番茄采后病菌鑒定及肉桂精油的抑菌分析

蔡錦玲，藍(lán)波妙，陳品品，姚 文，林 濤

(泉州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，福建 泉州 362200)

番茄(Solanum lycopersicum)是全球重要的蔬菜作物，營養(yǎng)價(jià)值和經(jīng)濟(jì)效益高，具有皮薄、肉嫩和汁多等特點(diǎn)，但其物理抗擠壓性差，采后呼吸作用強(qiáng)，在采后運(yùn)輸及儲(chǔ)藏中極易發(fā)生腐爛，致使其商品品質(zhì)下降和經(jīng)濟(jì)效益降低[1—3]。番茄采后腐爛受到生理性、物理性和病理性因素的綜合影響，其中由病原菌侵染產(chǎn)生的病理性病害是番茄采后腐爛的主要原因[4—7]，主要的病害(病原菌)包括：灰霉病(灰葡萄孢霉Botrytis cinerea，適宜溫度20～23 ℃，相對(duì)濕度90%以上)、黑霉病(黑霉菌鏈格孢Alternaria alternata，適宜溫度20～30 ℃，相對(duì)濕度90%以上)、青霉果腐病(擴(kuò)展青霉，Penicillium expansum，適宜溫度18～28 ℃，相對(duì)濕度95%～98%)、早疫病(茄鏈格孢菌Alternaria solani，適宜溫度26～28 ℃，相對(duì)濕度70%～80%)、晚疫病(致病疫霉菌，Phytophthora infestans，適宜溫度23～25 ℃，相對(duì)濕度95%～100%)和紅粉病(粉紅聚端孢霉菌Trichothecium roseum，適宜溫度25～30 ℃，相對(duì)濕度85%～95%)等[6—14]。腐爛后的番茄容易積累棒曲霉素和桔霉素等具有致癌作用的真菌毒素[15—16]。福建省泉州市地處亞熱帶地區(qū)，溫濕度較為適宜采后病原菌生長，導(dǎo)致番茄采后更容易感染各種病原菌。

肉桂(Cinnamomum cassia)系樟科樟屬植物，其活性成分具有抗癌、清熱和止痛等藥用功效，在食品保鮮和驅(qū)蟲殺菌方面也具有較大經(jīng)濟(jì)價(jià)值[17]。吳建挺等[18]研究表明，肉桂具有極強(qiáng)的抑菌作用，對(duì)供試的瓜果腐霉、終極腐霉、尖鐮孢菌等均表現(xiàn)出完全的抑制性。肉桂精油在大腸桿菌、黑曲霉、枯草芽孢桿菌和其他霉菌上也表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑菌活性[19—21]。目前國內(nèi)外有關(guān)肉桂精油的研究主要集中在不同產(chǎn)地、組織和提取方法的化學(xué)成分差異分析和抑菌活性[17]等方面，而在果蔬保鮮上的研究較少。隨著對(duì)綠色健康食品的要求不斷提高，近年來，具有較強(qiáng)抑菌活性和防腐性的肉桂精油被應(yīng)用于天然安全食品保鮮劑[22]。楊瑩等[23]報(bào)道，肉桂精油能夠保持救心菜(Coral dealbatus)質(zhì)量，使其貨架期延長。蔣夢?等[24]研究認(rèn)為，肉桂精油與抗菌肽 Iturin A的復(fù)合配方可延長櫻桃番茄(Solanum lycopersicum var.cerasiforme)的保鮮期。但目前尚未見肉桂精油對(duì)番茄采后病原菌抑菌效果的報(bào)道。本研究以番茄采后分離出的病原菌作為供試菌株，研究肉桂精油對(duì)番茄采后病原菌的抑菌效果，旨在為肉桂精油用于番茄采后病害控制和安全保鮮提供技術(shù)指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

櫻桃番茄千禧品種由泉州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所國家農(nóng)業(yè)科技園區(qū)種植，于果實(shí)商業(yè)成熟期采收，選擇外觀飽滿圓潤、表面無物理損傷和病害的果實(shí)；肉桂精油采購于多特瑞公司；馬鈴薯葡萄糖瓊脂(Potato Dextrose Agar，PDA)培養(yǎng)基和馬鈴薯葡萄糖肉湯(Potato Dextrose Broth，PDB)培養(yǎng)基購于杭州百思生物技術(shù)有限公司；真菌DNA提取試劑盒、2×Taq PCR Master Mix、MarkerⅡ、6×Loading Buffer(溴酚藍(lán))、瓊脂、核酸染料、吐溫 20等購于北京索萊寶科技公司；通用引物ITS-1和ITS-4由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

Agilent 7890B/5977 GCMSD氣質(zhì)聯(lián)用儀(安捷倫科技有限公司)；立式壓力蒸汽滅菌器HVE-50(廣州華粵行儀器有限公司)；SW-CJ-2D雙人單面垂直送風(fēng)凈化工作臺(tái)(蘇州博萊爾凈化設(shè)備有限公司)；生化培養(yǎng)箱 SPX-150BE[邦西儀器科技(上海)有限公司]。

1.2 病原菌分離純化及保存

挑選發(fā)病的番茄果實(shí)，將其表面用無菌水沖洗3次，在病斑交界處用接種針挑取菌落劃線接入PDA平板培養(yǎng)基上，4 d 后從平板上分離單菌落至新的培養(yǎng)基。繼續(xù)重復(fù)接種4至5代，待菌落表現(xiàn)均勻一致視為純化完成。將純化后的菌種接入PDA斜面培養(yǎng)基，長滿斜面后于4 ℃冰箱保存。3個(gè)月左右轉(zhuǎn)接一次。

1.3 病原菌rDNA-ITS擴(kuò)增及測序

病原菌經(jīng)液體培養(yǎng)7 d后，參照陳南泉等[25]和Fungal DNAkit真菌基因組DNA提取試劑盒說明書提取總 DNA，采用真菌通用引物 ITS-1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′) 和 ITS-4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。反應(yīng)體系及擴(kuò)增條件參考姜雨萌等[26]的方法。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng) 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后送生工生物工程(上海)股份公司測序。

1.4 抑菌效果

1.4.1 體外抑菌試驗(yàn)

參考陳倩茹[27]的方法，于PDA固體培養(yǎng)基斜板培養(yǎng)7 d后的菌中挑取適量孢子，于無菌水中形成濃度約105個(gè)·mL-1孢子懸浮液，取100 μL于PDA培養(yǎng)基上涂布均勻，封口膜密封后放入28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，形成病原菌平板。

將肉桂精油溶于0.2%乳化劑中，充分乳化后，加入培養(yǎng)基充分混勻，并設(shè)置7個(gè)濃度水平，分別為0.05、0.10、0.15、0.20、0.25和0.30 μL·mL-1。以0.2%吐溫溶液作為對(duì)照，將各處理倒平板，用無菌打孔器從病原菌平板取直徑6 mm菌斑，轉(zhuǎn)移至平板中央，封口密閉后于28 ℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，4 d后測量菌斑直徑，計(jì)算抑菌率[9]。每處理3次重復(fù)。

1.4.2 抑菌圈測定

取100 μL懸浮液于PDA培養(yǎng)基上涂布均勻，倒置，采用紙片擴(kuò)散法，將一片6 mm無菌濾紙放于培養(yǎng)皿蓋中央，用移液槍吸取3、6和9 μL肉桂精油滴于濾紙上，以無添加肉桂精油的無菌水為對(duì)照，封口后于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，于4 d后測量抑菌圈直徑。每處理3次重復(fù)。

1.5 GC-MS分析

色譜條件：色譜柱 HP-5MS (30 m × 250 μm ×0.25 μm)進(jìn)樣口溫度 230 ℃；載氣為高純氦氣(99.999%)。恒流模式：流速 0.8 mL·min-1；分流比50:1；進(jìn)樣量1.0 μL。程序升溫條件：初始溫度45 ℃，持續(xù) 3 min，速率 3 ℃·min-1升至 280 ℃，持續(xù) 5 min。

質(zhì)譜條件：電轟擊電離(EI)；電子能量 70 eV；離子源溫度 250 ℃；接口溫度 260 ℃；溶劑延遲4.0 min；掃描范圍50～600 m/z。

采集模式為SCAN掃描，各峰經(jīng)質(zhì)譜數(shù)據(jù)系統(tǒng)檢索及NIST 2014標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖數(shù)據(jù)庫比對(duì)，通過波峰面積歸一化法進(jìn)行定量分析，計(jì)算各成分的相對(duì)百分含量。

1.6 數(shù)據(jù)分析

測得 rDNA-ITS序列提交 GenBank，利用BLAST進(jìn)行同源性比對(duì)，提取同源性最高的相關(guān)物種rDNA-ITS序列，確定病原菌種類，并利用MEGA6軟件進(jìn)行多序列比對(duì)，構(gòu)建鄰接樹[11,25,28]。采用SPSS 16.0軟件對(duì)肉桂精油在不同病原菌上的抑菌濃度和抑菌圈進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用鄧肯多重比較分析差異顯著性(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌rDNA-ITS序列分析

2.1.1 基因組rDNA-ITS序列擴(kuò)增

對(duì)分離出不同形態(tài)的病原真菌進(jìn)行 rDNA-ITS擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳和紫外檢測。結(jié)果表明，不同菌株序列長度存在差異，片段長度500～900 bp (圖 1)。

圖1 病原菌的平板培養(yǎng)和rDNA-ITS PCR擴(kuò)增Fig.1 The colonial morphology and rDNA-ITS PCR amplification of the eight pathogenic fungi

2.1.2 基于ITS序列的聚類分析

通過多序列比對(duì)，構(gòu)建進(jìn)化樹，設(shè)置Bootstraps值為 1000，計(jì)算菌株所在進(jìn)化樹各分枝的置信度，按置信度超過95%以上歸為一類，可將8株病原真菌分為5類(圖2)，每類各選取一個(gè)菌株進(jìn)行BLAST對(duì)比及后續(xù)抑菌試驗(yàn)。BLAST比對(duì)結(jié)果表明，M001比對(duì)為枝孢屬芽枝狀枝孢菌(Cladosporium cladosporioides)，M007為青霉屬擴(kuò)展青霉菌(Penicillium expansum)，M008為鏈格孢屬鏈格孢菌(Alternaria brassicae)，M009為灰葡萄孢屬灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)和M012為聚端孢屬粉紅單端孢菌(Trichothecium roseum)。

圖2 8個(gè)病原菌的rDNA-ITS序列聚類分析Fig.2 Cluster analysis for rDNA-ITS domain sequences of the eight pathogenic fungi

2.2 肉桂精油對(duì)番茄5種病原菌的抑菌效果

2.2.1 最低抑菌濃度

比較肉桂精油對(duì)5種番茄病原菌(鏈格孢菌、灰葡萄孢菌、擴(kuò)展青霉菌、粉紅單端孢菌和芽枝狀枝孢菌)的抑菌效果。結(jié)果表明，不同濃度肉桂精油對(duì)不同病原菌具有不同程度的抑制作用，且伴隨著肉桂精油濃度的提高，抑制效果呈逐漸增強(qiáng)的趨勢(圖3)。當(dāng)肉桂精油濃度為0.15 μL·mL-1及以上時(shí)，其抑制率顯著高于 0.10 μL·mL-1及以下濃度處理(P<0.05)。肉桂精油濃度達(dá) 0.10 μL·mL-1時(shí)，對(duì)擴(kuò)展青霉菌的抑制率達(dá)70%以上；升至0.25 μL·mL-1時(shí)，對(duì)擴(kuò)展青霉菌的抑制率達(dá)100%，為該菌肉桂精油的最小抑菌濃度(MIC)；在0.15 μL·mL-1時(shí)，對(duì)粉紅單端孢菌的抑制率達(dá)100%；在0.2 μL·mL-1時(shí)，對(duì)鏈格孢菌的抑制率達(dá)100%，為該菌肉桂精油的最小抑菌濃度；在肉桂精油濃度為0.25 μL·mL-1時(shí)，對(duì)芽枝狀枝孢菌的抑制率達(dá)100%，且對(duì)灰葡萄孢菌的抑制率均達(dá)到 70%以上；當(dāng)濃度上升至 0.30 μL·mL-1時(shí)，對(duì)灰葡萄孢菌的抑制率達(dá)100%，為該菌的最小抑菌濃度。

圖3 不同濃度肉桂精油對(duì)番茄5種病原菌的體外抑菌效果Fig.3 The inhibition effects of different concentrations of cinnamon essential oil on 5 tomato pathogens in vitro

2.2.2 肉桂精油對(duì)不同病原菌的抑菌圈比較

利用抑菌圈測定供試菌種對(duì)精油抑菌效果的敏感程度。如圖4所示，隨著肉桂精油濃度的增加，敏感程度增加，表明抑菌效果逐漸增大。通過肉桂精油對(duì)不同菌種抑制程度的比較(表1)，抑制效果最佳的是粉紅單端孢菌；其次為灰葡萄孢菌、鏈格孢菌、擴(kuò)展青霉菌，抑制效果最弱的為芽枝狀枝孢菌；9 μL精油用量時(shí)抑菌圈未達(dá)50 mm。

表1 肉桂精油對(duì)番茄5種病原菌的抑菌圈Table 1 The inhibition zone of cinnamon essential oil on the five tomato pathogenic fungi

圖4 肉桂精油對(duì)番茄5種病原菌的抑菌圈Fig.4 The inhibition zone of cinnamon essential oil on the five tomato pathogenic fungi

2.3 肉桂精油GC-MS分析

分析肉桂精油成分，得到肉桂精油總離子流圖，共分離出53個(gè)峰(圖5)，確認(rèn)主要色譜峰，共分析鑒定出29種化合物，其相對(duì)百分含量占色譜總流出峰的92.56%(表2)。其中，芳香族醛類占58.90%、烯烴類占10.59%、酚醇類占13.56%、羧酸及酯類占7.08%，其他占2.43%。已鑒別出的29種化合物中，已報(bào)道具有抗菌作用的成分主要有反式肉桂醛(相對(duì)含量 58.34%，下同)；其次為丁香酚(8.76%)、芳樟醇(3.57%)。具有抗菌活性的成分占已鑒別出的化學(xué)成分總含量的76.35%。其他成分的功能主要有鎮(zhèn)痛和抗炎等作用。

圖5 肉桂精油化學(xué)成分總離子流圖Fig.5 Total ion flow map of cinnamon essential oil chemical composition

表2 肉桂精油化學(xué)成分Table 2 The chemical composition of cinnamon essential oil

(續(xù)表)

3 討論

番茄采后病害有灰霉病、黑霉病、青霉果腐病、早疫病、晚疫病和粉紅病等，分別由灰葡萄菌、黑霉菌鏈格孢、擴(kuò)展青霉菌、茄鏈格孢菌、致病疫霉菌和粉紅單端孢菌等引起[6—14]。本次實(shí)驗(yàn)以種植推廣面積大和經(jīng)濟(jì)價(jià)值高的櫻桃番茄品種千禧番茄為供試材料，利用 rDNA-ITS測序鑒定出灰葡萄菌、鏈格孢菌、擴(kuò)展青霉菌、芽枝狀枝孢菌和粉紅單端孢菌5種不同類型的病原菌，與前人研究結(jié)果基本一致。隨著 Genbank數(shù)據(jù)庫的不斷豐富，利用rDNA-ITS測序鑒定菌種是一種快速和經(jīng)濟(jì)有效的方式，可應(yīng)用于不同作物的病原菌快速鑒定。

利用GC-MS聯(lián)用儀對(duì)肉桂精油進(jìn)行成分分析，共鑒定出肉桂精油中的29種組分，分別為醚、烯、醇和酯類等化合物。其中抗菌成分占總成分的80%以上，包括反式肉桂醛(相對(duì)含量占 58.34%)、丁香酚(8.76%)、乙酸桂酯(5.91%)和芳樟醇(3.57%)等成分。肉桂精油對(duì)分離出的5種番茄病原菌株均有較好的抑菌效果，尤其對(duì)粉紅單端孢菌具有顯著的抑菌效果，最小抑菌濃度為0.15 μL·mL-1，抑菌圈可達(dá)70 mm以上；當(dāng)肉桂精油濃度達(dá)到0.2 μL·mL-1時(shí)，對(duì)5種番茄病原菌的抑制率均可達(dá)到70%以上。體外直接接觸抑菌試驗(yàn)結(jié)果顯示，肉桂精油對(duì)番茄病原菌抑制效果由強(qiáng)到弱依次為粉紅單端孢菌、鏈格孢菌、擴(kuò)展青霉菌、芽枝狀枝孢菌、灰葡萄孢菌。進(jìn)行抑菌圈實(shí)驗(yàn)時(shí)，9 μL肉桂精油對(duì)5種番茄病原菌的抑菌圈大小均可達(dá)40 mm以上，抑制效果最佳的是粉紅單端孢菌，對(duì)芽枝狀枝孢菌效果較差。肉桂精油的抑菌成分含量非常高，是其具有廣譜抑菌的基礎(chǔ)。

綜上，肉桂精油對(duì)多種番茄病原菌的抑制效果好，且在肉桂精油用量較低時(shí)也具有一定的抑制作用。因此，肉桂精油作為天然、安全的保鮮劑，可用于番茄采后病害控制，為番茄采后安全保鮮、延長其保鮮期提供技術(shù)指導(dǎo)。