瑪咖-人參水煎液對(duì)小鼠免疫功能的影響

陳紅映 孫建輝 于澤玥

摘要 目的：探討瑪咖-人參水煎液對(duì)小鼠免疫功能的影響。方法：通過碳廓清試驗(yàn)、小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞試驗(yàn)、綿羊紅細(xì)胞誘導(dǎo)的小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)、ConA誘導(dǎo)的小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)（MTT法）、Jerne改良玻片法測(cè)定抗體生成細(xì)胞數(shù)試驗(yàn)、小鼠血清溶血素的測(cè)定，研究瑪咖-人參水煎液對(duì)小鼠免疫功能的影響。結(jié)果：與空白組比較，瑪咖-人參水煎液低、中、高劑量組均可明顯提高小鼠吞噬指數(shù)（P<0.05或P<0.01），瑪咖-人參水煎液低、中、高劑量組均可明顯提高小鼠巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞吞噬率（P<0.05或P<0.01）和吞噬指數(shù)（P<0.01），瑪咖-人參水煎液中、高劑量組可明顯提高小鼠足趾腫脹度（P<0.05），瑪咖-人參水煎液高劑量組可明顯提高小鼠溶血空斑數(shù)（P<0.01）。結(jié)論：瑪咖-人參水煎液能提高小鼠單核-巨噬細(xì)胞功能、細(xì)胞免疫功能和體液免疫功能。

關(guān)鍵詞 瑪咖;人參;配伍;水煎液;免疫;單核-巨噬細(xì)胞;細(xì)胞免疫;體液免疫

Abstract Objective：To investigate the effects of Maka Renshend Decoction on immune function of mice.Methods：Antibody production was measured by carbon clearance test，mouse peritoneal macrophage phagocytic chicken red blood cell test，sheep red blood cell-induced delayed-type allergy test in mice，ConA-induced mouse lymphocyte transformation test （MTT method），and Jerne modified slide method Cell number test，determination of mouse serum hemolysin，and the effect of Maka Renshen Decoction on the immune function.Results：Compared with the blank control group， the low， middle and high dose Maka Renshen Decoction groups could significantly increase the phagocytic index of mice （P<0.05 or P<0.01）. The low， medium and high dose groups of Maka Renshen Decoction can significantly increase the phagocytosis rate of mouse macrophages and chicken red blood cells （P<0.05 or P<0.01） and phagocytic index （P<0.01）. The medium and high-dose groups of Maka Renshen Decoction can significantly increase the swelling of the toes of mice （P<0.05）， and the high-dose group of Maka Renshen Decoction can obviously increase the number of hemolytic plaques in mice （P<0.01）.Conclusion：Maka Renshen Decoction can improve the function of monocyte-macrophage，cellular immunity and humoral immunity in mice.

Keywords Lepidium meyenii Walp; Radix Ginseng; Compatibility; Decoction; Immunity; Monocyte-macrophage; Cellular immune; Humoral immunity

中圖分類號(hào)：R285.5;R392.5文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.07.005

瑪咖（Lepidium meyenii Walper，Maca），又稱為“秘魯人參”[1]，屬于十字花科獨(dú)行菜屬一年生或兩年生植物[2]，是南美洲安第斯山地區(qū)常用的藥食兩用植物之一?，斂У臓I(yíng)養(yǎng)成分和次生代謝產(chǎn)物較為豐富，具有提高免疫力、改善性功能、調(diào)節(jié)性激素、抗疲勞、抗氧化、抗腫瘤、抗骨質(zhì)疏松、降血糖及神經(jīng)保護(hù)等功效[3-4]。近些年來，瑪咖產(chǎn)品風(fēng)靡全球市場(chǎng)，成為暢銷的保健食品之一。我國(guó)有利用瑪咖進(jìn)行開發(fā)利用的食品，如瑪咖飲品和瑪咖酒，也有與其他藥材配伍而成的保健品，如瑪咖枸杞膠囊、瑪咖黃芪西洋參片等[5-7]。研究表明，瑪咖性平微溫，味甘、辛，歸腎、肝、脾經(jīng)，具有補(bǔ)腎益精，強(qiáng)筋壯骨，疏肝解郁的功效[8]。藥理研究表明，瑪咖可增強(qiáng)小鼠體液免疫功能和單核-巨噬細(xì)胞功能[9]，增加免疫器官重量[10]，對(duì)大鼠機(jī)體免疫功能具有雙向調(diào)節(jié)作用[11]，增加能量代謝[12]。人參味甘、微苦，性微溫，入脾、肺、心、腎經(jīng)，有大補(bǔ)元?dú)?，?fù)脈固脫，補(bǔ)脾益肺，生津養(yǎng)血，安神益智等功效[13]。賈執(zhí)瑛等[14]研究表明，人參的有效成分（人參總皂苷、二醇皂苷、三醇皂苷和人參多糖）對(duì)增強(qiáng)免疫力有不同程度的功效，其中人參二醇皂苷和人參多糖增強(qiáng)免疫力作用較為明顯。

“正氣存內(nèi)，邪不可干?！碧岣呷梭w免疫力，可增強(qiáng)機(jī)體的抗病能力，提高人體正氣多以補(bǔ)脾健胃、補(bǔ)腎為主[15]。瑪咖和人參分別在2011、2012年被批準(zhǔn)為我國(guó)的新資源食品[16-17]。二者配伍，可協(xié)同增效，補(bǔ)腎益精、補(bǔ)脾益肺，本研究從細(xì)胞免疫、體液免疫和單核-巨噬細(xì)胞功能角度探討瑪咖、人參配伍后對(duì)機(jī)體免疫功能的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 KM種小鼠，SPF級(jí)，雌性，體質(zhì)量16～20 g，由北京華阜康生物科技股份有限公司提供，動(dòng)物許可證號(hào)SYXK（京）2017-0038，飼養(yǎng)于屏障環(huán)境。

1.1.2 藥物 瑪咖12 g、人參3 g，藥材粉碎成粗粉，加8倍量水，煎煮2次，1 h/次，過濾，濾液合并，濃縮，得棕色液體，冷藏保存。

1.1.3 試劑與儀器 1）試劑：印度墨汁（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：180320）;Na2CO3，（分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20180323）;姬姆氏色素（生物染色劑，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20151214）;甲醇（分析純，北京化工廠，批號(hào)：20171031）;Hb稀釋液（南京建成生物工程研究所，批號(hào)：20180905）;刀豆蛋白A（ConA，Sigma公司，美國(guó)，批號(hào)：006K8411）;RPMI1640（Gibco公司，美國(guó)，批號(hào)：1830908）;MTT（Amresco公司，美國(guó)，批號(hào)：2174c194）;異丙醇（分析純，北京化工廠，批號(hào)：20180524）。2）儀器：紫外可見分光光度計(jì)[島津企業(yè)管理（中國(guó)）有限公司，型號(hào)：UV2600];電子天平（常熟市雙杰測(cè)試儀器廠，型號(hào)：T1000）;電子天平（賽多利斯，型號(hào)：BS223S）;Thermo CO2培養(yǎng)箱（美國(guó)熱電公司，美國(guó)，型號(hào)：371型）;LEICA生物顯微鏡（上海萊卡顯微系統(tǒng)有限公司，型號(hào)：13395H2X）;游標(biāo)卡尺（桂林山牌Ⅲ型游標(biāo)卡尺，型號(hào)：游標(biāo)卡尺）;離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠，型號(hào)：TDL-5-A）;電熱恒溫水浴鍋（北京市長(zhǎng)風(fēng)儀器儀表公司，型號(hào)：SHH.W21.600C）;酶標(biāo)儀（美國(guó)伯騰儀器有限公司，美國(guó)，型號(hào)：Elx808）。

1.2 方法

1.2.1 給藥方法 人體推薦日用量為15 g，小鼠實(shí)驗(yàn)分別設(shè)人體推薦量的5倍、10倍、30倍，小鼠給藥劑量1.25、2.50、7.50 g/kg體質(zhì)量，設(shè)為低、中、高劑量。

1.2.2 小鼠碳廓清實(shí)驗(yàn)

選取KM種雌性小鼠48只，按體質(zhì)量隨機(jī)分為空白對(duì)照組和瑪咖-人參水煎液高、中、低劑量組，每組12只。各受試組給予相應(yīng)劑量瑪咖-人參水煎液，空白對(duì)照組給予等體積蒸餾水（10 mL/kg）灌胃，1次/d，連續(xù)42 d。指標(biāo)檢測(cè)：按照體質(zhì)量從小鼠尾靜脈注射稀釋后的印度墨汁（0.05 mL/10 g體質(zhì)量）。注入墨汁后的2 min、10 min，分別從小鼠內(nèi)眥靜脈叢取血20 μL，并將血液置于2.0 mL 0.1% Na2CO3溶液中。用UV2600紫外分光光度計(jì)在600 nm波長(zhǎng)處測(cè)光密度值（OD），以0.1% Na2CO3溶液作為空白對(duì)照。將小鼠處死，取肝臟和脾臟稱重。按公式計(jì)算吞噬指數(shù)（α），表示小鼠碳廓清的能力。式中OD1、OD2分別為2 min、10 min時(shí)采血所得血液的光密度值，t1、t2為注射印度墨汁后的取血時(shí)間。K=（lgOD1-lgOD2）/（t2-t1）;a=體質(zhì)量/（肝重+脾重）×K1/3。

1.2.3 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞實(shí)驗(yàn)（半體內(nèi)法）

分組、給藥同“1.2.2”項(xiàng)。指標(biāo)檢測(cè)：小鼠經(jīng)腹腔注射20%雞紅細(xì)胞懸液1 mL，30 min后，處死小鼠，腹腔注射生理鹽水2 mL，按揉小鼠腹部20次。取小鼠腹腔巨噬細(xì)胞洗液1 mL，分別滴在2片載玻片上，置37 ℃溫育30 min。生理鹽水漂洗，晾干，用1∶1丙酮甲醇溶液固定，以吉姆沙-磷酸緩沖液染色，并用蒸餾水漂洗，晾干。在油鏡條件下計(jì)數(shù)，每片計(jì)數(shù)100個(gè)巨噬細(xì)胞，按以下公式計(jì)算吞噬率和吞噬指數(shù)，得出的吞噬百分率按以下公式進(jìn)行數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換，X=sin-1P，P代表吞噬百分率，用小數(shù)表示。吞噬百分率（%）=吞噬雞紅細(xì)胞的巨噬細(xì)胞數(shù)/計(jì)數(shù)的巨噬細(xì)胞數(shù)×100%;吞噬指數(shù)=被吞噬的雞紅細(xì)胞總數(shù)/計(jì)數(shù)的巨噬細(xì)胞數(shù)。

1.2.4 遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)（DTH）實(shí)驗(yàn)（足跖增厚法） ?分組、給藥同“1.2.2”項(xiàng)。指標(biāo)檢測(cè)：取羊血，生理鹽水洗滌3次，小鼠腹腔注射0.2 mL 2% SRBC懸液，致敏后4 d，測(cè)量小鼠左后足跖部的厚度。在測(cè)量部位經(jīng)皮下注射20 μL 20% SRBC懸液，在注射后24 h測(cè)量小鼠的左后足跖部厚度。以上2次測(cè)量均在同一部位，且測(cè)量3次，取其平均值。以前后足跖厚度的差值來表示遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)的程度。

1.2.5 ConA誘導(dǎo)的小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)（MTT法）

分組、給藥同“1.2.2”項(xiàng)。指標(biāo)檢測(cè)：在無菌條件下，取小鼠脾臟，置于盛有無菌Hank′s液的平皿中，制成單個(gè)細(xì)胞懸液。篩網(wǎng)過濾制成脾細(xì)胞懸液。Hank′s液洗并離心，重復(fù)2次。將脾細(xì)胞懸浮于1 mL的培養(yǎng)液中，鏡檢計(jì)數(shù)，然后將細(xì)胞濃度調(diào)整為3×106個(gè)/mL。將脾細(xì)胞懸液分兩孔加入培養(yǎng)板中，每孔1.0 mL，一孔加入75 μL ConA液，另一孔作為對(duì)照，置CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h。培養(yǎng)結(jié)束4 h前，每孔吸去上清0.7 mL，并加入相同體積的RPMI1640培養(yǎng)液，同時(shí)加入MTT 50 μL/孔，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。每孔分別加入1 mL酸性異丙醇，溶解紫色結(jié)晶。然后用紫外分光光度計(jì)在570 nm波長(zhǎng)處測(cè)定。用加ConA孔的光密度值減去不加ConA孔的光密度值差值來表示淋巴細(xì)胞的增殖能力。

1.2.6 抗體生成細(xì)胞數(shù)的測(cè)定（Jerne改良玻片法）

分組、給藥同“1.2.2”項(xiàng)。指標(biāo)檢測(cè)：取羊血，用生理鹽水洗3次，小鼠腹腔注射0.2 mL 2% SRBC懸液。將SRBC免疫5 d后的小鼠處死，取脾臟，將脾臟磨碎，制成細(xì)胞懸液。離心后，分別用Hank′s液洗2遍，將細(xì)胞懸浮在8.0 mL Hank′s液中。瓊脂糖溶解后，與等量雙倍Hank′s液混合，用小試管分裝，每管加入0.5 mL，并向管內(nèi)加入50 μL 10% SRBC懸液和8 μL脾細(xì)胞懸液，迅速混勻，倒于具有瓊脂糖薄層的玻片上，待瓊脂凝固后，放入CO2培養(yǎng)箱中溫育1 h，在玻片架凹槽內(nèi)加入用SA緩沖液稀釋8倍的補(bǔ)體，繼續(xù)溫育1.5 h，然后計(jì)數(shù)溶血空斑數(shù)。用空斑數(shù)/全脾細(xì)胞來表示抗體生成細(xì)胞數(shù)。

1.2.7 半數(shù)溶血值（HC50）的測(cè)定

分組、給藥同“1.2.2”項(xiàng)。指標(biāo)檢測(cè)：取羊血，用生理鹽水洗3次，每只小鼠腹腔注射0.2 mL 2%SRBC懸液。5 d后，摘眼球取血，放置約1 h，離心，收集血清。取1.0 mL稀釋300倍的血清置試管內(nèi)，分別加入0.5 mL 10%SRBC懸液，1.0 mL稀釋8倍的補(bǔ)體。另設(shè)對(duì)照管，以SA緩沖液代替血清。37 ℃水浴15 min后，冰浴終止反應(yīng)。10 min，取l.0 mL上清，加3.0 mL Hb稀釋液。取0.25 mL 10%的SRBC懸液，加Hb稀釋液至4.0 mL于另一試管中，混勻，放置10 min后，在540 mm波長(zhǎng)處測(cè)定各管光密度值。以半數(shù)溶血值（HC50）表示溶血素的量，按以下公式計(jì)算：樣品半數(shù)溶血值=樣品光密度值/SRBC半數(shù)溶血時(shí)的光密度值×稀釋倍數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。采用方差分析，先進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，方差齊，再計(jì)算F值，若F值

2 結(jié)果

2.1 瑪咖-人參水煎液對(duì)小鼠吞噬指數(shù)的影響 與空白對(duì)照組比較，瑪咖-人參水煎液各劑量組均可明顯提高小鼠吞噬指數(shù)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或P<0.01）。見表1。

2.2 瑪咖-人參水煎液對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞吞噬率和吞噬指數(shù)的影響

與空白對(duì)照組比較，瑪咖-人參水煎液各劑量組均可明顯提高小鼠巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞吞噬率和吞噬指數(shù)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或P<0.01）。見表2、3。

2.3 瑪咖-人參水煎液對(duì)小鼠足跖腫脹度的影響

與空白對(duì)照組比較，瑪咖-人參水煎液中、高劑量可明顯提高小鼠足跖腫脹度，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表4。

2.4 瑪咖-人參水煎液對(duì)ConA誘導(dǎo)的小鼠淋巴細(xì)胞增殖的影響

與空白對(duì)照組比較，瑪咖-人參水煎液各劑量組對(duì)小鼠淋巴細(xì)胞增殖的影響均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表5。

2.5 瑪咖-人參水煎液對(duì)小鼠溶血空斑數(shù)的影響

與空白對(duì)照組比較，瑪咖-人參水煎液高劑量組可明顯提高小鼠溶血空斑數(shù)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。見表6。

2.6 瑪咖-人參水煎液對(duì)小鼠血清溶血素的影響

與空白對(duì)照組比較，瑪咖-人參水煎液各劑量組對(duì)小鼠半數(shù)溶血值的影響均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表7。

3 討論

免疫力低下，即中醫(yī)所講的“虛證”。中醫(yī)通過扶正、祛邪治療“虛證”。扶正，是指調(diào)動(dòng)機(jī)體抗病能力，增強(qiáng)免疫功能，從而提高機(jī)體的穩(wěn)定性。祛邪，是指調(diào)節(jié)機(jī)體免疫平衡和抑制免疫反應(yīng)，以增強(qiáng)機(jī)體的抗病能力[18]。正氣通過識(shí)別“自己”和“非己”成分，清除病原微生物、突變細(xì)胞、衰老細(xì)胞等，以保障機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定[19]。在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中，機(jī)體免疫分為特異性免疫和非特異性免疫。特異性免疫又分為細(xì)胞免疫和體液免疫。綿羊紅細(xì)胞誘導(dǎo)小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)、ConA誘導(dǎo)的小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)可用于評(píng)價(jià)細(xì)胞免疫功能，抗體生成細(xì)胞檢測(cè)、血清溶血素試驗(yàn)可用于評(píng)價(jià)體液免疫功能。小鼠碳廓清實(shí)驗(yàn)和小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞實(shí)驗(yàn)可用于評(píng)價(jià)單核-巨噬細(xì)胞功能（非特異性免疫）[20]。

本實(shí)驗(yàn)研究表明，經(jīng)口給予小鼠瑪咖-人參水煎液42 d后，與空白對(duì)照組比較，瑪咖-人參水煎液低、中、高劑量均可明顯提高小鼠的碳廓清能力（P<0.05或P<0.01），瑪咖-人參水煎液低、中、高劑量均可明顯提高小鼠巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞吞噬率和吞噬指數(shù)（P<0.05或P<0.01）;瑪咖-人參水煎液中、高劑量均可明顯提高小鼠足跖腫脹度（P<0.05）;瑪咖-人參水煎液高劑量可明顯提高小鼠抗體生成細(xì)胞數(shù)（P<0.01）。以上結(jié)果表明，瑪咖-人參水煎液能提高小鼠單核-巨噬細(xì)胞功能、細(xì)胞免疫功能和體液免疫功能，為瑪咖和人參配伍使用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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（2021-03-05收稿 責(zé)任編輯：徐穎）