蛋黃果多酚的提取工藝及其抗氧化活性

馬金爽，韋少睜，王瀟哲，陳園園，劉紅*

（1.海南師范大學化學與化工學院，海南?？?71158；2.?？谑袩釒厣幨惩粗参镅芯颗c開發(fā)重點實驗室，海南海口571158）

蛋黃果為山欖科植物，原產(chǎn)于美洲，廣泛分布于南美洲和亞熱帶，中國海南、廣東、廣西均有種植[1-2]。蛋黃果果實近圓形，有一至四粒堅硬的種子[3]。果肉呈黃色，可以鮮食，也可用于制作冰淇淋、蛋羹、奶昔和果醬[4]。蛋黃果含有豐富的維生素C、蛋白質(zhì)、淀粉、酚類物質(zhì)，具有重要的生物活性[5-6]。植物多酚能夠有效地清除自由基，可以減少冠心病、癌癥的發(fā)生，是一種天然的抗氧化劑[7]。蛋黃果是一種優(yōu)質(zhì)的熱帶水果，關(guān)于蛋黃果的研究多集中于栽培及營養(yǎng)成分、抗氧化等方面[8-9]，關(guān)于果肉和種子多酚提取工藝與抗氧化比較的研究還尚未見報道。

植物多酚的提取率與溫度、時間和溶劑等多因素有關(guān)。本文首先利用超聲波法輔助提取蛋黃果的果肉和種子多酚，然后采用單因素試驗方法，考察提取時間、提取溫度、料液比和提取劑濃度對果肉和種子多酚提取率的影響，最后再采用響應(yīng)曲面法對果肉和種子多酚的提取工藝進行優(yōu)化，以獲得最佳提取條件[10-11]。本研究通過響應(yīng)面法優(yōu)化超聲波輔助提取蛋黃果的果肉和種子多酚的工藝條件，評價果肉和種子多酚的抗氧化活性，為蛋黃果的營養(yǎng)保健加工提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蛋黃果：市售；福林酚試劑、DPPH：美國Sigma公司；抗壞血酸、石油醚、水楊酸、鄰苯三酚（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司。

DHG-9070A恒溫鼓風干燥箱：上海申賢恒溫設(shè)備廠；LGJ-10冷凍干燥箱：北京四環(huán)科學儀器廠有限公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器；XO-5200DTS超聲波清洗儀：南京先歐儀器制造有限公司；722可見分光光度計：上海菁華科技儀器有限公司；H50循環(huán)水冷卻恒溫器：北京萊伯泰科技儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品制備

優(yōu)選成熟的蛋黃果，用手剝離果肉和種子。將果肉打漿、冷凍干燥后粉碎，過60目篩；將種子置于50℃的烘干箱中烘干，粉碎，過60目篩。使用石油醚脫去上述兩種粉中脂肪，再置于40℃烘箱中干燥，儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 多酚標準曲線的建立

配制濃度為0.1 mg/mL的沒食子酸標準溶液，準確量取 0.00、0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1 mL 于 7 個25 mL容量瓶，分別加2mL蒸餾水搖勻，分別加2mol/L福林酚試劑1.0mL，靜置8 min，加入10%的無水碳酸鈉溶液3 mL，定容，避光水?。?5℃）2 h，在765 nm處測定吸光度，繪制沒食子酸標準曲線[12]。回歸方程為Y=84.6785X-0.00161，R2=0.998 7。

1.2.3 多酚的提取與測定

以一定濃度的乙醇為提取劑，分別稱量1.0 g果肉和種子粉末于錐形瓶中，在超聲功率200 W、提取時間100 min、提取溫度 50 ℃、料液比 1∶20（g/mL）的條件下對多酚進行提取，過濾，定容于50 mL容量瓶，取樣品液1 mL按照上述操作測定吸光度，計算多酚提取率。計算公式如下。

式中：X為多酚提取率，%；m為樣品質(zhì)量，g；c為提取液多酚的質(zhì)量濃度，mg/mL；V為提取液體積，mL；n為稀釋倍數(shù)。

1.2.4 單因素試驗

以蛋黃果果肉和種子多酚提取率為指標，考察并分析提取劑（乙醇）濃度（30%、40%、50%、60%、70%）、提取時間 （40、60、80、100、120、140 min）、 提取溫度（30、40、50、60、70、80 ℃）以及料液比[1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60（g/mL）]等單一因素對多酚提取率的影響。

1.2.5 響應(yīng)面試驗設(shè)計

根據(jù)單因素提取試驗結(jié)果，選擇多酚提取時間、提取溫度、乙醇濃度作為自變量，蛋黃果的果肉和種子多酚提取率作為響應(yīng)值，設(shè)計三因素三水平的響應(yīng)面試驗，經(jīng)擬合二次多項回歸方程最終確定最佳多酚提取工藝。

1.2.6 多酚的抗氧化活性研究

1.2.6.1 多酚的提取制備

按照響應(yīng)面法優(yōu)化的最佳條件提取蛋黃果的果肉和種子多酚，分別配制不同濃度的樣品液（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL）進行抗氧化活性試驗。

1.2.6.2 抗氧化性測定

DPPH自由基清除率的測定：參照Brand-Williams等[13]方法稍作修改，準確量取2 mL的樣品液和2 mL 1 mmol/L DPPH溶液，搖勻并于25℃避光反應(yīng)30 min，測定517 nm處的吸光度，計算清除率。

·OH清除率的測定：根據(jù)RE等[14]方法稍作修改，加入各2 mL的6 mmol/LFeSO4、水楊酸和H2O2溶液，避光水?。?7℃）反應(yīng)1 h。測定520 nm處的吸光度，計算清除率。

O2-自由基清除率的測定：參照王宗君等[15]方法稍作修改。取2 mL樣品，依次加入5 mL的0.05 mol/L Tris-HCl緩沖溶液、1 mL 0.05 mol/L鄰苯三酚溶液和0.2mL的0.05mol/LHCl溶液，反應(yīng)10min，記錄325nm處的吸光度，計算清除率。

1.3 統(tǒng)計分析

所有試驗數(shù)據(jù)重復(fù)3次。響應(yīng)面設(shè)計利用Design-Expert 8.0軟件進行處理，其余均采用Origin 8.5軟件作圖分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 乙醇濃度對果肉和種子多酚提取率的影響

乙醇濃度對多酚提取率的影響見圖1。

圖1 乙醇濃度對多酚提取率的影響Fig.1 Effect of ethanol concentration on extraction of polyphenols

影響多酚提取效果的一項重要因素是乙醇溶液濃度[16]，隨著乙醇濃度的增加，多酚提取率呈先升后降的趨勢。乙醇濃度在30%～40%，種子多酚提取率明顯上升，在40%之后逐漸下降。果肉多酚提取率在乙醇濃度30%～50%呈直線上升，而后緩慢下降。因為植物體內(nèi)的水溶性多酚分布在細胞的液泡中，而非水溶性的多酚物質(zhì)存在于細胞壁上，且多與蛋白質(zhì)或多糖類物質(zhì)以氫鍵結(jié)合。低體積分數(shù)的乙醇溶液可以進入細胞內(nèi)部，而高體積分數(shù)的乙醇會引起蛋白質(zhì)變性，阻止多酚類物質(zhì)的傳質(zhì)過程，從而降低多酚的提取率。因此，選擇50%和40%的乙醇溶液分別作為果肉和種子多酚的提取溶劑。

2.1.2 提取時間對果肉和種子多酚提取率的影響

提取時間對多酚提取率的影響見圖2。

圖2 提取時間對多酚提取率的影響Fig.2 Effect of extraction time on extraction of polyphenols

為了研究提取時間對果肉和種子多酚提取率的影響，設(shè)置提取時間為40 min～140 min。 提取時間的延長，有利于果肉和種子多酚的提取率的提高，而提取時間超過100 min，果肉和種子多酚提取率隨之下降。超聲輔助提取植物多酚時可加速植物多酚從細胞壁中釋放從而影響多酚提取率，植物多酚的結(jié)構(gòu)受提取時間過長影響而遭到破壞，引起植物多酚提取率顯現(xiàn)明顯下降的趨勢[17]。因此，果肉和種子多酚的最佳提取時間為100 min。

2.1.3 提取溫度對果肉和種子多酚提取率的影響

提取溫度對多酚提取率的影響見圖3。

圖3 提取溫度對多酚提取率的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on extraction of polyphenols

提取溫度高低直接影響多酚提取率，由圖3可知，溫度在30℃～60℃，果肉和種子多酚提取率呈上升趨勢，當溫度達到60℃時，果肉和種子多酚提取率達到最大值。溫度影響分子運動速度，升高溫度加快多酚提取率的提高。當提取溫度高于60℃時，種子和果肉多酚提取率均有下降。多酚在較高溫度可能發(fā)生氧化或者降解[18]，因此，果肉和種子多酚的最佳提取溫度為60℃。

2.1.4 料液比對果肉和種子多酚提取率的影響

料液比對果肉和種子多酚提取率如圖4所示。

圖4 料液比對多酚提取率的影響Fig.4 Effect of ratio of material to water on extraction of polyphenols

料液比在 1∶10（g/mL）～1∶30（g/mL）時，果肉和種子多酚提取率呈上升趨勢，這是由于隨著溶劑量的增加，多酚易于擴散、溶解。當料液比為 1∶30（g/mL）時，果肉和種子多酚的提取率最大，繼續(xù)增加溶劑量，果肉和種子多酚的提取率稍有下降，較為平緩，這可能是提取過程中有一些多糖等雜質(zhì)干擾[19]。因此，選擇料液比1∶30（g/mL）作為果肉和種子多酚的提取條件。

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化多酚的提取工藝

2.2.1 模型擬合和統(tǒng)計分析

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，多酚提取率與三因素（乙醇濃度、提取時間、提取溫度）有關(guān)，因此，響應(yīng)面法優(yōu)化超聲波輔助提取蛋黃果的果肉和種子多酚的自變量設(shè)為乙醇濃度、提取時間、提取溫度，三因素三水平試驗設(shè)計以及試驗結(jié)果（種子/果肉）見表1。

表1 Box-benkhen試驗設(shè)計和多酚提取率Table 1 Box-benkhen design and extraction yield of polyphenols

得到的二次多項式回歸模型方程為：Y種子=2.60+0.012A+0.012B+0.01C+0.013AB-0.002 5AC+0.023BC-0.22A2-0.15B2-0.13C2；Y果肉=0.69+0.043A+0.013B+0.020C-0.030AB+0.065AC+0.005BC-0.13A2-0.082B2-0.13C2。

果肉多酚提取工藝回歸模型的方差結(jié)果見表2。

表2 果肉回歸模型方差分析Table 2 Analysis of variance of the pulp regression model

模型的顯著性與F值和p值有關(guān)[20]。果肉多酚提取模型的 F 值=67.68，p＜0.000 1，R2=0.988 6，R2adj=0.974 0，顯示模型顯著且擬合程度較好；果肉多酚模型的C.V.%為3.63%，表明試驗值的精確性和可靠性較好。果肉回歸模型中一次項 A，二次項 A2、B2、C2，交互項 AC 為極顯著性差異（p＜0.01）；一次項C、交互項AB表現(xiàn)為顯著性差異（p＜0.05），而一次項B、交互項BC為不顯著（p＞0.05），表明乙醇濃度對果肉多酚提取率影響較小，結(jié)合F值可知各因素的影響大小為提取溫度（A）＞提取時間（C）＞乙醇濃度（B）。

種子多酚回歸模型的方差結(jié)果見表3。

表3 種子回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variance of the seed regression model

種子多酚提取模型的F值為238.18，p＜0.000 1，模型極顯著。種子多酚模型的R2為0.996 7，R2adj為0.992 6，顯示模型擬合程度較好，試驗值和預(yù)測值接近；并且種子多酚模型的C.V.%為0.59%，表明試驗值的精確性和可靠性強。種子回歸模型中一次項A、B，交互項 BC 為顯著性差異（p＜0.05）， 二次項 A2、B2、C2為極顯著性差異（p＜0.01），一次項 C、交互項AB、AC為不顯著（p＞0.05），說明提取時間對種子多酚提取率影響較小，結(jié)合F值可知提取溫度（A）和乙醇濃度（B）對種子多酚提取率的影響大小一致，均大于提取時間（C）。綜上分析，蛋黃果種子多酚所建立的提取模型可信度較高，可用于預(yù)測種子多酚的提取量。

2.2.2 響應(yīng)曲面圖分析

兩因素交互作用的響應(yīng)面等高線圖見圖5～圖6。

圖5 乙醇濃度和提取溫度交互作用對果肉多酚提取率影響的等高線圖和響應(yīng)曲面圖Fig.5 Contour and response surface plot for the interactive effect of ethanol concentration and extraction temperature on the yield of polyphenols from pulp

圖6 提取時間和乙醇濃度交互作用對種子多酚提取率影響的等高線圖和響應(yīng)曲面圖Fig.6 Contour and response surface plot for the interactive effect of extraction time and ethanol concentration on the yield of polyphenols from seeds

響應(yīng)曲面圖直觀地顯示各因素之間交互作用對響應(yīng)值的影響[21]。由圖5可知，提取時間固定在0水平時，隨著乙醇濃度和提取溫度的增加，果肉多酚提取率呈先增后減趨勢，提取溫度比乙醇濃度對果肉多酚提取率的曲線較為陡峭，表明提取溫度對多酚提取過程影響更大。由等高線橢圓形圖可知，乙醇濃度和提取溫度2種因素的交互作用對果肉多酚提取率有顯著的影響。

由圖6可知，提取溫度在0水平時，當增加乙醇濃度和提取時間時，種子多酚提取率呈先增后減趨勢且下降趨勢非常明顯，其中乙醇濃度和提取時間對種子多酚提取率的曲線陡峭程度相似，說明兩因素對種子多酚提取率的影響程度相近。由等高線橢圓形圖可以看出，乙醇濃度和提取時間的交互作用對種子多酚提取率比果肉多酚提取率影響大。

2.2.3 最佳條件的確定與模擬的驗證

經(jīng)過試驗數(shù)據(jù)分析得出果肉和種子多酚的最佳提取溫度分別為61.94、60.29℃，最佳乙醇濃度分別為50.44%和40.46%，提取時間分別為102.49、100.84 min，預(yù)測值分別為0.71%和2.69%；顯然，果肉多酚和種子多酚最佳提取時間和提取溫度的工藝條件接近。根據(jù)實際情況對參數(shù)進行修正，修正后果肉和種子多酚的最佳工藝分別為提取溫度62℃和60℃，乙醇濃度50%和40%，提取時間102 min和101 min；按最佳工藝條件重復(fù)試驗3次，得到果肉和種子多酚實際提取率分別為0.74%和2.65%，試驗值接近于預(yù)測值，模型可行。

2.3 多酚的抗氧化活性

2.3.1 DPPH自由基清除能力

多酚對DPPH自由基的清除活性見圖7。

圖7 多酚對DPPH自由基的清除活性Fig.7 Scavenging activity of polyphenols on DPPH·

由圖7可知，果肉多酚、種子多酚和VC對DPPH自由基的清除能力隨著樣品質(zhì)量濃度的增加而增加，其中果肉多酚受濃度影響較大，此結(jié)果與文獻報道一致[22-25]。同一濃度下，VC的清除效果最好，種子多酚次之，果肉多酚的清除能力最弱。當濃度為1.0 mg/mL時，VC、種子多酚、果肉多酚的清除率分別為96.36%、87.50%、65.31%，由此表明，果肉和種子多酚都具顯著的DPPH自由基清除能力，且種子多酚的DPPH自由基清除能力強于果肉。

2.3.2 OH自由基清除能力

多酚對OH自由基的清除能力見圖8。

圖8 多酚對OH自由基的清除能力Fig.8 Scavenging activity of polyphenols on·OH

由圖8可知，果肉多酚、種子多酚和VC對OH自由基的清除能力隨著樣品質(zhì)量濃度的增加而增加，其中種子多酚受濃度影響最大。當濃度在0.2 mg/mL～0.4 mg/mL時，果肉和種子多酚的清除能力相差不大，在0.4 mg/mL之后，種子多酚的清除能力遠高于果肉，但都弱于VC。當濃度為1.0 mg/mL時，VC、種子多酚、果肉多酚的清除率分別為89.11%、63.11%、22.64%，由此表明，種子多酚具有較強的OH自由基清除能力，高于果肉。

2.3.3 O2-自由基清除能力

多酚對O2-自由基的清除能力見圖9。

圖9 多酚對O2-自由基的清除能力Fig.9 Scavenging activity of polyphenols on O2-·

由圖9可知，果肉多酚、種子多酚和VC對O2-自由基的清除能力隨著樣品質(zhì)量濃度的增加而增加，其中果肉多酚和VC受濃度影響較大。當濃度在0.2 mg/mL～0.8 mg/mL時，種子多酚的清除能力要高于果肉多酚，在0.8 mg/mL之后，果肉和種子多酚的清除能力相接近，相比于果肉和種子多酚，VC的清除能力更高。當濃度為1.0 mg/mL時，VC、種子多酚、果肉多酚的清除率分別為96.33%、19.97%、19.92%，由此表明，果肉和種子多酚都具有一定的O2-自由基清除能力[26-27]，且相差不大。

3 結(jié)論

采用超聲波輔助法提取蛋黃果的果肉和種子多酚，并利用響應(yīng)面法優(yōu)化果肉和種子多酚的提取條件。果肉多酚最佳工藝條件為提取溫度62℃，乙醇濃度 50%，提取時間 102 min，料液比 1∶30（g/mL），提取率為0.74%；種子多酚最佳工藝條件為提取溫度60℃，乙醇濃度 40%，提取時間 101 min，料液比 1∶30（g/mL），提取率為2.65%；此外，通過體外抗氧化活性試驗來探究果肉和種子多酚的抗氧化能力。結(jié)果表明，果肉和種子多酚對DPPH自由基、OH自由基、O2-自由基均有清除能力，且種子多酚的清除能力較強。蛋黃果種子中多酚的含量要高于果肉，且種子多酚的抗氧化能力也強于果肉。蛋黃果的果肉和種子提取工藝模型可行性高，抗氧化性能優(yōu)越。