健脾化濕解毒方對急性肝損傷小鼠腸屏障功能的影響

姜婷婷 江宇泳 葉永安

摘要 目的：探討健脾解毒涼血方治療肝損傷腸屏障功能障礙的作用靶點。方法：選取C57BL/6雄性小鼠32只，隨機分為正常組、模型組、中藥組、培菲康組，腹腔注射硫代乙酰胺100 mg/kg造模;中藥組予以健脾解毒涼血方灌胃，培菲康組給予培菲康溶液灌胃;16 h后采集小鼠血清、肝組織、小腸組織，觀察小鼠肝功能、腸道組織HE染色變化，免疫組織化學(xué)染色方法觀察小腸閉鎖小帶蛋白-1表達。結(jié)果：模型組、中藥組、培菲康組小鼠的ALT、AST均顯著高于正常組，模型組、中藥組、培菲康組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。小腸組織在光鏡和電鏡下均可觀察到中藥組病變輕于模型組和培菲康組，免疫組織化學(xué)染色在小腸上皮細(xì)胞上可見閉鎖小帶蛋白-1棕黃色陽性標(biāo)記，模型組、中藥組、培菲康組陽性標(biāo)記均顯著少于正常組，中藥組陽性標(biāo)記顯著多于模型組（P<0.05）。結(jié)論：健脾解毒涼血方治療硫代乙酰胺誘導(dǎo)急性肝損傷小鼠，可維護腸上皮細(xì)胞緊密連接部閉鎖小帶蛋白-1表達，修復(fù)腸屏障功能。

關(guān)鍵詞 健脾解毒涼血方;硫代乙酰胺，肝損傷;腸屏障功能;閉鎖小帶蛋白-1;緊密連接蛋白;小鼠;腸道

Abstract Objective：To explore the target of Jianpi Jiedu Liangxue Formula in the treatment of intestinal barrier dysfunction in liver injury.Methods：A total of 32 male C57BL/6 mice were randomly divided into a normal group，a model group，a Chinese medicine group and a Peifikang group.Mouse liver injury model by intraperitoneal inject of thioacetamide 100 mg/kg was established.The mice in the traditional Chinese medicine group were given Jianpi Jiedu Liangxue Formula for gavage.The mice in the Peficon Kang group were given Pefikang solution.After16 hours，mice serum，liver tissue，and small intestinal tissue were collected.Liver function，intestinal HE histochemical changes，immunohistochemical staining method were observed the expression of ZO-1 protein in the small intestine.Results：The ALT and AST of the model group，the Chinese medicine group and the Peifikang group were significantly higher than those of the normal group（P>0.05）.There was no significant difference between the model group，the Chinese medicine group and the Peifikang group.Small intestinal tissue can be observed under light and electron microscopy.Immunohistochemical staining in the cell membrane of intestinal villus epithelial cells were visible on the zonula occludens protein-1 Brown positive marker.The positive markers of model group，Chinese medicine group and Peifikang group were significantly less than which of normal group.The positive marker of Chinese medicine group were significantly more than that of model group（P<0.05）.Conclusion：Jianpi Jiedu Liangxue Formula in the treatment of acute liver injury induced by thioacetamide can maintain the expression of zonula occludens protein-1 in the tight junction of intestinal epithelial cells and repair intestinal barrier function.

Keywords Jianpi Huashi Jiedu Formula; Thioacetamide; Liver injury; Small intestinal barrier function; Zonula occludens protein-1; Tight junction protein; Mice; Intestinal

中圖分類號：R289.5文獻標(biāo)識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.07.012

重癥肝病時腸道缺血、缺氧、循環(huán)障礙，腸黏膜淤血、水腫、糜爛，通透性增加;腸屏障功能受損導(dǎo)致大量內(nèi)毒素經(jīng)門靜脈進入肝臟，其誘導(dǎo)的一系列炎癥反應(yīng)加劇了肝損傷，并與自發(fā)性細(xì)菌性腹膜炎等并發(fā)癥密切相關(guān)[1-2]。在“見肝之病，知肝傳脾，當(dāng)先實脾”的中醫(yī)經(jīng)典理論指導(dǎo)下，我們以健脾化濕解毒法治療重癥肝病合并腸功能障礙取得較好的臨床效果。為探索中醫(yī)藥修復(fù)肝損傷并發(fā)腸屏障功能的作用靶點，以硫代乙酰胺（Thioacetamide，TAA）誘導(dǎo)的急性肝損傷小鼠模型，觀察健脾化濕解毒方對小鼠小腸組織、小腸上皮細(xì)胞閉鎖小帶蛋白-1（Zonula Occludens Proteins-1，ZO-1）表達的影響。

硫代乙酰胺是一種具有很強肝毒性的物質(zhì)，其活性代謝產(chǎn)物如磺胺-5-甲嘧啶、TAA硫二氧化物等共價結(jié)合于肝臟大分子，通過氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過氧化反應(yīng)導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷，誘導(dǎo)其壞死和凋亡。TAA誘導(dǎo)的急性肝損傷模型在形態(tài)學(xué)和致肝損傷機制方面與人類肝損傷相似，TAA 350 mg/kg腹腔注射制備大鼠急性肝衰竭模型，發(fā)現(xiàn)大鼠在出現(xiàn)急性肝衰竭變化的同時，還伴有腸壁黏膜上皮細(xì)胞壞死脫落，黏膜下層充血水腫，黏膜層炎癥細(xì)胞浸潤明顯[3];TAA誘導(dǎo)的肝損傷伴胃腸道損傷及腸源性內(nèi)毒素血癥[4-5]。這是一種典型的伴有胃腸道生物化學(xué)、組織結(jié)構(gòu)和功能改變的肝-腸損傷模型。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 清潔級野生型C57BL/6小鼠，雄性，8周齡，體質(zhì)量（20±1）g，購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院動物研究所，所有實驗動物均按照動物保護相關(guān)法規(guī)飼養(yǎng)于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院動物所無特定病原體（SPF）級動物室（許可證號：SCXK京2009-0007）。造模前飼養(yǎng)觀察室內(nèi)觀察1 d，各組分籠飼養(yǎng)，標(biāo)準(zhǔn)配方飼料喂養(yǎng)，自由進水，室溫10～20 ℃，相對濕度為30%～50%，光暗周期為12 h。

1.1.2 藥物 中藥購自北京衛(wèi)仁制藥廠，批號20140416，健脾解毒涼血方：黨參15 g、黃芪30 g、茵陳30 g、梔子15 g、生大黃10 g、黃芩15 g、黃連10 g、赤芍30 g、生地黃15 g，水煎濃縮至87 mL，濃度為1.9 g/mL，造模同時中藥灌胃1次。

1.1.3 試劑與儀器 硫代乙酰胺試劑（Sigma公司，德國，批號：20140107）;兔抗人ZO-1多克隆抗體（Merck-Millipore公司，美國，批號：AB2272）。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 將小鼠分4組：正常組，模型組，中藥組，培菲康組，每組8只。造模前禁食12 h，以TAA 100 mg/kg單次腹腔注射造模，正常組予以0.9%氯化鈉注射液單次腹腔注射。造模及治療后16 h處死，觀察肝功能、肝腸組織形態(tài)學(xué)和腸上皮細(xì)胞ZO-1表達。

1.2.2 干預(yù)方法 模型組小鼠造模后立即給予去離子水灌胃;中藥組小鼠造模后立即給予健脾解毒涼血方灌胃，培菲康組小鼠造模后立即給予培菲康溶液灌胃，灌胃后小鼠自由進水飲食。灌胃體積依小鼠體質(zhì)量而定，體質(zhì)量>22 g予以270 μL灌胃、體質(zhì)量<18 g予以230 μL灌胃、體質(zhì)量18～22 g予以250 μL灌胃。

1.2.3 檢測指標(biāo)與方法 造模后16 h摘取小鼠眼球取外周血，離心后進行血漿谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）和谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）檢測。取血后立即斷頸處死小鼠，迅速取肝左葉0.8 cm×0.5 cm×0.3 cm大小肝組織、十二指腸下約2 cm處約2 cm長的空腸段，置10%中性甲醛溶液固定，24 h后逐級乙醇脫水，二甲苯透明，56 ℃石蠟包埋，4 μm厚切片，用于HE染色和ZO-1免疫組織化學(xué)染色。在每組8只小鼠中隨機選取3只留取小腸標(biāo)本，每只取l塊長約l cm的小腸組織用2.5%戊二醛固定2 h，二甲砷酸鈉緩沖液漂洗3～4遍，1%鋨酸固定2 h，丙酮梯度脫水，Epon812環(huán)氧樹脂浸透包埋。聚合72 h（35 ℃、45 ℃，60 ℃各24 h），LKB-V超薄切片機連續(xù)切片，厚度為60～80 nm，采用醋酸鈾、檸檬酸鉛雙重染色，在透射電鏡下觀察。

ZO-1免疫組織化學(xué)染色陽性細(xì)胞計數(shù)判定在200倍顯微鏡下分別對每張組織切片的腸上皮細(xì)胞內(nèi)的ZO-1陽性信號進行半定量評分：A為陽性細(xì)胞數(shù)分級：0級，<1%陽性信號;1級，1%～25%陽性信號;2級，26%～50%陽性信號;3級，51%～75%陽性信號;4級，>75%陽性信號。B為陽性細(xì)胞顯色強度分級：0（陰性），1（弱陽性），2（陽性），3（強陽性）。每張切片的染色積分（HIS）以這二者相乘的乘積數(shù)表示，即HIS=A×B。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料用單因素方差分析，方差齊性檢驗，分別采用LSD進行兩兩比較。等級資料采用非參數(shù)檢驗中的Krukal Wallis檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠血漿ALT和AST比較 與正常組比較，各造模小鼠均表現(xiàn)出進食減少，行動緩慢，活動減少。模型組、中藥組、培菲康組的ALT、AST均顯著高于正常組（P<0.05），模型組、中藥組、培菲康組組間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見表1。

2.2 小鼠肝組織病理結(jié)果

肉眼觀察：正常組小鼠肝臟色澤紅潤，大小適中，表面光滑邊緣銳利，質(zhì)軟而富有彈性。與正常組比較，模型組小鼠肝臟體積增大，呈深紅色，質(zhì)脆，表面淤血呈片狀。中藥觀察組肝臟顏色接近正常組小鼠，表面散在壞死灶，面積較模型組小，無明顯淤血。培菲康組肝臟體積增大，深紅色，表面淤血，質(zhì)地松脆。

肝組織切片HE染色光鏡下觀察：正常肝臟組織可見肝細(xì)胞排列整齊，肝小葉結(jié)構(gòu)完整，無變性、壞死及炎癥細(xì)胞浸潤。模型組肝組織可見顯著的肝細(xì)胞水腫，氣球樣變性，肝小葉中心壞死，伴大面積出血性改變和炎癥細(xì)胞浸潤。中藥組肝細(xì)胞水腫，氣球樣變性較輕，出血壞死面積較模型組小，匯管區(qū)少量炎癥細(xì)胞浸潤;培菲康組可見肝細(xì)胞凝固性壞死和空泡形成，肝小葉中心出血壞死，面積較大。

2.3 小鼠小腸組織光鏡下病理結(jié)果 正常空腸組織可見黏膜結(jié)構(gòu)完整，絨毛上皮無缺損，未見淋巴濾泡增生及炎癥細(xì)胞浸潤。模型組空腸組織可見黏膜上皮糜爛，絨毛樣結(jié)構(gòu)減少，絨毛倒伏，頂端大片壞死并脫落于腸腔內(nèi)，絨毛水腫，間隙明顯增寬，固有層大量炎癥細(xì)胞浸潤。中藥組可見腸黏膜絨毛略有水腫，絨毛間隙略寬，頂端有少量絨毛脫落，較少淋巴濾泡增生，較少炎癥細(xì)胞浸潤;培菲康組與模型組相比小腸結(jié)構(gòu)未見明顯改善。

2.4 小鼠小腸組織電鏡下超微結(jié)構(gòu)結(jié)果 在透射電鏡下觀察，正常組小鼠小腸上皮細(xì)胞的微絨毛排列整齊，上皮細(xì)胞頂端微絨毛下可見顯色清晰、染色濃聚的雙層膜樣的緊密連接蛋白。模型組小腸上皮細(xì)胞微絨毛下的緊密連接蛋白范圍變小，纖細(xì)色淡。中藥組小腸微絨毛下細(xì)胞間緊密連接顯色清晰，范圍較模型組大。培菲康組小腸微絨毛下細(xì)胞間緊密連接顯色較淡，范圍較小。見圖1。

2.5 小鼠小腸絨毛ZO-1免疫組織化學(xué)染色比較

免疫組織化學(xué)染色顯示ZO-1陽性細(xì)胞呈柱狀，陽性信號位于細(xì)胞膜下，呈棕黃色或褐色顆粒狀。正常組小鼠小腸絨毛上皮細(xì)胞胞膜下可見線性棕黃色陽性染色，表達充分，陽性細(xì)胞數(shù)占腸絨毛上皮細(xì)胞總數(shù)的50%以上，大多數(shù)細(xì)胞陽性信號著色清晰連續(xù)。模型組小鼠小腸絨毛上皮細(xì)胞ZO-1陽性染色明顯減少，著色較淡，不連貫。

小鼠小腸組織內(nèi)的ZO-1半定量評分顯示：正常組ZO-1的HIS（9.38±1.92）分，中藥組為（5.63±1.96）分，模型組為（3.00±0.76）分，在小腸絨毛上，模型組、中藥組、培菲康組小鼠ZO-1表達均明顯弱于正常組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），中藥組ZO-1表達顯著強于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.003），中藥組與培菲康組、模型組與培菲康組，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）（圖2）。

3 討論

既往研究表明，以TAA200 mg/kg腹腔注射建立急性肝衰竭小鼠模型，健脾解毒涼血方灌胃較模型組的存活率提高了37.5%，2組的存活率差異有統(tǒng)計學(xué)意義[6]。TAA誘導(dǎo)的肝衰竭小鼠模型有多臟器損傷，健脾解毒涼血方未能改善小鼠肝功能，可能是通過其他途徑提高肝衰竭小鼠的生存率。本研究進一步探討了健脾化濕解毒方對急性肝損傷小鼠的腸道屏障功能的影響。

腸黏膜上皮細(xì)胞的完整性及上皮細(xì)胞間的緊密連接在維護腸道屏障功能中發(fā)揮重要作用，通過研究ZO-1基因敲除的小鼠，發(fā)現(xiàn)ZO-1在緊密連接的形成過程中起關(guān)鍵作用[7];在實驗性多發(fā)傷和失血性休克的小鼠模型中，腸上皮細(xì)胞中ZO-1的表達顯著降低，被認(rèn)為與腸道通透性增加，細(xì)菌成分導(dǎo)致腸上皮細(xì)胞產(chǎn)生炎癥反應(yīng)和趨化介質(zhì)有關(guān)[8];腸上皮細(xì)胞的ZO-1的表達受到膜型基質(zhì)金屬蛋白酶-2及E-鈣黏蛋白的調(diào)節(jié)[9]。肝衰竭時腸道ZO-1的表達也是減少的，TNF-α使急性肝衰竭小鼠結(jié)腸緊密連接ZO-1mRNA及ZO-1蛋白的表達顯著降低[10]。酒精性肝損傷時腸道ZO-1，Claudin-1等蛋白表達下降，腸屏障損傷，毒素吸收增加，激活肝內(nèi)毒素-TLR4-核因子κB通路加重肝損傷[11-12]。非酒精性脂肪性肝炎患者腸ZO-1和Occludin的表達水平與轉(zhuǎn)氨酶水平呈負(fù)相關(guān)[13]。改善腸道屏障，可以同時改善腸道炎癥反應(yīng)、內(nèi)毒素血癥、肝臟脂肪變性和肝損傷[14-15]。多數(shù)情況下緊密連接功能的損傷伴隨ZO-1的表達減少，故ZO-1常被用于判斷腸緊密連接功能和腸機械屏障通透性的指標(biāo)。有許多研究報道了中藥、西藥通過增強腸黏膜ZO-1等緊密連接蛋白的表達，而發(fā)揮改善腸屏障功能的作用，同時能改善乙醇、代謝紊亂引起的肝損傷。枳椇子提取物顯著抑制乙醇引發(fā)的肝損傷大鼠TLR4通路及其下游炎癥介質(zhì)，并上調(diào)ZO-1和Occludin在腸道中的表達，通過調(diào)節(jié)腸-肝軸的異常發(fā)揮其保肝作用[16]。石斛多糖可上調(diào)ZO-1等緊密連接蛋白的表達，下調(diào)Caspase-3蛋白的表達，維持腸平衡，抑制LPS-TLR4-核因子κB信號通路的激活，減輕肝纖維化[17];山楂總黃酮可調(diào)控核因子κB P65介導(dǎo)的MLCK-MLC信號通路減輕TNF-α誘導(dǎo)的腸上皮屏障缺損[18];芒果仁提取物治療恢復(fù)ZO-1和Claudin-1的表達，從而防止高脂飲食引起的腸通透性增加[19]。復(fù)方銀杏葉上調(diào)緊密連接蛋白ZO-1的表達，降低慢性酒精性肝損傷大鼠的轉(zhuǎn)氨酶和二胺氧化酶水平[20]。體外實驗表明金銀花提取液與RAW 264.7細(xì)胞共培養(yǎng)，降低了ZO-1和Claudin-1的基因表達，通過調(diào)節(jié)腸道菌群分布和腸道通透性來改善肥胖和相關(guān)的代謝性內(nèi)毒素血癥[21]。黃精多糖增加了腸道ZO-1蛋白的表達，降低了高脂飲食喂養(yǎng)的大鼠血清內(nèi)毒素[22];口服姜黃素可促進腸道ZO-1和Claudin-1的表達，降低血漿內(nèi)毒素水平，改善高脂飲食引起的代謝紊亂[23]。龍眼多糖可以增加腸上皮Caco-2細(xì)胞中ZO-1緊密連接蛋白的表達[24]，廣藿香醇改善腸黏膜炎大鼠腸上皮細(xì)胞ZO-1、Claudin-1等蛋白表達，預(yù)防腸黏膜炎的發(fā)展[25]。逍遙散能有效改善抑郁大鼠結(jié)腸病理及超微結(jié)構(gòu)改變，上調(diào)結(jié)腸ZO-1、Occlutdin的表達，提高下丘腦和結(jié)腸黏膜5-HT水平[26]。梔子苷通過增加緊密連接蛋白ZO-1表達和減少炎癥反應(yīng)，氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡來防止缺氧/再灌注誘導(dǎo)的血腦屏障損傷[27];參麥注射液通過調(diào)節(jié)脂筏中Occludin的表達和運輸，維持局灶性腦缺血后的血腦屏障完整性[28]，中醫(yī)藥通過調(diào)節(jié)上皮細(xì)胞ZO-1的表達不僅影響著腸屏障功能，也可以防止血腦屏障的損傷。

本研究顯示，健脾解毒涼血方灌胃可以減輕小鼠肝組織的出血壞死，減輕小腸絨毛的水腫、炎癥細(xì)胞浸潤，與模型組比較，顯著改善了腸上皮細(xì)胞的ZO-1蛋白表達。本方的主要藥物成分具有改善腸功能的功效。大黃素可通過抑制缺氧誘導(dǎo)因子-1α和核因子κB信號通路來抑制內(nèi)毒素和缺氧誘導(dǎo)的腸上皮細(xì)胞屏障功能障礙，防止緊密連接屏障損傷和ZO-1表達的下降[29]。黃連素通過抑制缺氧誘導(dǎo)因子-1α介導(dǎo)肌球蛋白輕鏈磷酸化激酶、依賴肌球蛋白輕鏈磷酸化信號傳導(dǎo)通路，來抑制IFN-γ和TNF-γ誘導(dǎo)的腸上皮屏障功能障礙[30];同樣黃連素通過肌球蛋白輕鏈磷酸化依賴途徑改善重癥急性胰腺炎腸屏障功能障礙[31]。電鏡下模型組小腸上皮細(xì)胞微絨毛下的緊密連接蛋白范圍較正常組變小，纖細(xì)色淡。中藥組小腸微絨毛下細(xì)胞間緊密連接顯色清晰，范圍較模型組大。免疫組織化學(xué)染色也提示健脾化濕解毒方明顯改善TAA小鼠的小腸ZO-1的表達。

腸屏障功能障礙，腸源性內(nèi)毒素血癥是導(dǎo)致肝損傷加重的二次打擊的重要因素。腸功能障礙并非局限于腸腑之疾，也并非單純腑實證。診治需審證求因，追尋其發(fā)病原因。對于脾胃虛弱，升降失常的患者，顧護脾胃不足，通利周身氣機，恢復(fù)脾胃升降樞紐功能，有助于調(diào)節(jié)腸功能;同時兼顧疏肝柔肝，調(diào)暢氣機，對機體臟腑功能的糾正、內(nèi)環(huán)境的調(diào)節(jié)有益，最終從根本上使得其恢復(fù)生理狀態(tài)，以達培本復(fù)元之效。健脾解毒涼血方以黨參、黃芪健脾益氣，茵陳、梔子清熱利濕;大黃、黃芩、黃連清熱解毒;赤芍、生地黃涼血解毒，全方共奏顧護中焦，清利肝膽之功效。TAA誘導(dǎo)的急性肝衰竭模型是“肝-腸損傷”模型，健脾解毒涼血方治療TAA誘導(dǎo)的急性肝損傷小鼠，可減輕小腸絨毛水腫，對于腸上皮細(xì)胞的ZO-1蛋白表達有較強的保護作用，可能是其顧護中焦，保護腸黏膜的生物學(xué)基礎(chǔ)之一。

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（2019-05-16收稿 責(zé)任編輯：楊覺雄）