超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定茶葉中的百草枯

劉相真，石琳，王靜，葉美君

（中華全國供銷合作總社杭州茶葉研究院，浙江杭州310016）

百草枯（Paraqua）是一種速效觸殺型滅生性季銨鹽類除草劑，具有廣譜速效和觸殺作用，對綠色植物有很強的破壞作用，并且具有在土壤催化下快速失活的特點，失活后無毒素殘留，對環(huán)境影響極小[1]，在農(nóng)業(yè)中被廣泛推廣使用。目前，百草枯的使用遍及全世界100多個國家和地區(qū)[2]。但是如不按照指導(dǎo)使用，百草枯對人畜有很強的毒性[3]，且無特效解毒藥，是導(dǎo)致人類急性中毒死亡率很高的除草劑[4]。由于百草枯具有高毒性和廣泛使用性的特點，因此建立一種快速、高效、高靈敏度的檢測方法至關(guān)重要。

目前，百草枯的檢測方法主要有氣相色譜（GC）[5]或氣相色譜-質(zhì)譜法（GC-MS）[6-7]、高效液相色譜法（HPLC）[8-11]或高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用法（HPLC-MS/MS）[12-14]、分光光度法（UV）[15-16]等方法[17-18]。氣相色譜或氣相色譜-質(zhì)譜法具有分離效果好、靈敏度高、選擇性強等優(yōu)點，是分析檢測中較常用的方法，但在百草枯檢測中存在極性強、難以汽化需衍生以及前處理操作復(fù)雜等問題；高效液相色譜法是百草枯檢測的常用方法，一般用反相色譜柱或親水性色譜柱分離，可保留堿性化合物、無需使用離子對試劑，但存在靈敏度不高，對本底復(fù)雜樣品定性不準(zhǔn)等問題；超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)作為近年來得到廣泛應(yīng)用的技術(shù)，具有高選擇性、高靈敏度和痕量檢測等特點，成為檢測分析的重要技術(shù)。

百草枯為強極性化合物，極易溶于水，采用水浸法提取效率高；在酸性、中性溶液中穩(wěn)定，在堿性溶液中易分解，提取液中加入一定量的酸，可防止百草枯的降解。現(xiàn)有文獻(xiàn)報道主要針對生物樣本（血液或尿）、環(huán)境樣品（水或土壤）及蔬菜水果，而茶葉基體復(fù)雜，含有大量酚類、糖類及生物堿，對質(zhì)譜的霧化電離有著較大的抑制作用。試驗基于超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法，在SN/T 0293—2014《出口植源性食品中百草枯和敵百快殘留量的測定液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法》方法的基礎(chǔ)上，針對茶葉樣品，進(jìn)一步優(yōu)化前處理、色譜條件等，建立了一種準(zhǔn)確、快速、高靈敏度的測定方法，且測定結(jié)果滿足各項質(zhì)控要求。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

市售茶葉樣品紅茶、綠茶、普洱茶和烏龍茶，茶葉磨碎樣品按照GB/T 8303—2013制備。

1.2 儀器與試劑

UPLC/TSQ Quantum Access MAX超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀 （美國Thermo Fisher-scientific公司）；分析天平（感量0.0001 g，瑞士Mettle Tolede公司）；FJ-12固相萃取裝置（上海京孚儀器有限公司）；SC-3610低速離心機（安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司）；漩渦混合器（海門其林貝爾儀器制造有限公司）。

甲醇（色譜純，美國Tedia公司）；甲酸銨和乙酸銨（色譜純，美國Fluka公司）；甲酸和37%鹽酸 （色譜純，德國Merck公司）；百草枯標(biāo)準(zhǔn)品（100μg/mL，AccuStandard，Inc）；200 mg/3 mL C18SPE Cartrideg（島津技邇商貿(mào)有限公司）；60 mg/3 mL WondaSepWCX固相萃取柱（島津（上海）實驗器材有限公司）；60 mg/3 mL Poly-sery MCX固相萃取柱（ANPEL Laboratory Technologies（Shanghai）Inc）；60 mg/3 mL Poly-sery HLB固 相 萃 取 柱（ANPEL Laboratory Technologies（Shanghai）Inc）。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確移取1 mL百草枯標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇溶解并配制成質(zhì)量濃度為10μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，于4℃冰箱中避光保存。使用時，用甲醇-水-甲酸溶液（29∶70∶1，V/V/V，含0.5 mol/L甲酸銨）逐級稀釋成5、10、25、50、100、200μg/L標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。

1.4 樣品前處理

1.4.1 提取

稱取磨碎茶樣5.0 g（精確至0.001 g）置于50 mL具塞聚乙烯離心管中，加入20 mL甲醇-0.1 mol/L鹽酸溶液 （3∶7，V/V）， 旋渦提取1 min后，再超聲提取15 min，以4200 r/min離心5 min，取上清液至50 mL容量瓶中，殘留物繼續(xù)加入20 mL甲醇-0.1 mol/L鹽酸溶液（3∶7，V/V）重復(fù)提取一次，合并兩次提取液于同一容量瓶中，并用水定容至刻度，搖勻，待凈化。

1.4.2 凈化

移取10 mL提取液過預(yù)活化后的MCX強陽離子固相萃取柱，棄去流出液；分別用2 mL水、乙腈-甲酸溶液（99∶1，V/V）和甲醇淋洗，然后置于SPE固相萃取裝置-真空泵系統(tǒng)中，將殘留的試劑抽干。 最后用3 mL甲醇-水-甲酸溶液（29∶70∶1，V/V/V，含0.5 mol/L甲酸銨）洗脫，收集洗脫液于5 mL塑料離心管中，旋渦混勻后，過0.22μm有機濾膜，待測。

1.5 儀器條件

1.5.1 色譜條件

色譜柱為Thermo SyncronisTMHILIC（100 mm×2.1 mm，1.7μm，賽默飛世爾科技）；流動相A為0.2%甲酸水溶液（含50 mmol/L甲酸銨），流動相B為甲醇，梯度洗脫條件見表1；柱溫40℃；進(jìn)樣量2.0μL。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Program of the gradient elution

1.5.2質(zhì)譜條件

電離模式：電噴霧離子化（ESI）；電離源極性：正模式；霧化氣：N2；離子噴霧電壓：4000 V；霧化室溫度120℃；離子傳輸管溫度380℃；碰撞氣：Ar，0.12 Pa；掃描模式為SRM多反應(yīng)監(jiān)測掃描，掃描時間段為3.5~5.5 min。質(zhì)譜參數(shù)見表2。

表2 百草枯的質(zhì)譜參數(shù)Table 2 MS/MS parameters for paraqua

2 結(jié)果與分析

2.1 前處理條件優(yōu)化

2.1.1 提取溶劑的選擇

百草枯極易溶于水，用純水、0.1 mol/L鹽酸溶液、甲醇-0.1 mol/L鹽酸以及甲醇對茶葉中的百草枯進(jìn)行提取，發(fā)現(xiàn)單獨用純水、0.1 mol/L鹽酸溶液、甲醇對茶葉中百草枯的提取率不高，通過在鹽酸溶液加入一定比例的甲醇可以顯著提高提取率。分別對純水、0.1 mol/L鹽酸溶液、甲醇以及不同比例的甲醇-0.1 mol/L鹽酸溶液 （1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5，V/V）的提取效率進(jìn)行了比較，結(jié)果如圖1所示。甲醇-0.1 mol/L鹽酸溶液（3∶7）提取回收率最高，為96%，故選為試驗的提取試劑。

圖1 不同提取試劑對茶葉中百草枯的回收率比較Fig.1 Comparison of recoveries with different extraction reagents for paraquat in tea

2.1.2 凈化方式的選擇

百草枯在酸性溶液中主要以離子形式存在，可采用離子交換固相柱凈化。試驗對C18（疏水性反相硅膠基質(zhì)吸附柱）、HLB（親水性反相吸附柱）、MCX（強陽離子交換柱）和WCX（弱陽離子交換柱）的凈化效果進(jìn)行了比較。發(fā)現(xiàn)用C18和HLB凈化，茶葉中的茶多酚、咖啡堿及色素等均無法除去，雜質(zhì)較多，影響質(zhì)譜檢測的靈敏度，檢出限為0.1μg/mL，無法滿足質(zhì)控的需要；用WCX凈化，在過柱前需用1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)提取液pH值至7.0±0.1，茶葉提取液會產(chǎn)生絮狀沉淀影響過柱效果，百草枯回收率較低，特別在低濃度時，0.01、0.05μg/mL的回收率分別僅有32%和60%，造成該結(jié)果的原因可能是加入NaOH溶液打破了原有提取液的電解質(zhì)平衡，在離子效應(yīng)、電解質(zhì)作用和共沉效應(yīng)等共同作用下，茶多酚、氨基酸、糖類等聚合成大分子物質(zhì)形成絡(luò)合物而沉淀，影響百草枯的回收率。

由于百草枯的pKa大于10，MCX柱在酸性條件下對百草枯有很強的相互作用力，可以直接在酸性條件下直接過柱，無需調(diào)節(jié)pH值，并且可以用水、甲醇、乙腈-甲酸溶液（98∶2，V/V）或氨水-甲醇（5∶95，V/V）、氨水-乙腈（5∶95，V/V）淋洗柱子去除茶多酚、咖啡堿、糖類及色素等雜質(zhì)，且不會造成百草枯的損失，達(dá)到較好的凈化效果；采用離子強度更大的甲醇-水-甲酸溶液洗脫，洗脫強度隨著甲酸銨緩沖液的濃度增大而增大，洗脫體積隨之減少，但考慮高濃度的鹽易造成色譜柱堵塞和對質(zhì)譜離子化效果的減弱，試驗采用甲醇-水-甲酸溶液（29∶70∶1，V/V/V，含0.5 mol/L甲酸銨）實現(xiàn)了較完全洗脫，其洗脫效果如圖2所示。

圖2 百草枯標(biāo)準(zhǔn)溶液在MCX小柱上的洗脫曲線Fig.2 Elution curve of paraquat on MCX column

2.2 檢測條件優(yōu)化

2.2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

根據(jù)百草枯的結(jié)構(gòu)特征，采用ESI+模式。用10μg/mL百草枯的單體標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行質(zhì)譜條件優(yōu)化，選擇準(zhǔn)分子離子[M+H]+作為母離子，進(jìn)行MRM模式優(yōu)化各質(zhì)譜參數(shù)（包括碰撞能量、透鏡補償電壓等），以獲得穩(wěn)定性好、信號強度高的碎片離子。100 ng/mL的百草枯提取色譜圖、空白茶葉樣品提取色譜圖和茶葉樣品中添加0.3 mg/kg的百草枯提取色譜圖如圖3所示。

圖3 百草枯的質(zhì)譜圖Fig.3 MRM chromatograms of paraquat

2.2.2 色譜柱的選擇

由于百草枯極性較強，在反相色譜柱上的保留時間極短，難以與干擾物有效分離。實驗選用Thermo SyncronisTMHILIC色譜柱進(jìn)行分析，能夠有效實現(xiàn)百草枯的保留以及與干擾物的分離。

2.2.3 流動相的選擇

試驗考察了有機相乙腈與水相中不同pH值的甲酸水溶液和不同濃度的甲酸銨對百草枯的分離效果的影響，結(jié)果表明，水相中不同濃度的甲酸銨含有的甲酸濃度低于0.2%時，峰型裂峰或拖尾，并且檢測靈敏度低；在水相中添加0.2%甲酸時，百草枯的靈敏度高，分離效果滿意。可能因為在正離子模式下，酸性能夠促進(jìn)化合物的離子化，提高化合物的離子化效率和靈敏度。

試驗在0.2%的甲酸水溶液的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步添加不同濃度的甲酸銨。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在一定范圍內(nèi)，隨著甲酸銨濃度的升高，峰寬變窄，峰高升高，信噪比增大，靈敏度提高，峰型對稱性變得更好。當(dāng)甲酸銨濃度大于50 mmol/L時，靈敏度無明顯提升，但高濃度的甲酸銨會造成泵的損壞、色譜柱和管路系統(tǒng)的堵塞。因此，實驗選擇甲醇0.2%甲酸-甲醇溶液（含50 mmol/L甲酸銨）作為流動相。

2.3 方法驗證

2.3.1 線性關(guān)系和方法檢出限

按“1.3標(biāo)準(zhǔn)溶液配制”和“1.5儀器條件”進(jìn)行測定，根據(jù)3倍信噪比（S/N）確定百草枯的檢出限為3μg/kg，10倍信噪比（S/N）確定百草枯的定量限為10μg/kg。百草枯在標(biāo)準(zhǔn)系列范圍內(nèi)峰面積與樣液濃度呈線性相關(guān)，百草枯的計算回歸方程為y=0.0197x-0.0179，R2=0.9994，線性關(guān)系良好。

圖4 百草枯的標(biāo)準(zhǔn)曲線（0.005~0.200μg/mL）Fig.4 Standard curve for paraquat（0.005~0.200μg/mL）

2.3.2 準(zhǔn)確度和精密度

選取市售綠茶、紅茶、普洱茶、烏龍茶樣品，分別作空白及添加相當(dāng)于定量限、2倍定量限及0.2 mg/kg的標(biāo)準(zhǔn)品，按上述方法進(jìn)行分析檢測，采用標(biāo)準(zhǔn)工作曲線外標(biāo)法定量，每個加標(biāo)水平平行測試6次，加標(biāo)回收率與精密度如表4所示。結(jié)果顯示，方法的回收率為81.4%~93.5%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.1%~5.6%，其準(zhǔn)確度與精密度均能滿足茶葉中百草枯檢測的要求。

表4 茶葉中百草枯的加標(biāo)回收率和精密度Table 4 Recoveries and relative standard deviations(RSDs)of paraquat in tea

2.3.3 基質(zhì)效應(yīng)

為考察茶葉的基質(zhì)效應(yīng)，以空白綠茶、紅茶、普洱茶、烏龍茶為基體，按照1.4所述方法進(jìn)行前處理，用收集的基質(zhì)配置標(biāo)準(zhǔn)系列溶液制成標(biāo)準(zhǔn)曲線，與以無基質(zhì)配制的標(biāo)準(zhǔn)曲線作對比。結(jié)果顯示，以空白綠茶、紅茶、普洱茶、烏龍茶為基質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率與無基質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率的比值分 別 為1.03、1.12、1.05、1.08， 其 斜 率 比 值 均 在0.8~1.2之間，認(rèn)為基質(zhì)效應(yīng)較低[19]，故文章采用甲醇-水-甲酸溶液（29∶70∶1，V/V/V，含0.5 mol/L甲酸銨）配制的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量。

3 結(jié)論

茶葉中的化學(xué)成分復(fù)雜，含有色素類、生物堿、多酚類等物質(zhì)會干擾樣品的檢測，對檢測結(jié)果造成影響。文章根據(jù)MCX柱填料與百草枯具有很強的相互作用力，采用在酸性條件下，提取后直接過柱，用水、乙腈-甲酸溶液和甲醇淋洗柱子去除大部分色素、多酚等物質(zhì)后，用甲醇-水-甲酸溶液（含0.5 mol/L甲酸銨）洗脫，操作簡便、凈化效果好，且準(zhǔn)確度與精確度均能滿足植物源性食品中農(nóng)藥殘留檢測的需要，可作為農(nóng)藥殘留分析的日常檢測方法。