋白可有效恢復(fù)上述種屬變化,使其接近空白組水平,同時(shí)還可顯著上調(diào)Akkermansia和Pseudomonas的相對豐度。其中Akkermansia具有潛在的免疫調(diào)節(jié)和抗炎作用[32],也可增強(qiáng)腸黏膜傷口的修復(fù),并誘導(dǎo)緊密連接蛋白的表達(dá)[33-34],降低腸道通透性,從而保護(hù)腸道屏障。雖然2種復(fù)合膳食補(bǔ)充劑的排鉛功能與種屬的特定變化有一定關(guān)聯(lián),但具體的關(guān)聯(lián)機(jī)制還需進(jìn)一步研究分析。

1-空白組；2-染鉛組；3-DMSA組；4-CCFM8661；5-CCFM8661+大豆蛋白；6-CCFM8661+大米蛋白；7-大豆蛋白組；8-大米蛋白組a-Akkermansia的相對豐度；b-Pseudomonas的相對豐度；c-Allobaculum的相對豐度；d-Bacteroides的相對豐度

3 結(jié)論

綜上所述,CCFM8661與植物蛋白復(fù)配能夠顯著增強(qiáng)其鉛毒性緩解能力。其中CCFM8661+大豆蛋白促進(jìn)糞便鉛排泄,降低組織鉛含量及緩解腸道炎癥的效果更顯著,這可能由于植物乳桿菌發(fā)酵大豆蛋白能顯著提高益生菌的活力,促進(jìn)腸道蠕動(dòng),提高糞便鉛排泄,而大豆蛋白被降解成多肽和生物活性物質(zhì),兩者共同改善機(jī)體異常氧化應(yīng)激及腸道菌群組成,保護(hù)腸道免疫屏障并阻礙鉛被胃腸道吸收利用。此外,補(bǔ)充CCFM8661+大米蛋白能顯著緩解鉛對神經(jīng)系統(tǒng)的毒害及肝腎臟的氧化損傷,其主要作用機(jī)制可能是通過CCFM8661發(fā)酵大米蛋白產(chǎn)生的水解產(chǎn)物和多肽組分具有強(qiáng)大的抗氧化等生物活性功能,而且發(fā)酵后活性增強(qiáng)的CCFM8661能通過腦腸軸更好地緩解鉛的神經(jīng)毒性。以上表明,CCFM8661能夠與植物蛋白進(jìn)行復(fù)配,并作為一款具有排鉛功能的復(fù)合膳食補(bǔ)充劑產(chǎn)品進(jìn)入市場,彌補(bǔ)目前市場上關(guān)于這類產(chǎn)品的空白。同時(shí),復(fù)配產(chǎn)生的功能增強(qiáng)效果也為同類功能性菌株的進(jìn)一步開發(fā)與應(yīng)用提供了指導(dǎo)。