富含嘌呤盒1 和干擾素調(diào)節(jié)因子4 在膿毒血癥患兒外周血中的表達(dá)及其與預(yù)后的關(guān)系

鄭燕冰，梁木華，郭錦均（東莞市濱海灣中心醫(yī)院兒科，廣東東莞 523900）

膿毒血癥指的是由嚴(yán)重創(chuàng)傷、全身炎性感染反應(yīng)、燒傷等導(dǎo)致的全身炎癥反應(yīng)綜合征，病情嚴(yán)重者可有多器官功能衰竭而導(dǎo)致患兒死亡。早期預(yù)測(cè)膿毒血癥患兒的病情嚴(yán)重程度，對(duì)改善患兒預(yù)后意義重大。富含嘌呤盒1（PU1）、干擾素調(diào)節(jié)因子4（IRF4）為免疫細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子，可通過(guò)參與輔助性T 細(xì)胞分化發(fā)育、增殖、調(diào)節(jié)細(xì)胞因子分泌等生物過(guò)程，糾正機(jī)體免疫紊亂，抑制炎性反應(yīng)[1]。本研究以我院收治的80例膿毒血癥患兒為研究對(duì)象，探討外周血PU1、IRF4的表達(dá)情況及臨床意義。

1 資料和方法

1.1 病例與分組

選取我院2019 年1 月-2020 年10 月收治的80 例膿毒血癥患兒為研究對(duì)象，納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合膿毒血癥臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)[2]，且為初次確診；(2)可按要求定期隨訪(fǎng)，臨床資料完整；(3)患兒及其家屬均簽署知情同意書(shū)。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)近期接受過(guò)手術(shù)治療者或有重大外傷史者；(2)近期存在感染性疾病者。根據(jù)急性生理與慢性健康-Ⅱ(APACHE-Ⅱ)評(píng)分將80 例患兒分為危重組（APACHE-Ⅱ評(píng)分≥15 分，38 例）、非危重組（APACHE-Ⅱ評(píng)分＜15 分，42 例）。選擇同期入院行健康體檢者40 例作為對(duì)照組。危重組男20 例，女18例；年齡5～13 歲，平均（9.15±1.02）歲。非危重組中男22 例，女20 例；年齡5～14 歲，平均（9.28±1.05）歲。對(duì)照組中男21 例，女19 例；年齡5～14 歲，平均（9.19±1.06）歲。3組一般資料差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

1.2 方法

1.2.1 外周血單個(gè)核細(xì)胞制備 患兒入院時(shí)，單次取患兒外周血10 mL，分離血細(xì)胞及血漿，血漿低溫保存?zhèn)溆?。EDTA 抗凝下，以密度梯度離心法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）。

1.2.2 PCR 步驟 (1)逆轉(zhuǎn)錄。采用Titan One Tube RT-PCR Kit試劑盒，按比例配置反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液，將RNA及反應(yīng)液于37 ℃反應(yīng)15 min，98 ℃酶失活5 min，結(jié)束反應(yīng)，產(chǎn)物4 ℃保存?zhèn)涫褂谩?2)熒光定量PCR。采用PowerUp?SYBR?Green 試劑盒，引物序列見(jiàn)表1。以熒光定量PCR 儀進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增程序如下：95 ℃10 s×1 次；(95 ℃5s，60 ℃20 s)×40 次。以β-actin Ct值標(biāo)準(zhǔn)化目的基因Ct值，2△t法計(jì)算樣品擴(kuò)增倍數(shù)。

表1 PCR引物序列

1.3 觀(guān)察指標(biāo)

(1)不同病情嚴(yán)重程度膿毒血癥患兒PU1、IRF4相對(duì)表達(dá)量。以β-actin作為內(nèi)參，采用熒光定量PCR檢測(cè)不同病情嚴(yán)重程度的膿毒血癥患兒PU1、IRF4的相對(duì)表達(dá)量。(2)不同預(yù)后膿毒血癥患兒序貫臟器衰竭(SOFA）評(píng)分、APACHE-Ⅱ評(píng)分比較。根據(jù)患兒隨訪(fǎng)1～6個(gè)月期間是否死亡，分為生存組（50例）與死亡組（30 例），采用國(guó)際通用SOFA 評(píng)分系統(tǒng)[3]進(jìn)行單個(gè)器官功能評(píng)價(jià)，分?jǐn)?shù)越高，預(yù)后越差。采用APACHE-Ⅱ評(píng)分[4]評(píng)價(jià)病情，總分71分，得分越高，病情越重，預(yù)后越差。(3)膿毒血癥患兒PU1、IRF4 相對(duì)表達(dá)量與SOFA評(píng)分相關(guān)性分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

統(tǒng)計(jì)軟件為SPSS 26.0，計(jì)量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，兩組間比較采用t檢驗(yàn)；采用Pearson 分析相關(guān)性。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同病情嚴(yán)重程度膿毒血癥患兒PU1、IRF4 相對(duì)表達(dá)量

與對(duì)照組比較，膿毒血癥的危重組、非危重組的PU1相對(duì)表達(dá)量明顯增高，IRF4相對(duì)表達(dá)量明顯降低（P＜0.01），以危重組更為顯著（P＜0.01），見(jiàn)表2。

表2 PU1、IRF4相對(duì)表達(dá)量 ()

表2 PU1、IRF4相對(duì)表達(dá)量 ()

與對(duì)照組比較：aP＜0.01；與非危重組比較：bP＜0.01

2.2 不同預(yù)后膿毒血癥患兒SOFA 評(píng)分、APACHE-Ⅱ評(píng)分

生存組SOFA 評(píng)分、APACHE-Ⅱ均低于死亡組（P＜0.01），見(jiàn)表3。

表3 不同預(yù)后患兒SOFA評(píng)分、APACHE-Ⅱ評(píng)分(，分)

表3 不同預(yù)后患兒SOFA評(píng)分、APACHE-Ⅱ評(píng)分(，分)

與死亡組比較：aP＜0.01

2.3 PU1、IRF4 表達(dá)量與SOFA 評(píng)分、APACHE-Ⅱ評(píng)分相關(guān)性分析

PU1表達(dá)量與SOFA評(píng)分、APACHE-Ⅱ評(píng)分呈正相關(guān)（r=0.525、0.518，P＜0.01）。IRF4表達(dá)量與SOFA評(píng)分、APACHE-Ⅱ評(píng)分呈負(fù)相關(guān)（r=-0.624、-0.605，P＜0.01）。

3 討論

膿毒血癥為導(dǎo)致危重病患兒死亡的主要原因之一。在膿毒血癥早期，機(jī)體固有免疫亢進(jìn)引起炎癥因子呈瀑布式反應(yīng)，機(jī)體產(chǎn)生大量血管加壓素、皮質(zhì)醇等物質(zhì)[5]。最大程度降低炎癥因子瀑布產(chǎn)生為膿毒血癥治療的重要手段，但目前對(duì)炎癥因子的抗炎治療效果仍不甚理想。加強(qiáng)對(duì)膿毒血癥患兒的監(jiān)視，盡早干預(yù)、盡早給予針對(duì)性治療，利于改善患兒預(yù)后。故尋找評(píng)估膿毒血癥病情嚴(yán)重程度及預(yù)后的適宜指標(biāo)，成為臨床研究的熱點(diǎn)問(wèn)題之一。既往臨床常用的評(píng)估膿毒血癥病情嚴(yán)重程度及預(yù)后的指標(biāo)包括APACHE-Ⅱ評(píng)分、CRP、IL-6等[6]，但這些指標(biāo)評(píng)估膿毒血癥病情嚴(yán)重程度特異性不高，且無(wú)法對(duì)預(yù)后進(jìn)行評(píng)估。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，PU1、IRF4 等轉(zhuǎn)錄因子與膿毒血癥患兒的病情進(jìn)展的關(guān)系逐步被揭示。

PU1 為E-twenty six 家族（ETS 家族）的轉(zhuǎn)錄因子，在B淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、肥大細(xì)胞、原始紅細(xì)胞等造血細(xì)胞中表達(dá)。為T(mén)h1-derived 巨噬細(xì)胞的主要受體的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，可增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬、殺傷功能，還可刺激TNF-α、IL-1β 的產(chǎn)生，發(fā)揮促進(jìn)前體T 細(xì)胞分化發(fā)育，維持成熟T 細(xì)胞功能[7]，參與固有免疫及適應(yīng)性免疫調(diào)節(jié)等多種作用。IRF4 為IRF家族成員之一，既往也被稱(chēng)為PU1結(jié)合蛋白，在T細(xì)胞、B 細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞中表達(dá)[8]。在T 細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)中，IRF4 作為非特異性轉(zhuǎn)錄因子，參與Th2、Th9、Th17、Treg細(xì)胞分化發(fā)育調(diào)節(jié)[9]。

本研究結(jié)果表明，與對(duì)照組比較，膿毒血癥的危重組、非危重組的PU1 相對(duì)表達(dá)量明顯增高，以危重組更為顯著（P＜0.01），說(shuō)明PU1在膿毒血癥患兒中呈高表達(dá)，且隨著病情的加重，表達(dá)量升高。與對(duì)照組比較，膿毒血癥的危重組、非危重組的IRF4 相對(duì)表達(dá)量明顯降低（P＜0.01），以危重組更為顯著（P＜0.01），說(shuō)明IRF4 在膿毒血癥患兒中呈低表達(dá)，且隨著病情的加重，IRF4 表達(dá)量進(jìn)一步下降。這與Gerlach 等[10]的研究中，PU1 既往被認(rèn)為通過(guò)促進(jìn)Th9 細(xì)胞分化發(fā)育，促進(jìn)IL-9 釋放參與炎癥反應(yīng)的報(bào)道結(jié)論一致。SOFA 評(píng)分、APACHE-Ⅱ評(píng)分均為評(píng)價(jià)疾病預(yù)后的常用量表[11-12]。本研究中分別以這兩個(gè)量表評(píng)估生存組與死亡組的預(yù)后，結(jié)果表明，生存組SOFA 評(píng)分、APACHE-Ⅱ低于死亡組。PU1 表達(dá)量與SOFA 評(píng)分、APACHE-Ⅱ評(píng)分呈正相關(guān)，而IRF4 表達(dá)量與SOFA 評(píng)分、APACHE-Ⅱ評(píng)分呈負(fù)相關(guān)，進(jìn)一步說(shuō)明了PU1mRNA 表達(dá)水平上調(diào)、IRF4表達(dá)水平下調(diào)與疾病預(yù)后密切相關(guān)。