甘蔗丙二烯氧化物環(huán)化酶基因（ScAOC）的克隆與表達(dá)分析

薛耀威 陳麗蘭 王亞如 高三基 王錦達(dá)

摘 ?要：丙二烯氧化物環(huán)化酶（allene oxide cyclase，AOC）是茉莉酸合成途徑的一個(gè)關(guān)鍵酶，在植物防御反應(yīng)中起著重要的作用。本研究基于甘蔗轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)克隆到一個(gè)AOC基因，命名為ScAOC，并對(duì)其進(jìn)行生物學(xué)分析、組織特異性分析和逆境脅迫下的表達(dá)分析，以初步了解該基因的功能。甘蔗ScAOC基因的開(kāi)放閱讀框（ORF）為744 bp，編碼244個(gè)氨基酸，其蛋白分子質(zhì)量是26.37 kDa。生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示，ScAOC蛋白屬于不穩(wěn)定堿性親水蛋白，含有1個(gè)Allene_ox_cyc Superfamily的PLN02343 domain的保守結(jié)構(gòu)域;構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果顯示ScAOC蛋白與高粱的蛋白具有較高的同源性。熒光定量PCR結(jié)果顯示，ScAOC基因在甘蔗的根、莖、葉中均有表達(dá)，表達(dá)量從高到低依次是葉、根、莖。在PEG、NaCl及外源MeJA脅迫下，ScAOC基因相對(duì)表達(dá)量都是先上升后下降，而ABA對(duì)ScAOC的表達(dá)有一定的抑制作用。在病原菌和粘蟲(chóng)取食的脅迫下，ScAOC基因相對(duì)表達(dá)量顯著上升。結(jié)果顯示ScAOC可能參與甘蔗對(duì)生物或非生物脅迫的防御反應(yīng)。

關(guān)鍵詞：甘蔗;丙二烯氧化物環(huán)化酶;茉莉酸;生物信息學(xué)分析

中圖分類(lèi)號(hào)：S566.1 ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

Abstract： Allene oxide cyclase （AOC） is a key enzyme in the synthesis pathway of jasmonic acid and plays an important role in plant defense reactions. In this study， an AOC gene was cloned based on the sugarcane transcriptome database and named ScAOC. Biological analysis， tissue-specific analysis， and expression analysis under stress were conducted to understand the preliminary function of the gene. The open reading frame （ORF） of the ScAOC gene in sugarcane was 744 bp， encoding 244 amino acids， and its protein molecular mass was 26.37 kDa. Bioinformatics analysis showed that the ScAOC protein was an unstable basic hydrophilic protein and contained a conserved domain of the PLN02343 domain of Allene_ox_cyc Superfamily. Constructing a phylogenetic tree showed that the ScAOC protein has a high homology with sorghum protein. Fluorescence quantitative PCR showed that the ScAOC gene was expressed in the roots， stems and leaves of sugarcane， and the expression levels from high to low were leaves， roots and stems. Under the stress of PEG， NaCl and exogenous MeJA， the relative expression of ScAOC gene increased first and then decreased， and ABA had a certain inhibitory effect on the expression of ScAOC. Under the stress of pathogenic bacteria and armyworm feeding， the relative expression of ScAOC gene increased significantly. The results showed that ScAOC maight be involved in the defense response of sugarcane to biological or abiotic stress.

Keywords： sugarcane; allene oxide cyclase; jasmonic acid; bioinformatics analysis

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.05.007

甘蔗是我國(guó)最主要的糖料作物，甘蔗產(chǎn)糖占我國(guó)食糖總量的90%左右[1]，此外甘蔗也是重要潛在的能源作物，因此甘蔗的優(yōu)質(zhì)高效生產(chǎn)是事關(guān)國(guó)計(jì)民生的大事。甘蔗屬于多年生作物，生產(chǎn)周期較長(zhǎng)，且長(zhǎng)期連作，經(jīng)常受到各種不良環(huán)境的威脅，導(dǎo)致甘蔗產(chǎn)量降低，蔗汁品質(zhì)下降。而目前田間管理上多通過(guò)噴施化學(xué)肥料和農(nóng)藥的方法，提高甘蔗抵御外界各種脅迫。地球資源短缺，環(huán)境惡化，環(huán)境保護(hù)和食品安全的重要性日益突顯，未來(lái)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)勢(shì)必向無(wú)毒、綠色環(huán)保的方向發(fā)展。選育和利用抗逆品種，是目前公認(rèn)提高農(nóng)作物抗逆性最根本、經(jīng)濟(jì)有效且對(duì)環(huán)境影響最小的辦法。利用品種對(duì)外界環(huán)境的不敏感性，提升農(nóng)作物對(duì)各種生物脅迫的忍受能力，并降低各種有害生物的生存適合度，不但有利于農(nóng)作物抵抗外界不良脅迫，也有利于減少環(huán)境污染，維持生態(tài)系統(tǒng)的平衡。

茉莉酸類(lèi)化合物（Jasmonates，JAs）是一類(lèi)基本的植物激素，作為植物體內(nèi)的一種內(nèi)源性調(diào)節(jié)物質(zhì)，在植物的生長(zhǎng)過(guò)程中有十分重要的作用。一方面JAs可通過(guò)調(diào)節(jié)植物的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程，如種子萌發(fā)[2]、器官發(fā)育[3]和衰老死亡[4]等;另一方面JAs還可參與植物的生物脅迫和非生物脅迫[5]，如逆境脅迫[6]、病原菌侵?jǐn)_[7]等過(guò)程。在植物體內(nèi)JAs通過(guò)亞麻酸或亞油酸為底物經(jīng)過(guò)各種酶促反應(yīng)合成[8]。其中丙二烯氧化物環(huán)化酶（allene oxide cyclase，AOC）基因是茉莉酸生物合成途徑中的一個(gè)關(guān)鍵酶基因，能夠通過(guò)特異性地催化丙二烯氧化物[12，13（s）-epoxy-（9Z，11E，15Z）-octade-catrienoic acid， 12，13-EOT]形成茉莉酸產(chǎn)物的前體1，2-氧-植物二烯酸[12-oxo-phytodienoic acid，OPDA][9]，其活性在中間產(chǎn)物轉(zhuǎn)化為茉莉酸的過(guò)程中起重要作用[10]。已有研究顯示，AOC可通過(guò)提高表達(dá)促進(jìn)JAs的形成，提高植物抵抗外界不良環(huán)境脅迫的能力。因此分離AOC基因并分析其表達(dá)規(guī)律對(duì)于研究該基因在植物生長(zhǎng)發(fā)育和抵御外界脅迫的過(guò)程中的作用具有重要的意義。自2000年首個(gè)AOC基因在番茄中克隆報(bào)道以來(lái)[11]，該基因已經(jīng)在玉米[12]、擬南芥[13]等多種植物中克隆得到，并對(duì)其進(jìn)行了相關(guān)功能研究。而目前尚未有甘蔗中AOC基因的研究報(bào)道，因此對(duì)甘蔗AOC基因進(jìn)行全長(zhǎng)克隆分析，并研究在外界生物脅迫和非生物脅迫下AOC基因的表達(dá)規(guī)律，為揭示AOC基因在甘蔗茉莉酸生物合成過(guò)程中的作用以及分析甘蔗的生長(zhǎng)發(fā)育和防御反應(yīng)的分子機(jī)理提供科學(xué)依據(jù)。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

1.1.1 ?材料及處理 ?本實(shí)驗(yàn)采用由福建農(nóng)林大學(xué)國(guó)家甘蔗工程技術(shù)研究中心提供的新臺(tái)糖22號(hào)（ROC22）甘蔗品種。采集新鮮的根莖葉，提取總RNA，檢測(cè)ScAOC基因在不同部位以及逆境脅迫下的表達(dá)差異。從蔗田挑選漲勢(shì)健壯一致的甘蔗種莖切斷，然后進(jìn)行30 min溫水（52 ℃，含1 g/L多菌靈）脫毒處理，然后放入培養(yǎng)箱（30 ℃，光照16 h，濕度65%）中催芽，分別經(jīng)4種外源激素處理：0.1 mmol/L的ABA處理0、12、24 h （CK、ABA-12 h、ABA-24 h）;25% PEG6000干旱處理0、6、12 h（CK、PEG-6 h、PEG-12 h）;250 mmol/L的高鹽（NaCl）脅迫處理0、12、24 h（CK、NaCl-12 h、NaCl-24 h）;100 ?mol/L的茉莉酸甲酯（MeJA）處理0、12、24 h（CK、MeJA- 12 h、MeJA-24 h）。2種生物脅迫：赤條菌（Acidovorax avenae subsp. avenae，Aaa）處理0、24、48 h（CK、Aaa-24 h、Aaa-48 h）;粘蟲(chóng)取食（Insect）處理0、12、24 h（CK、Insect-12 h、Insect-24 h）。然后提取RNA檢測(cè)ScAOC基因在不同脅迫下的表達(dá)差異性。

1.1.2 ?試劑 ?實(shí)驗(yàn)所用主要試劑：PrimeScript? RT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa，中國(guó)，大連）、TRIzol Reagent（Invitrogen，美國(guó)，卡爾斯巴德）、Gel Extraction Kit（天根生化科技有限公司，中國(guó)，北京），基因克隆載體pEASY-Blunt Zero Cloning Kit載體（全式金，中國(guó)，北京）、基因克隆試劑Prime-STAR? GXL Premix Kit（TaKaRa，中國(guó)，大連）等。

1.2 ? 方法

1.2.1 ?RNA提取 ?按照TRIzol Reagent RNA提取試劑盒的操作步驟對(duì)各處理材料進(jìn)行RNA的提取，利用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性，保存于–80 ℃超低溫冰箱。將RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，參照PrimeScript? RT reagent Kit with gDNA Eraser反轉(zhuǎn)錄試劑盒的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，并保存于–80 ℃超低溫冰箱。

1.2.2 ?ScAOC基因的引物設(shè)計(jì)與克隆 ?根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室測(cè)序得到的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)（未發(fā)表）篩選到甘蔗ScAOC的unigene序列，通過(guò)在線(xiàn)軟件Primer 5.0進(jìn)行基因特異性克隆引物的設(shè)計(jì)（表1）。將cDNA作為目的基因的克隆模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，將得到的目的片段經(jīng)回收、連接和克隆后經(jīng)過(guò)挑單菌落菌液PCR檢測(cè)，最后送福州博尚測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.3 ?ScAOC的生物信息學(xué)分析 ?利用NCBI的ORF Finder在線(xiàn)程序分析測(cè)序獲得的目的基因核酸序列的開(kāi)放閱讀框（open reading frame， ORF）;利用NCBI的Conserved domains database （CDD）數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)基因蛋白進(jìn)行結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè);利用在線(xiàn)軟件Protparam、GOR IV、SWISS MODEL對(duì)基因蛋白進(jìn)行一級(jí)結(jié)構(gòu)、二級(jí)結(jié)構(gòu)、三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè);利用DNAMAN軟件對(duì)7個(gè)物種的AOC基因進(jìn)行多序列比對(duì)，通過(guò)NPS的proscan（https：//npsa- pra-bi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=/NPSA/npsa_proscan.html）對(duì)ScAOC進(jìn)行活性位點(diǎn)預(yù)測(cè);利用MEGA對(duì)基因蛋白進(jìn)行進(jìn)化樹(shù)分析。

1.2.4 ?ScAOC基因在不同組織和不同脅迫下的表達(dá)分析 ?采用SYBR Green染料法，分析ScAOC在根、莖、葉中的表達(dá)特異性及在不同脅迫下的表達(dá)差異。以磷酸甘油醛脫氫酶（reduced glyceral-dehyde-phosphate dchydrogenase，GAPDH）為內(nèi)參基因[14-15]。每個(gè)樣品以無(wú)菌水為對(duì)照，設(shè)置3次重復(fù)。基因相對(duì)表達(dá)量計(jì)算采用2-ΔΔCT算法，基因的相對(duì)表達(dá)量為扣除0 h對(duì)照組的基因相對(duì)表達(dá)水平。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?ScAOC基因的鑒定及序列分析

本研究克隆了ScAOC基因的全長(zhǎng)，該序列包括744 bp的開(kāi)放閱讀框（圖1），編碼244個(gè)氨基酸，GenBank號(hào)為：MK784561。通過(guò)對(duì)ScAOC進(jìn)行一級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示該基因編碼蛋白的理論相對(duì)分子量為26.37 kDa，理論等電點(diǎn)為9.45，不穩(wěn)定系數(shù)為45.06，平均疏水性為–0.250，脂肪系數(shù)（AI）為80.45（表2）。推測(cè)ScAOC屬于不穩(wěn)定堿性親水蛋白。

ScAOC基因二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果表明（表3），該二級(jí)結(jié)構(gòu)主要為無(wú)規(guī)則卷曲，占比為54.10%;其次為23.77%的α-螺旋和22.13%的延伸鏈，不含β-螺旋結(jié)構(gòu)。

SWISS MODEL的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示（圖2A），ScAOC基因三級(jí)結(jié)構(gòu)元件主要是無(wú)規(guī)則卷曲。且ScAOC主要含有一個(gè)Allene_ox_cyc Superfamily的PLN02343 domain的保守結(jié)構(gòu)域（圖2B）。

2.2 ?ScAOC蛋白序列分析及系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建

使用DNAMAN軟件對(duì)7個(gè)物種的AOC蛋白序列進(jìn)行多序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)（圖3），這些AOC蛋白中包含8個(gè)高度保守的β延伸鏈結(jié)構(gòu)。進(jìn)一步通過(guò)NPS（Network Protein Sequence Analysis）對(duì)ScAOC進(jìn)行活性位點(diǎn)預(yù)測(cè)，結(jié)果表明ScAOC蛋白有6個(gè)活性位點(diǎn)，為N-糖基化位點(diǎn)、蛋白酶C磷酸化位點(diǎn)、酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點(diǎn)、N-十四?；稽c(diǎn)、酪氨酸激酶磷酸化位點(diǎn)、酰胺化位點(diǎn)。

將ScAOC與其他22種植物的AOC基因的氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果顯示單子葉植物的AOC蛋白相對(duì)雙子葉植物獨(dú)立于一簇，且甘蔗ScAOC蛋白與高粱在同一個(gè)小分支上，親緣關(guān)系最近（圖4）。

2.3 ?ScAOC基因在甘蔗不同組織部位的表達(dá)分析

通過(guò)熒光定量PCR分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ScAOC基因在甘蔗的根、莖、葉中均有表達(dá)。表達(dá)量從高到低依次是葉、根、莖，其中ScAOC在葉中的表達(dá)量是莖的1.31倍，且表達(dá)差異不顯著（圖5）。

2.4 ?ScAOC基因在不同脅迫下的表達(dá)分析

2.4.1 ?非生物脅迫下ScAOC的相對(duì)表達(dá)量 ?從圖6可知，在4種非生物脅迫處理下，ABA處理后ScAOC出現(xiàn)先下降后上升變化，而其他3種處理則出現(xiàn)相反趨勢(shì)。其中在ABA處理下ScAOC的表達(dá)量變化幅度不大，甚至在12 h時(shí)下降到對(duì)照組的0.82倍，24 h時(shí)表達(dá)量上升到對(duì)照組的

1.47倍;而在25%的PEG6000干旱處理下其表達(dá)水平迅速上調(diào)，在6、12 h時(shí)分別達(dá)到了對(duì)照組的6.17、4.64倍;在NaCl脅迫下，在12、24 h時(shí)分別達(dá)到了對(duì)照組的3.96、2.63倍;在100 ?mol/L的MeJA處理下，組織相對(duì)表達(dá)量在12、24 h時(shí)分別達(dá)到了對(duì)照組的1.93、1.84倍，且差異顯著。

2.4.2 ?生物脅迫下ScAOC的相對(duì)表達(dá)量 ?通過(guò)接種病原菌和粘蟲(chóng)取食2種生物脅迫，ScAOC的表達(dá)量呈現(xiàn)相同上升趨勢(shì)。其中病原菌脅迫處理24、48 h時(shí)ScAOC的表達(dá)量分別達(dá)到了對(duì)照組的2.09、2.34倍;粘蟲(chóng)取食12、24 h時(shí)ScAOC的表達(dá)量分別達(dá)到了對(duì)照組的2.5、4.0倍（圖7）。

3 ?討論

茉莉酸廣泛存在于植物的幼嫩組織和發(fā)育的生殖器官中[16]，是一種通過(guò)韌皮部篩管長(zhǎng)距離運(yùn)輸?shù)男盘?hào)物質(zhì)[17]，在植物體內(nèi)充當(dāng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，調(diào)節(jié)植物的生長(zhǎng)發(fā)育和應(yīng)激反應(yīng)[18]。本實(shí)驗(yàn)以甘蔗品種為新臺(tái)糖22號(hào)（ROC22）為模板，克隆并得到了甘蔗AOC基因，該基因全長(zhǎng)744 bp，編碼244個(gè)氨基酸。根據(jù)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)ScAOC基因含有1個(gè)保守的allene-ox-cyc結(jié)構(gòu)，聚類(lèi)分析表明該蛋白與玉米、高粱等植物的AOC具有較高的氨基酸序列度相似性。通過(guò)研究甘蔗中ScAOC基因的序列特征和表達(dá)特性，將為深入研究ScAOC在甘蔗中的作用奠定基礎(chǔ)。

研究發(fā)現(xiàn)，不同植物的AOC基因在不同組織部位的表達(dá)存在差異。如Stenzel等[19]發(fā)現(xiàn)在擬南芥葉片中，AtAOC1和AtAOC2具有較高的表達(dá)量，但是在花中AtAOC3表達(dá)量最高，在根中AtAOC4表達(dá)量較高;在曹晏彬等[20]發(fā)現(xiàn)在蘋(píng)果中MdAOC1基因在莖部高表達(dá);而劉曉慧等[21]發(fā)現(xiàn)在金魚(yú)草AmAOC在花中表達(dá)量最高，而在根中最低。本研究中我們發(fā)現(xiàn)ScAOC基因在甘蔗各部位均有表達(dá)，且在葉中的表達(dá)量最高。

大量研究顯示，AOC在植物對(duì)非生物脅迫的防御反應(yīng)中起著重要作用。在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，最常見(jiàn)的非生物脅迫有機(jī)械損傷、干旱、低溫、高鹽等。當(dāng)番茄收到機(jī)械損傷，可在其葉片上檢測(cè)到AOC基因表達(dá)量的升高[22];當(dāng)高鹽或低溫處理麻風(fēng)樹(shù)時(shí)，發(fā)現(xiàn)JaAOC表達(dá)量快速上升[23]。而本實(shí)驗(yàn)所研究的4種非生物脅迫，ScAOC對(duì)其均有應(yīng)答，其中在PEG脅迫下表達(dá)最迅速且相對(duì)表達(dá)量達(dá)到了4種脅迫中的最高值，為對(duì)照組的6.17倍，其次為NaCl脅迫。MeJA作為茉莉酸甲基化后的產(chǎn)物，參與了茉莉酸類(lèi)物質(zhì)的生物合成途徑，在植物抗蟲(chóng)抗病上的作用頗為顯著。在蘋(píng)果[20]、白木香[18]中發(fā)現(xiàn)噴施茉莉酸甲酯后，對(duì)應(yīng)的AOC基因表達(dá)量呈現(xiàn)先上升后下降趨勢(shì)，這與我們的研究結(jié)果一致，只是表達(dá)峰值出現(xiàn)在不同時(shí)間點(diǎn)，這也說(shuō)明了不同植物AOC基因?qū)υ摷に靥幚碛胁煌谋磉_(dá)模式。我們認(rèn)為外源刺激是短暫且非持久的，過(guò)多的JA積累觸發(fā)了植物體內(nèi)自我保護(hù)機(jī)制，從而抑制了植物體內(nèi)AOC基因的持續(xù)高表達(dá)。而在ABA處理12 h時(shí)的相對(duì)表達(dá)量為對(duì)照組的0.82倍，出現(xiàn)抑制表達(dá)情況，同樣在研究水稻OsAOC的表達(dá)量時(shí)發(fā)現(xiàn)ABA對(duì)其有明顯抑制[24]，植物體內(nèi)其他激素生物合成途徑對(duì)JA信號(hào)途徑的影響錯(cuò)綜復(fù)雜，具體機(jī)制目前尚不清楚。綜合我們的研究結(jié)果顯示，鹽、干旱等外界不良環(huán)境的脅迫可以改變ScAOC的表達(dá)，且多種激素參與AOC的表達(dá)調(diào)控，但是不同植物的調(diào)控過(guò)程和機(jī)理可能有所差異。

此外，AOC在植物防御生物脅迫的過(guò)程中也起著重要的作用。呂麗敏[25]等在甜菜夜蛾取食12 h后的棉花中檢測(cè)發(fā)現(xiàn)GhAOC表達(dá)量明顯上升，達(dá)到對(duì)照組的4.0倍，差異極顯著;而在番茄受棉鈴蟲(chóng)咬食的脅迫實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，番茄在被取食3 h時(shí)后體內(nèi)AOC表達(dá)水平達(dá)到頂峰，且JA類(lèi)物質(zhì)大量合成[26];此外JA類(lèi)信號(hào)物質(zhì)可以短時(shí)間內(nèi)在受傷植株的受傷部位以及未受傷部位大量合成，來(lái)應(yīng)對(duì)外界刺激如病原菌感染、昆蟲(chóng)取食等并做出快速響應(yīng)，產(chǎn)生信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，進(jìn)而調(diào)控植物的抗性[27-28]。本研究發(fā)現(xiàn)甘蔗在生物脅迫（粘蟲(chóng)取食和病原菌）下，體內(nèi)ScAOC基因表達(dá)水平均明顯提高。因此我們認(rèn)為甘蔗受到外界的生物脅迫下也能夠迅速通過(guò)AOC基因表達(dá)量的提高，合成JA類(lèi)物質(zhì)產(chǎn)生防御反應(yīng)，阻止外界病原和昆蟲(chóng)的進(jìn)一步取食以達(dá)到自我防御的作用。

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責(zé)任編輯：黃東杰