DNA微陣列原位化學(xué)合成

閆漢，肖鵬峰，劉全俊，陸祖宏

（東南大學(xué)生物科學(xué)與生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院，生物電子學(xué)國家重點實驗室，江蘇 南京 210096）

隨著生命科學(xué)的飛速發(fā)展，全球每年需要合成數(shù)以百萬計的DNA片段，用于生命科學(xué)相關(guān)的研究［1-5］。在大多數(shù)應(yīng)用中，主要采用基于DNA合成柱的固相化學(xué)合成方法來合成所需的DNA片段［6-10］，然而該方法已經(jīng)無法滿足當(dāng)下的合成要求。目前，合成生物學(xué)的高速發(fā)展引領(lǐng)第三次生物技術(shù)革命［11-19］。DNA作為生命遺傳物質(zhì)的載體，是繪制各種人工生命系統(tǒng)藍圖的基礎(chǔ)，高通量低成本快速DNA合成已成為合成生物學(xué)的關(guān)鍵支撐性技術(shù)。近十年來，人類獲取信息能力一直在快速增強。如圖1（a）所示［20］，每年全球獲取信息的總量超過100 ZB量級。以硅為介質(zhì)的信息存儲器件存在信息保存時間短（一般十年左右）、信息保存容量低、耗能高等問題，不能適應(yīng)大量“冷數(shù)據(jù)”（需要長期保存的信息）的存儲要求。生物系統(tǒng)中DNA分子具有信息容量大、穩(wěn)定性好、讀取過程能耗低等特點，其作為未來新的信息存儲介質(zhì)正受到越來越多的關(guān)注［21-31］，并正在成為半導(dǎo)體合成生物學(xué)這一新興領(lǐng)域的重要研究方向。正是上述新興研究領(lǐng)域的巨大需求加速了DNA合成技術(shù)的發(fā)展［32］。DNA微陣列原位化學(xué)合成作為一項DNA合成技術(shù)，為DNA存儲、大基因組合成提供所需的目的序列。下游的DNA存儲、大基因組合成等新興應(yīng)用要求合成更長序列、更大容量的DNA樣本，這些是對DNA合成的要求和挑戰(zhàn)。同時DNA合成技術(shù)能否合成出更長序列和更大容量的DNA樣本將會制約著下游技術(shù)的發(fā)展。目前基于合成柱的DNA合成通量低，最大合成柱儀器的合成通量只有1536種DNA序列，成本在0.05～0.17美元/堿基，無法滿足未來DNA合成的需求；基于酶等DNA合成技術(shù)尚未成熟，其發(fā)展還存在一定的不確定性；而基于固相化學(xué)合成的微陣列技術(shù)能夠很好地兼顧合成通量和成本，同時該技術(shù)比較成熟。因此，發(fā)展基于微陣列芯片的固相化學(xué)合成技術(shù)，仍然是高通量低成本DNA合成和為下游產(chǎn)業(yè)技術(shù)提供DNA合成產(chǎn)物的一條重要技術(shù)路徑。

基于微陣列的DNA合成方法可實現(xiàn)DNA序列的并行高通量合成，其合成密度可達到每平方厘米數(shù)百萬。2014年基于寡核苷酸微陣列原位合成方法，DNA合成成本已低于10-3美元/堿基，2020年基于電致酸合成的DNA成本估計達到10-6美元/堿基，且具有進一步大規(guī)模降低成本的潛力［33］。圖1（b）給出了美國半導(dǎo)體研究會2018年預(yù)測的DNA合成成本和速度的發(fā)展趨勢。根據(jù)該預(yù)測，到2023年DNA合成成本要降低到10-10美元/堿基以下。然而受到合成產(chǎn)率的限制最近幾年DNA合成發(fā)展比較緩慢，在合成長度上同時高通量、高產(chǎn)率地合成超過200 mer的DNA鏈仍然存在著挑戰(zhàn)?；谖㈥嚵械腄NA合成方法在成本和合成通量方面具有明顯的發(fā)展優(yōu)勢［34-38］。近年來該領(lǐng)域的進展和突破偏少，基于固相化學(xué)合成原理技術(shù)的發(fā)展遇到了瓶頸，包括：單條寡核苷酸的產(chǎn)量過低，通常比柱式合成低2～4個數(shù)量級；合成長度受限、產(chǎn)物過于復(fù)雜，干擾后續(xù)的DNA組裝過程；合成準確性受限，引入更多合成錯誤，提高驗證和錯誤矯正成本等。在此基礎(chǔ)上更進一步地提高合成產(chǎn)率和合成長度，是目前該領(lǐng)域的科研工作者的目標(biāo)。本文梳理了現(xiàn)有固相合成技術(shù)，對它們的原理及其特點加以介紹，從而給讀者和該方向的研究者一些啟發(fā)和思路。

圖1 美國半導(dǎo)體研究會預(yù)測的存儲發(fā)展趨勢［20］Fig.1 American Semiconductor Research Association predicts storage development trends[20]

1 DNA固相化學(xué)合成原理及技術(shù)路徑

DNA微陣列（DNA芯片）原位合成是指直接在固體基質(zhì)（芯片）上用四種單核苷酸實現(xiàn)所需的DNA片段的合成。其原理基于亞磷酸酰胺固相化學(xué)合成法（圖2）及改良后的亞磷酸酰胺固相化學(xué)合成法［7，39-43］。芯片上每個陣點均由四個反應(yīng)步驟構(gòu)成一個循環(huán)，每循環(huán)一次完成一個堿基的合成。如圖2所示，亞磷酸酰胺固相化學(xué)合成法每個循環(huán)的四個反應(yīng)步驟為：①去封閉，待合成體系中加入三氯乙酸（TCA）以去除連接在固相載體上核苷酸5′-羥基端的二甲氧基三苯甲基（DMT）保護基團，從而獲得游離的5′-羥基端，以供下一步合成反應(yīng)。②活化偶聯(lián)，3′端的亞磷酸酰胺單體與四氮唑活化劑混合形成亞磷酸酰胺四唑活性中間體，并在序列中與先前連接在固相載體上核苷的5′-羥基發(fā)生偶聯(lián)反應(yīng)，形成亞磷酸三酯，使合成序列鏈向前延長一個堿基。③蓋帽，任何未與亞磷酸酰胺單體發(fā)生反應(yīng)的5′-羥基通過乙酸酐?；磻?yīng)被封閉，此外在第二步偶聯(lián)反應(yīng)中所有未向前延長一個堿基的序列在后續(xù)的合成反應(yīng)中將是惰性的，始終維持其長度不變。④氧化，采用碘的四氫呋喃溶液將不穩(wěn)定的、易被酸或堿水解的亞磷酸酯鍵轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定的五價磷酸酯鍵。經(jīng)過上述步驟的循環(huán)反應(yīng)，即可得到特定長度的DNA片段。此后對所合成的DNA片段用濃氨水等試劑進行切割，使其從固相載體上脫落下來，同時脫去堿基上的保護基團，最后經(jīng)過純化得到目的長度的DNA序列。

圖2 亞磷酸酰胺DNA固相化學(xué)合成法Fig.2 Solid phase chemical synthesis cycle of DNA by phosphite amide method

DNA微陣列原位合成的最大優(yōu)勢是可以同時進行不同序列DNA的并行合成。其特征是芯片上所有陣點按照預(yù)設(shè)計的目標(biāo)序列，將需要合成相同堿基的不同陣點上的堿基合成反應(yīng)合并在一起進行特定的反應(yīng)，從而并行完成一個堿基的合成［44-47］；而預(yù)合成不同堿基的其他陣點則不參與本次反應(yīng)，留給后續(xù)的反應(yīng)以完成堿基的合成。Southern首次采用更換不同的微流體通道（相當(dāng)于物理掩模板），將單體試劑通過微流體通道與合成區(qū)域接觸，發(fā)明了微流通道原位合成技術(shù)［48-50］。之后，人們提出了不同DNA微陣列原位合成方法［34，51-56］。到目前為止，基于亞磷酸酰胺固相化學(xué)合成法原理的DNA微陣列合成策略根據(jù)脫保護方式不同，大致可以分為光化學(xué)選擇性脫保護、酸選擇性脫保護和單體選擇性轉(zhuǎn)移偶聯(lián)三種類型（圖3）。光化學(xué)選擇性脫保護法是將亞磷酸酰胺法中所用的核苷酸單體的5'-羥基保護基團替換為光敏基團［圖3（a）］，在光照下該保護基團可被脫除。酸選擇性脫保護法［包括光（或者電）致酸法］的特點是通過光照射（或者電極通電）使陣點上的物質(zhì)發(fā)生光（或者電）化學(xué)反應(yīng)從而產(chǎn)生酸將5′端的保護基團脫除，曝露出羥基以供后續(xù)的偶聯(lián)反應(yīng)［圖3（b）］。單體選擇性轉(zhuǎn)移偶聯(lián)法是直接采用亞磷酸酰胺合成方法，通過物理作用（點樣、噴印、壓印或者與微流體接觸等方式），先后分次將相應(yīng)的核苷酸單體反應(yīng)液轉(zhuǎn)移到芯片的不同陣點上實施偶聯(lián)反應(yīng)［圖3（c）］，經(jīng)過多次循環(huán)后完成不同陣點上不同DNA序列的合成，這一類型還包括微流體通道載片合成、噴印合成法和壓?。ㄜ浌饪蹋┓āＯ旅鎸Σ煌珼NA芯片原位合成方法分別進行具體的介紹。

圖3 三類DNA微陣列原位化學(xué)合成策略Fig.3 Three types of DNA microarray in situ chemical synthesis strategies

2 DNA芯片原位合成法

2.1 原位光刻合成技術(shù)（原位光刻法）

Affymetrix公司的GeneChipTM是高密度DNA微陣列原位合成的代表，制造工藝采用原位光刻法。20世紀90年代初，F(xiàn)odor等提出了大規(guī)模固定化多肽陣列和DNA陣列的光導(dǎo)原位合成技術(shù)［57-60］。DNA光導(dǎo)原位合成試劑是利用其堿基單體5'-羥基端的光敏保護基團，如圖4所示，這些光敏基團可以是α-甲基（-2-硝基胡椒基）氧羰基或2（-2-硝基苯基）丙氧羰基。通過光掩模板（簡稱光掩模）可以精準地對特定位置的DNA基團進行脫保護（圖5）［61］，感光區(qū)域部分在光作用下保護基團被激活并脫去，從而暴露出活性羥基基團，進而發(fā)生后續(xù)的偶聯(lián)反應(yīng)，完成反應(yīng)后洗去未有效結(jié)合的單體，最后將未偶聯(lián)的活性羥基用乙酸酐試劑封閉、阻斷其參與后續(xù)的反應(yīng)。單體的合成只在脫保護基的區(qū)域進行，光照區(qū)域就是要合成的區(qū)域，該過程通過操作光掩模來控制。一般而言，每層的四個不同堿基需要相應(yīng)的四個掩模板（簡稱掩模）來完成其偶聯(lián)反應(yīng)。當(dāng)然，不同層的相同堿基可使用同一掩模來合成以減少合成的次數(shù)。通過交替使用不同的光掩模，重復(fù)上述步驟，直到目的探針序列被完全的合成。光去保護并行合成技術(shù)的關(guān)鍵在于合成出含有光敏保護基的核酸單體試劑，這種試劑要有高效的偶聯(lián)和光脫保護基團效率同時不應(yīng)對合成序列造成損傷。

圖4 不同類型的核苷酸Fig.4 Different types of nucleotides

圖5 GeneChip探針陣列的制備［61］Fig.5 Preparation of GeneChip probe array[61]

在利用光掩模進行DNA芯片制備時，每個堿基需要4塊光掩模，50個堿基長度的核酸陣列需要200塊光掩模。雖然通過堿基合成流程的優(yōu)化，實際所需掩?？梢赃m當(dāng)減少，但光掩模數(shù)量仍然需要很多。對于大量研究用客戶定制型芯片來說，芯片定制量很小，單一芯片制備的成本高、時間長。Gassgeet等［62］提出了一種虛擬掩模（無掩模）技術(shù)。該技術(shù)直接利用投影儀中常用的光學(xué)數(shù)字微轉(zhuǎn)鏡陣列芯片來進行位置選擇性曝光，通過計算機控制實現(xiàn)核酸微陣列的光導(dǎo)原位合成。這種基于虛擬掩模的DNA芯片合成技術(shù)避免了大量昂貴光掩模的使用，是一種高效、靈活的寡核苷酸芯片原位合成方法［63-64］。數(shù)字微轉(zhuǎn)鏡芯片由數(shù)十萬個微小鋁鏡陣列組成，每個微鏡相當(dāng)于一個像素點，把一束平行光分成數(shù)十萬個光點，在計算機指令的控制下精確實時地分別控制其反射方向，在基片上的特定區(qū)域選擇性地進行光脫保護處理。Gassgeet等在8 h內(nèi)成功地在16 mm2的芯片表面上制備出了76 000種DNA探針。光脫保護并行原位合成法優(yōu)點在于光刻的空間分辨率高，單位面積上可以合成更多的不同DNA序列，寡核苷酸合成序列密度可達106/cm2以上。

光脫保護并行原位合成法的化學(xué)合成循環(huán)與傳統(tǒng)的固相合成寡核苷酸相似，但由于微陣列陣點合成的復(fù)雜性和玻璃基底上合成動力學(xué)的獨特性，需要對合成參數(shù)和循環(huán)進行仔細的探索和獨特的調(diào)整，以提升脫保護和偶聯(lián)反應(yīng)效率［55，65-69］。傳統(tǒng)的固相合成中，偶聯(lián)效率介于98%～99%，偶聯(lián)效率低于100%的原因在于偶聯(lián)反應(yīng)的不完全以及嘌呤累積暴露于酸性條件下產(chǎn)生脫嘌呤反應(yīng)。偶聯(lián)反應(yīng)和后續(xù)封閉反應(yīng)的失敗結(jié)果與脫保護的失敗結(jié)果類似，將會導(dǎo)致合成序列中單個堿基的“刪除”，這是人工基因構(gòu)建的主要錯誤。因此合成反應(yīng)后的樣品庫中存在著一些包含錯誤的非目的序列，當(dāng)要獲取目的鏈時可通過封閉反應(yīng)以及在堿基脫保護步驟中將脫嘌呤反應(yīng)的位點鏈斷裂并純化的手段來獲得正確的全長序列。在光脫保護并行原位合成法中，偶聯(lián)效率相對略低導(dǎo)致更多的“刪除”錯誤；除此之外，“插入”錯誤對整體錯誤率有很大貢獻，這是因為光學(xué)成像系統(tǒng)不可避免的缺陷導(dǎo)致微陣列在意外曝光時，就會發(fā)生序列“插入”誤差。像漂移、散射、衍射和光暈都會引起去保護，繼而對合成序列引入插入誤差，這也是值得深入考慮的問題。以5'-NPPOC保護的亞磷酸酰胺單體為例，目前探索給出的最佳合成參數(shù)為：氧化反應(yīng)60 s，偶聯(lián)反應(yīng)60 s［0.025 mol/L單體+0.25 mol/L催化劑4，5-二羥基咪唑（DCI）］，曝光劑量12 J/cm2（脫保護），乙酸酐封閉120 s后氦氣干燥30 s。測得的耦合效率分別為：99.8%（dA）、98.0%（dC）、98.6%（dG）、99.4%（dT），四個堿基的平均偶聯(lián)效率為99.0%，遠大于之前報道的95%～98%［64，70-71］。對化學(xué)合成和光敏保護基團的研究表明［67］，使用DCI催化劑將偶聯(lián)時間減少到幾秒亦可以保持芯片的高質(zhì)量。在對比了5種催化劑合成芯片的雜交信號后發(fā)現(xiàn)，使用偶聯(lián)催化劑的雜交信號強度順序為5-乙硫基四氮唑（ETT）＞5（-二-3，5三氟甲基苯基）1-H-四唑（活化劑42）＞DCI≥5-芐巰基-1-H-四氮唑（BTT）≥氯化吡啶，但只有DCI產(chǎn)生高強度和高穩(wěn)定性的特征信號。而用噻吩基團取代NPPOC光敏基團后，光脫保護時間也縮短到幾秒。通過優(yōu)化，高復(fù)雜性DNA陣列合成中的偶聯(lián)反應(yīng)只需15 s，脫保護時間只需9 s，單循環(huán)的總時間（偶聯(lián)反應(yīng)-偶聯(lián)反應(yīng)）約50 s，整個合成時間被減少了三倍。在此基礎(chǔ)上，非線性半導(dǎo)體光抗技術(shù)（non-linear semicondutor photoresist technology）的運用，使得陣點的間距更加微小，增加了單位面積上合成不同寡核苷酸序列的數(shù)量。

2.2 光敏抗蝕層合成法

IBM公司開發(fā)的“光敏抗蝕層合成法”類似于原位光刻法。該DNA合成方法基于酸脫保護的固相化學(xué)合成方法（亞磷酸酰胺法、氫磷酸酯法和磷酸三酯法），在每次選擇性脫保護之前在芯片表面涂覆光敏抗蝕層（光刻膠），通過曝光顯影把需要連接堿基區(qū)域的光刻膠層洗脫，在特定區(qū)域的核酸進行脫保護和偶聯(lián)反應(yīng)操作后，再把該層光刻膠層全部清除。該技術(shù)在合成一個堿基時要在芯片表面涂覆四次光刻膠，也需要采用四塊不同的光掩模［70，72］。具體的制備方法如圖6所示，首先對合成所用的玻璃基片進行硅烷化處理以便連接末端含羥基的連接手臂分子，手臂分子上端為羥基，并在其上連接一個帶有保護基團的核苷酸（圖6中的黑點）；隨后在其上均勻制備一層光敏抗蝕層，通過對應(yīng)的光掩模把需要連接堿基的區(qū)域進行曝光顯影后使待合成區(qū)域暴露出來，隨后脫去核苷酸上的保護基團（黑點），并暴露出5′-羥基，在5′端發(fā)生偶聯(lián)反應(yīng)連接一個堿基。該方法運用成熟的酸脫保護合成試劑，有較高的合成產(chǎn)率。但其制備過程中需要大量的涂膠、顯影、去膠等復(fù)雜光刻工藝，操作過程復(fù)雜，表面容易污染。特別是去膠過程要用化學(xué)活性較強的試劑和強力的物理條件，對表面上所合成的寡核苷酸會造成一定的損失。

圖6 光敏抗蝕層合成法原理（單層抗蝕劑工藝）Fig.6 Principle of parallel chemical synthesis of photoresist(Single layer resist process)

2.3 光致酸法

為了兼容光敏抗蝕層與寡核苷酸層之間的化學(xué)性質(zhì)，人們開發(fā)了一種含有光致酸分子的光敏保護層［73-74］，用其進行堿基選擇性脫保護反應(yīng)進而來制備基因芯片。在光致酸法中運用能夠在光照下產(chǎn)生H+離子的化合物作為脫保護試劑。當(dāng)施加光照時，光照區(qū)域的脫保護試劑產(chǎn)生大量的酸，使該區(qū)域核苷酸5′端的保護基團脫離，暴露出被激活的5′-羥基端，以進行下一步堿基的偶聯(lián)合成反應(yīng)，這樣可簡化制備基因芯片的工藝步驟。光致酸原位合成法除了用光致酸溶液替代傳統(tǒng)的三氯乙酸外，其他的步驟與柱合成DNA相同。在光致酸脫保護這一步驟中，Gao等［75-76］引入了三芳基锍六氟銻酸鹽（triarylsulfonium hexafluoroantimonate）溶液，在光的照射下，三芳基锍六氟銻酸鹽光解生成活性較強的H+SbF-6，更容易解離出H+，從而使H+擴散區(qū)域的5′端保護基團DMT脫除，活化出5′-羥基，以進行下一步堿基合成（圖7）；而未光照區(qū)域周圍的三芳基锍六氟銻酸鹽，則不會發(fā)生光解反應(yīng)而離解出H+，5'端的保護基團DMT仍然保留，不會發(fā)生偶聯(lián)反應(yīng)。光致酸DNA微陣列原位合成中合成反應(yīng)需要與光致酸反應(yīng)在溶液中并行運行。已有研究表明，光致酸的前體化合物如重氮酮磺酸鹽、磺化鈉或碘鹽在二氯甲烷等有機溶液中，可以產(chǎn)生質(zhì)子酸，并脫除5′端保護基團DMT［77-78］。除了光照條件外，還可以加入硫氰酮等增敏劑，這樣10-3mol/L量級的光致酸前體溶液就能有效去除DMT基團，使5′-OH基團的核苷酸或載體可以用于下一個核苷酸的合成。實際上，某些光敏感的5′-OH保護基團，也就是核苷5′端的光活化基團，本身也可用作光致酸的前體。例如，在多肽微陣列合成中使用光致酸試劑2（-2-硝基苯基）丙氧羰基哌啶或2（-2-硝基苯基）丙氧羰基肼，可以提高光解反應(yīng)效率［51］。

圖7 光致酸合成法原理Fig.7 Chemical principles of photoacid DNA synthesis

2.4 噴印合成法

噴印合成法原理類似于在紙上噴射墨水所用的噴墨打印機。“墨盒”中裝的是四種堿基的液體，噴印頭可在整個芯片上移動并根據(jù)芯片上不同位點探針的序列需要將特定的堿基噴印到芯片上特定的位置［79-81］。與亞磷酸酰胺法DNA固相合成相比，主要的變化是用一種更加黏稠和不易揮發(fā)的溶劑，如己二腈，代替了常用的溶劑乙腈。己二腈代替乙腈的優(yōu)勢是減緩溶劑揮發(fā)，避免反應(yīng)物固相化：延長液體與載體充分接觸的反應(yīng)時間，保障偶聯(lián)效率。在玻璃基片上合成DNA陣列時，首先在基片上修飾一層一端為羥基的連接臂分子，計算機控制的微噴頭可在整個芯片上移動，并根據(jù)芯片上不同位點DNA序列的需要將四種不同堿基的DNA合成單體試劑噴印在芯片上特定位置。微噴頭在基片上方移動，分別噴印在基片表面的不同位置上（圖8）。每次噴印即為在該點陣上進行一次偶聯(lián)反應(yīng)。當(dāng)基片表面所有點陣全部噴印偶聯(lián)完成后，再統(tǒng)一進行其他反應(yīng)操作流程，包括沖洗、封閉，氧化和脫保護等化學(xué)處理步驟。然后，再進行下一個堿基的逐點噴印合成，循環(huán)各個步驟，直至完成目的DNA探針合成。噴印合成法單步合成只需輸送很少量的偶聯(lián)反應(yīng)試劑，合成產(chǎn)率高，具有成本上的優(yōu)勢。噴印合成法可進行較長堿基序列的合成，可達到120個堿基以上，一般是低通量DNA合成的首選技術(shù)。噴印合成法也可以通過對所需脫保護的區(qū)域噴射三氯乙酸脫保護試劑的方法進行堿基的選擇性合成。噴射脫保護試劑區(qū)域的保護基團被活化從而暴露出5′-羥基端以進行下一步的偶聯(lián)反應(yīng)。美國Agilent公司利用噴墨的原位合成技術(shù)合成了陣點大小為270μm，60個堿基的寡核苷酸芯片［82］。但該方法由于噴頭的機械定位精度有限，噴印的位置不可能完全重疊。因此，噴印中心部位的產(chǎn)率比平均產(chǎn)率要高得多，限制了實現(xiàn)更高密度的DNA陣列合成。Twist Biosciences公司開發(fā)了一種基于半導(dǎo)體的合成DNA制造工藝，該工藝具有高通量硅平臺，通過更加高效的反應(yīng)效率使DNA合成所需的化學(xué)成分微量化。該技術(shù)將反應(yīng)體所需的化學(xué)試劑體積減少100萬倍，同時將合成通量提高了1000倍。實現(xiàn)了在單個硅芯片上高通量并行合成9600個基因。與傳統(tǒng)的96孔板合成相比較，相同合成空間下96孔板只能合成單個基因。

圖8 噴印合成法示意圖（通過機械手將“墨盒”中裝的四種堿基合成試劑分別點樣到基片預(yù)定設(shè)計的位置上進行堿基的合成，循環(huán)該步驟就可以在基片上不同位置合成出預(yù)設(shè)的DNA序列）Fig.8 Schematic diagram of the in-situ printing synthesis method(The four base synthesis reagents in the"cartridge"are respectively spotted to the predetermined position of the substrate to synthesize the base,and this step can be cycled to synthesize a preset DNA sequence in different positions of the substrate)

2.5 軟光刻合成法

基于微陣列的軟光刻合成法，是指模板與基質(zhì)接觸，將模板陣點上攜帶納升級溶液通過印刷等方式轉(zhuǎn)移到芯片表面進行反應(yīng)的DNA微陣列制備技術(shù)。高質(zhì)量DNA微陣列合成的關(guān)鍵技術(shù)是高效準確地將生物分子轉(zhuǎn)移到基質(zhì)指定的區(qū)域上，以及實現(xiàn)高效率的（偶聯(lián)）反應(yīng)［83-88］。軟光刻原位合成法主要包括下列步驟［89］：①模板的制備；②模板攜帶的反應(yīng)分子“墨水”向接觸芯片轉(zhuǎn)移；③反應(yīng)分子在芯片上的原位合成。分子印章法原位合成DNA芯片是軟光刻原位合成技術(shù)的一種，該方法采用涂有單核苷酸的印章多次壓印在同一位置上，合成原理與印章蓋印類似，將四種不同種類的核苷酸用四個不同印章壓印在芯片上預(yù)先設(shè)定的部位［90-94］（圖9）。每層四種不同堿基的合成需要四個不同的印章攜帶相應(yīng)的核苷酸液體（N個核苷酸長的芯片一般需要4N個壓印步驟），通過“優(yōu)化合成探針”把不同“層”相同堿基序列一同合成（比如第一個序列的第一個堿基C合成后，它的第二個堿基T可以和第二個序列的第一個堿基T一起合成）的設(shè)計可以減少16%的壓印數(shù)［95］。該技術(shù)采用傳統(tǒng)DNA固相合成的化學(xué)步驟，因此不需特殊制備的化學(xué)試劑即可以獲得高的偶聯(lián)效率。該方法成功合成出每立方厘米65 536種不同DNA序列的DNA微陣列。然而，分子印章法需要保持印章與芯片大面積間的平行微接觸，否則將影響反應(yīng)試劑有效傳輸，進而影響后續(xù)的合成效率。因此，在制備更高密度DNA芯片時該技術(shù)需要研制能夠保持印章和芯片的大面積平行精密接觸的壓印機械裝備。

圖9 分子印章原位合成法Fig.9 In-situ synthesis of soft-lithography

2.6 電致酸法

最早報導(dǎo)的電解致酸脫保護DNA芯片合成研究［96］，在2.0 V電解電位下電解水，釋放氫離子富集于陽極極板附近使得局部酸度增強，進而導(dǎo)致核酸單體分子發(fā)生脫保護反應(yīng)。該研究發(fā)現(xiàn)，電解電位為2 V時，在0.1 mol/L高氯酸四乙基胺濃度條件下可獲得較理想的實驗結(jié)果。電解時間越長脫保護效率越高，兩者基本呈線性關(guān)系，電解質(zhì)濃度對脫保護效率基本無影響。

2005年Egeland和Southern報道了DNA微陣列的電化學(xué)脫保護合成法［97］。他們將正負電極做在同一塊板上構(gòu)成微電極陣列，與基片構(gòu)成反應(yīng)池，DNA合成反應(yīng)試劑填充在反應(yīng)池中。在含有氫醌（HQ）和苯醌（BQ）的乙腈溶液中，電解條件下，陽極發(fā)生氧化反應(yīng)產(chǎn)生酸（陰影區(qū)域：HQ———→ H++Q），苯醌在陰極發(fā)生還原反應(yīng)被再生成氫醌（H++Q———→ HQ）以減少陽極氫醌的消耗。酸（H+）從陽極遷移，向下遷移的酸將會到達基片表面并與DNA鏈末端DMT發(fā)生脫保護基團反應(yīng)，從而有選擇性地確定下一個核苷酸偶聯(lián)反應(yīng)發(fā)生的位置。

CombiMatrix公司（前身為Customarray）在早期從事微電極生物芯片制備的基礎(chǔ)上［98-100］，報道了電化學(xué)原位合成DNA陣列的方法［98，101］。他們利用以金屬氧化物半導(dǎo)體（MOS）場效應(yīng)晶體管為元件的集成電路芯片構(gòu)成可尋址微電極陣列，單個可尋址的鉑電極表面吸附、共價、共聚連接含有諸如蔗糖的高分子涂層，其表面帶有大量羥基，以便衍生出足量用于DNA合成的連接分子。DNA合成時，計算機控制某些微電極通電，用可尋址電極陣列電解產(chǎn)生足夠濃度的酸，選擇性地將載體某些區(qū)域的DMT保護基團脫除，在有機堿存在的情況下生成的酸被控制在直徑100μm的活性電極上（圖10）。反應(yīng)中較大的電流或電壓將導(dǎo)致產(chǎn)生更多的酸，較長的反應(yīng)時間將提供更多的時間去除DMT基團。但H+的擴散也隨著濃度和時間增加而很難控制在直徑100μm的活性電極上，進而導(dǎo)致污染。實驗表明，合成20 mer探針的最佳窗口期為0.7～1.4μA/E。在電流常數(shù)保持在1μA/E條件下，電解1 min可以得到最佳的斑點形狀和雜交強度，過長的時間將會導(dǎo)致斑點形狀的退化，過短的時間將導(dǎo)致雜交強度的減弱。在上述電解條件下，5 mmol/L的2，6-二甲基吡啶提供了良好的酸擴散抑制環(huán)境，只在激活電極上進行了DNA合成；在低于1 mmol/L的2，6-二甲基吡啶條件下，非激活電極上也進行了DNA合成；當(dāng)達到20 mmol/L時，激活電極上不能進行DNA合成。在不同的電壓下，堿基濃度保持恒定在5 mmol/L，反應(yīng)時間為60 s，這個過程中電壓從1.2 V增加到2.6 V（改變間隔為0.2 V）。結(jié)果表明，在1.8 V的最佳電壓下產(chǎn)生了良好的強雜交區(qū)域（代表高質(zhì)量的DNA合成）。較低的電壓產(chǎn)生的DNA質(zhì)量較差，這可能是源于不完全脫保護；而在2.0 V以上的情況下可能破壞固定DNA的載體，從而降低DNA的合成質(zhì)量。

圖10 電致酸法原理Fig.10 Principle of electrochemical deprotection microarray synthesis method

2009年麻省理工學(xué)院通過光電化學(xué)在虛擬電極附近產(chǎn)生氫離子進而合成DNA［102］。半導(dǎo)體電極通過光尋址應(yīng)用于氧化還原反應(yīng)的并行處理，即在光照射虛擬電極的附近產(chǎn)生氫離子，使周圍的DMT保護基團脫除，曝露出羥基，供下一個核苷酸單體進行偶聯(lián)反應(yīng)；而其他未被光照射區(qū)域的DMT保護基團由于未被脫除而無法參與此次的偶聯(lián)反應(yīng)。依次循環(huán)制備單個陣點100μm的DNA微陣列。然而，該方法需要掩模層層間的精準對齊且不同的DNA序列需要不同的掩模。

目前基于集成電路芯片進行尋址合成DNA的技術(shù)已經(jīng)商用化。該技術(shù)可以按照自己的設(shè)計快速合成所需的DNA片段，CombiMatrix公司可以為客戶定制96K、12K、4×2K等不同類型的電化學(xué)合成DNA芯片，合成的DNA序列開始用于DNA存儲研究［103］。

3 總結(jié)與展望

DNA微陣列原位化學(xué)合成具有高通量的特點，在降低成本和提高合成速度方面是滿足合成生物學(xué)和DNA信息存儲等快速發(fā)展需求的一種現(xiàn)實技術(shù)策略。我們把目前常用的基于DNA微陣列化學(xué)合成方法的技術(shù)特征和優(yōu)缺點匯總在表1中。由表1可以看出，利用機械接觸的DNA化學(xué)合成技術(shù)，其主要優(yōu)勢是可以提高每個陣點DNA片段的合成總量，但在芯片上合成不同DNA種類的通量方面提高空間十分有限?；诠鈱W(xué)方法的原位合成技術(shù)，每個芯片一次可以獲得百萬級的寡核苷酸片段，通量雖高，DNA片段長度較短，需要提高光敏核酸基團的偶聯(lián)效率，電致酸技術(shù)能夠獲得較長的核酸片段，但當(dāng)芯片的通量大幅度提高時，游離H+會在電極間擴散，H+離子在電極間的串?dāng)_將成為DNA序列合成中重要的制約因素。

該模擬試驗系統(tǒng)可進行掘進機機身位姿測量試驗、不同形狀斷面自動截割軌跡規(guī)劃模擬試驗、掘進機智能控制試驗等。

表1 基于微陣列DNA原位合成方法及其發(fā)展?jié)摿ab.1 Characteristicsof in situ synthesis of microarray DNA

化學(xué)合成法目前只能合成200 nt以內(nèi)的DNA序列，長序列DNA片段合成仍存在著技術(shù)上的挑戰(zhàn)。在長序列DNA合成方面目前主要通過后續(xù)拼接方法進行。從芯片合成的不同產(chǎn)物中挑選和鑒定出正確序列，結(jié)合多重PCR，選擇性擴增所需的目的片段，通過DNA連接酶把短序列連接成長序列、結(jié)合合成序列糾錯等實現(xiàn)超長DNA序列的制備。

近幾年來，TdT聚合酶等DNA酶合成方法的合成準確率有所提高［104-105］。該方法在合成過程無需使用有害化學(xué)試劑，合成過程產(chǎn)生的副產(chǎn)物少；與目前化學(xué)合成法相比DNA酶合成法的合成條件更加溫和，對DNA產(chǎn)物的損傷較小，具有長片段DNA合成的潛力。因此，基于DNA酶合成方法開始展示出巨大的發(fā)展?jié)摿Γ?06］。但目前TdT等聚合酶的合成方法還不能進行高通量平行地DNA合成，其低通量方法也尚未進入實際應(yīng)用［11，107］。

英國創(chuàng)業(yè)公司Evonetix已經(jīng)開發(fā)出一種獨特的硅芯片，可以并行進行大規(guī)模的DNA合成。Evonetix并不是在物理分離井中創(chuàng)建不同的鏈，而是使用熱工程來獨立控制每個反應(yīng)位點合成鏈的順序。通過控制每個反應(yīng)位點的溫度，DNA的生長鏈被選擇性地脫保護，為DNA序列添加新堿基做準備。由于四種堿基（A、C、G、T）的試劑依次引入，控制熱脫保護的時間使得在每個反應(yīng)位點合成不同的序列。由于硅芯片能夠精確和獨立地控制各個反應(yīng)位點的溫度，可以在將任何有錯誤的鏈并入雙鏈DNA之前檢測并移除它們?？梢酝ㄟ^了解退火DNA鏈的熔化溫度和序列錯誤引起的溫度變化來實現(xiàn)這一點。這節(jié)省了搜索和組裝無錯DNA所需的工作。通過從短鏈組裝長的、雙

鏈的DNA，能夠在組裝過程的每一步測試準確性，從而防止錯誤污染最終產(chǎn)品。獨特的二元組裝過程是革命性DNA制造方法的核心。目前集成電路工藝技術(shù)已經(jīng)突破10 nm，這為進一步大幅度提高微陣列DNA合成的通量提供了技術(shù)基礎(chǔ)。對于DNA微陣列的電致酸合成方法，主要瓶頸是每個微小電極之間H+相互串?dāng)_，通過優(yōu)化適用于DNA芯片的微電極以及相關(guān)微流控通道材料、工藝和結(jié)構(gòu)設(shè)計，在微納尺度上高效準確地調(diào)控微小電極上的氫離子輸運?？紤]到目前半導(dǎo)體集成電路芯片結(jié)構(gòu)和材料等改進，人們正在克服電極之間酸性液體的串?dāng)_效應(yīng)，電致酸技術(shù)的合成通量預(yù)計將能夠大幅度提高?？梢灶A(yù)測，電致酸合成方法有可能在現(xiàn)有基礎(chǔ)上把DNA的合成通量進一步提高103量級。通過計算機自動化微流控技術(shù)，優(yōu)化合成過程中相關(guān)化學(xué)反應(yīng)過程，阻止過量的液相試劑進入芯片，減少每一步反應(yīng)中試劑純化步驟等［14，62，65，108-111］。目前我國在高通量DNA合成方面也有突破，泓迅科技Syno?3.0平臺采用精準的電化學(xué)技術(shù)，可在一張半導(dǎo)體芯片上一次性合成上萬甚至十萬條引物。通過創(chuàng)新性的合成流程設(shè)計及質(zhì)量管理確?？梢蕴峁└哔|(zhì)量的DNA片段（包括引物、元件以及基因），實現(xiàn)全基因合成、通路合成、基因組合成、核苷酸池以及各種突變庫的合成。對于CMOS芯片的電致酸DNA原位化學(xué)合成技術(shù)而言，目前仍然存在著“邊緣效應(yīng)”引起的離子串?dāng)_等問題，包括反應(yīng)液滴未對準、試劑封閉不力和光控系統(tǒng)中光束偏移導(dǎo)致不精確的脫保護反應(yīng)，使鄰近區(qū)域的寡核苷酸序列產(chǎn)生堿基錯誤。通過對芯片設(shè)計的改進可以提高微陣列寡核苷酸的保真度，此外新型微電極材料和結(jié)構(gòu)設(shè)計的運用，也能夠很好地解決芯片上微電極間氫離子串?dāng)_問題，從而進一步提高DNA合成通量和速度?？梢灶A(yù)計通過采用100 nm以下的集成電路工藝，單片DNA合成通量有望達到1012堿基，實現(xiàn)TB級的DNA快速低成本合成。